Summary
Mevcut protokol, dış zar veziküllerinin biyomühendisliğini, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere bir "Tak ve Göster" aşı platformu olarak tanımlamaktadır.
Abstract
Bakteri veya virüslerden elde edilen biyomimetik nanopartiküller, aşı araştırma ve geliştirmede büyük ilgi görmüştür. Dış zar vezikülleri (OMV'ler) esas olarak ortalama büyüme sırasında gram-negatif bakteriler tarafından salgılanır, nano boyutlu bir çap ve kendi kendine adjuvan aktivite ile aşı dağıtımı için ideal olabilir. OMV'ler proteinler, nükleik asitler ve küçük moleküller için çok yönlü bir dağıtım sistemi olarak işlev görmüştür. OMV'lerin biyolojik özelliklerinden tam olarak yararlanmak için, biyomühendislik ürünü Escherichia coli türevi OMV'ler bir taşıyıcı olarak ve SARS-CoV-2 reseptör bağlama alanı (RBD) bir "Tak ve Görüntüle" aşı platformu oluşturmak için bir antijen olarak kullanılmıştır. Streptococcus pyogenes'teki SpyCatcher (SC) ve SpyTag (ST) alanları, OMV'leri ve RBD'yi konjuge etmek için uygulandı. Sitolisin A (ClyA) geni, plazmid transfeksiyonundan sonra SC geni ile bir füzyon proteini olarak çevrildi ve OMV'lerin yüzeyinde reaktif bir bölge bıraktı. RBD-ST'yi gece boyunca geleneksel bir tampon sisteminde karıştırdıktan sonra, OMV'ler ve RBD arasında kovalent bağlanma oluştu. Böylece çok değerli gösteren bir OMV aşısı elde edildi. OMV'lerin aşı platformu, çeşitli antijenlerle değiştirilerek, çeşitli heterojenleri verimli bir şekilde görüntüleyebilir ve böylece bulaşıcı hastalık salgınlarını potansiyel olarak hızlı bir şekilde önleyebilir. Bu protokol, üretim, saflaştırma, biyokonjugasyon ve karakterizasyon dahil olmak üzere OMV aşı platformunu oluşturmak için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.
Introduction
Potansiyel bir aşı platformu olarak, dış zar vezikülleri (OMV'ler) son yıllarda giderek daha fazla dikkat çekmektedir 1,2. Esas olarak gram-negatif bakteri3 tarafından doğal olarak salgılanan OMV'ler, genellikle 20-300 nm4 boyutunda bir lipit çift katmanından oluşan küresel nano ölçekli parçacıklardır. OMV'ler, katı immün güçlendiriciler olarak hizmet veren bakteriyel antijenler ve patojenle ilişkili moleküler paternler (PAMP'ler) dahil olmak üzere çeşitli ebeveyn bakteriyel bileşenleri içerir5. Eşsiz bileşenlerinden, doğal vezikül yapısından ve büyük genetik mühendisliği modifikasyon alanlarından yararlanan OMV'ler, bakteriyel aşılar6, adjuvanlar7, kanser immünoterapi ilaçları8, ilaç dağıtım vektörleri9 ve anti-bakteriyel yapıştırıcılar10 dahil olmak üzere birçok biyomedikal alanda kullanılmak üzere geliştirilmiştir.
2020'den bu yana dünya çapında yayılan SARS-CoV-2 salgını, küresel topluma ağır bir zarar verdi. Spike proteinindeki (S proteini) reseptör bağlayıcı alan (RBD), insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2) ile bağlanabilir ve bu da virüsünhücre 11,12,13'e girmesine aracılık eder. Bu nedenle, RBD aşı keşfi için birincil hedef gibi görünmektedir14,15,16. Bununla birlikte, monomerik RBD zayıf immünojeniktir ve küçük moleküler ağırlığı bağışıklık sisteminin tanımasını zorlaştırır, bu nedenle adjuvanlara sıklıkla ihtiyaç duyulur17.
RBD'nin immünojenisitesini arttırmak için çok değerli RBD'ler gösteren OMV'ler inşa edildi. RBD'yi görüntülemek için OMV kullanan mevcut çalışmalar genellikle RBD'yi bakteri18'de ifade edilmek üzere OMV ile kaynaştırır. Bununla birlikte, RBD virüs kaynaklı bir proteindir ve prokaryotik ekspresyonun aktivitesini etkilemesi muhtemeldir. Bu sorunu çözmek için, Streptococcus pyogenes'ten türetilen SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) sistemi, geleneksel bir tampon sisteminde OMV ve RBD ile kovalent bir izopeptit oluşturmak için kullanıldı19. SC alanı, biyomühendislik ürünü Escherichia coli tarafından bir füzyon proteini olarak Cytolysin A (ClyA) ile eksprese edildi ve ST, HEK293F hücresel ekspresyon sistemi aracılığıyla RBD ile eksprese edildi. OMV-SC ve RBD-ST gece boyunca karıştırıldı ve inkübe edildi. Ultrasantrifüjleme veya boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırmadan sonra OPV-RBD elde edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plazmid yapımı
- Daha önce yayınlanan bir rapor20'yi takiben plazmid pThioHisA ClyA-SC'yi oluşturmak için BamH I ve Sal I bölgeleri arasındaki ampisilin dirençli bir pThioHisA-ClyA plazmidine DNA kodlama SpyCatcher dizisini (Ek Dosya 1) yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Sentezlenmiş SpyTag-RBD-Histag füzyon genini (Ek Dosya 1), daha önce yayınlanmış bir rapor19'u takiben plazmid pcDNA3.1 RBD-ST'yi oluşturmak için BamH I ve EcoR I siteleri arasında bir pcDNA3.1 plazmidine (bakınız Malzeme Tablosu) bağlayın.
2. OMV-SC hazırlığı
- Aşağıdaki adımları izleyerek ClyA-SC dönüşümünü gerçekleştirin.
- 50 μL BL21 yetkin gerinimine 5 μL pThioHisA ClyA-SC plazmid çözeltisi (50 ng / μL) ekleyin, hafifçe üfleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde soğumaya bırakın.
- 90 s'lik çözeltiyi 42 ° C'deki su banyosuna yerleştirin ve ardından karıştırılmış çözeltiyi hemen 3 dakika boyunca buz üzerine koyun.
- Bakteriyel süspansiyona 500 μL LB ortamı ekleyin ve karıştırdıktan sonra 1 saat boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de kültür ekleyin.
- Ampisilin (100 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ve kültür içeren bir LB agar plakasına dönüşümü 37 ° C'de gece boyunca plakalayın.
NOT: Sonraki deneylerde, ampisilin ortamda aynı konsantrasyonda tutuldu. Aksi takdirde, bu bakterilerde plazmid kaybına neden olabilir.
- OMV-SC üretimi için aşağıdaki adımları uygulayın.
- Tek bir koloniyi, plakadan (adım 2.1.4.) 20 mL LB (ampisilin dirençli) ortama ve kültürden gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de izole edin.
- Bakteriyel çözeltiyi (adım 2.2.1'den itibaren.) 2 L ortama, 220 rpm'de kültüre, logaritmik büyüme aşamasına kadar 5 saat boyunca 37 ° C'ye (OD600nm, 0.6 ila 0.8 arasındadır) aşılayın.
- Bakteriyel çözeltinin 600 nm'sindeki OD 0.6-0.8'e ulaştığında, bakteriyel çözeltinin son konsantrasyonunu 0.5 mM yapmak için izopropil beta-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve daha sonra 25 ° C'de 220 rpm'de gece boyunca kültürleyin.
- OMV-SC saflaştırma işlemini gerçekleştirin.
- Bakteriyel çözeltiyi 30 dakika boyunca 4 °C'de 7.000 x g'de santrifüj edin.
- Süpernatantı 0,22 μm membran filtre ile filtreleyin, ardından 100 kD ultrafiltrasyon membranı veya içi boş fiber kolon kullanarak konsantre edin (bkz.
- Konsantreyi 0,22 μm'lik bir membran filtreden süzün, ardından ultrasantrifüj kullanarak 2 saat boyunca 4 °C'de 150.000 x g'de santrifüj yapın (bkz.
- Yağışı PBS ile yeniden askıya alın ve -80 ° C'de saklayın. Çözelti -80 ° C'de uzun süreli stabiliteyi koruyabilir.
3. RBD-ST hazırlığı
- Aşağıdaki adımları izleyerek RBD-ST transfeksiyonu gerçekleştirin.
- Uygun bir ökaryotik ekspresyon sistemi (örneğin, HEK293F) seçin ve iyileşmeden sonra hücreleri 37 ° C'de 130 rpm'de gece boyunca kültürleyin.
- Otomatik hücre sayacına 20 μL HEK293F hücre çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), hücre sayısını kaydedin, konsantrasyonu 1 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın ve ardından hücreleri 4 saat boyunca 37 ° C'de 130 rpm'de kültürleyin.
- RBD-ST plazmidini 0,22 μm membran filtreden filtreleyin ve son hacim 10 mL olana kadar hücre kültürü ortamına 300 μg plazmid ekleyin (bkz. 10 s sallayın.
- PEI'yi (1 mg/mL, bakınız Malzeme Tablosu) su banyosunda 65 °C'ye ısıtın, 0,7 mL PEI'yi 9,3 mL hücre kültürü ortamı ile karıştırın ve 10 sn boyunca aralıklı olarak çalkalayın.
NOT: Solüsyonu kuvvetlice sallamayın. Aksi takdirde, ortaya çıkan kabarcıklar transfeksiyon verimliliğini etkileyebilir. - PEI çözeltisine plazmid çözeltisi ekleyin, karışımı 10 s boyunca aralıklı olarak çalkalayın ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Karışımı 280 mL hücre kültürü ortamına ve 5 gün boyunca 37 ° C'de 130 rpm'de kültüre ekleyin.
- RBD-ST saflaştırma işlemini gerçekleştirin.
- Hücreleri 20 dakika boyunca 25 ° C'de 6.000 x g'da santrifüj edin ve süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın.
- Sütunu 2 mL Ni-NTA agaroz ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3x PBS ile 3 kat yıkayın.
- 20 mM'lik son konsantrasyonu yapmak için hücre süpernatanına imidazol ekleyin (bkz.
- Yıkama için 20 mM imidazol içeren 3 sütun hacmi (CV) PBS ekleyin ve yıkama fraksiyonunu toplayın.
- Düşük ila yüksek konsantrasyonlarda (örneğin, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M) imidazol içeren 3 CV PBS ile gradyan elütü; Her konsantrasyon için 2x elüt.
- Farklı konsantrasyon gradyanlarındaki RBD-ST'yi tanımlamak için SDS-PAGE21'i kullanın.
4. OMV-RBD biyokonjugasyon ve saflaştırma
- BCA yöntemi ile protein konsantrasyonunu belirleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
- Standart BSA protein çözeltisini 2 mg/mL'den 0,0625 mg/mL'ye kadar seri olarak seyreltin, saflaştırılmış OMV-SC ve RBD-ST 10x'i seyreltin, ardından BCA çalışma çözeltileri A ve B'yi (tahlil kitinde sağlanan) 50:1 (v/v) oranında karıştırın.
- Seyreltilmiş protein çözeltisi (25 μL / kuyu) ekleyin ve BCA çalışma çözeltisi (200 μL / kuyu) ile karıştırın; 30 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçkaya yatırın.
- Her bir kuyucuğun 562 nm'sinde absorbansı (OD) ölçün ve standart eğri22'den protein konsantrasyonunu hesaplayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek OMV-SC ve RBD-ST'nin biyokonjugasyonunu gerçekleştirin.
- PBS'de OMV-SC ve RBD-ST'yi 40:1 (w/w) oranında karıştırın.
- Karışımı gece boyunca 4 ° C'de 15 rpm'de karıştırmak için dikey olarak döndürün.
NOT: Farklı antijenler farklı oranlarda reaksiyona girebilir. Antijenin özelliklerine bağlı olarak farklı reaksiyon oranları denenebilir.
- Reaksiyon verimliliğini doğrulayın.
- 10 μL OMV-SC, RBD-ST ve reaksiyon ürününü hazırlayın (adım 4.2.). 2,5 μL 5x yükleme tamponu ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın. Numuneleri jele (10 μL/kuyu) yükleyin. 20 dakika boyunca 60 V'ta elektroforez yapın ve durumu 1 saat boyunca 120 V olarak değiştirin.
- Proteini jelden PVDF batı lekeleme membranlarına (bakınız Malzeme Tablosu) 70 dakika boyunca 100 V'ta aktarın.
- Membranı %5 yağsız süt / TBST tozuna koyun ve 1 saat çalkalayın. Ardından, çalkalama ile yıkama başına 5 dakika boyunca TBST ile 3x yıkayın.
- Membranı% 0.1 His-Tag antikoru / TBST'ye koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 saat çalkalayın, ardından sallama ile yıkama başına 5 dakika boyunca TBST ile 3x yıkayın.
- Membranı% 0,02 anti-fare IgG1 antikoru (HRP ) / TBST'ye koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 40 dakika çalkalayın, ardından sallama ile yıkama başına 5 dakika boyunca TBST ile 3x yıkayın.
- Gelişmiş kemilüminesans çözeltisi ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve membranı açığa çıkarın.
- OMV-RBD'nin saflaştırılmasını gerçekleştirin.
- 1 mL reaksiyona giren OMV-RBD çözeltisini 10 mL'ye kadar seyreltin ve seyreltmeyi 2 saat boyunca 4 °C'de 150.000 x g'de santrifüj edin.
- Süpernatantı atmak için bir pipet kullanın ve kalıntıyı 10 mL PBS ile askıya alın. Süspansiyonu 2 saat boyunca 4 °C'de 150.000 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı atın ve kalıntıyı 1 mL PBS ile askıya alın.
NOT: Antijenin çözünürlüğü çok daha düşükse, aynı ayırma etkisi boyut dışlama kromatografisi19 ile elde edilebilir.
5. Karakterizasyon
- Dinamik ışık saçılımı (DLS) gerçekleştirin.
- Numuneleri 100 μg/mL konsantrasyonda seyreltin ve numune hücresine 1 mL numune ekleyin.
- "Ölçüm tipi" için "Boyut"u, "Numune malzemesi" için "Protein"i, "Dispersan" için "Su"yu, "Sıcaklık" için "25 °C"yi seçin ve ardından numuneleri yükleyip otomatik olarak ölçün23'ü seçin.
- İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak görüntüleri yakalayın.
- Numuneleri 100 μg/mL'ye kadar seyreltin. 200 mesh bakır ızgara alın, üzerine 20 μL numune ekleyin ve 10 dakika boyunca emilmesini sağlayın.
- Çözeltiyi fitillemek için filtre kağıdı kullanın, destek filmine 20 μL% 3 uranil asetat ekleyin ve 30 saniye boyunca lekeleyin.
- Uranil asetat fitilini çekin ve filmi oda sıcaklığında 1 saat boyunca doğal olarak kurutun.
- Numuneleri TEM sistemine yükleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 80 kV'ta görüntü yakalayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, OMV'leri bir aşı platformu olarak kullanmaya yönelik genel bir yaklaşım olabilir; sadece antijenlerin tipine göre uygun ekspresyon sistemlerini seçmek gerekir.
Şekil 2, uygulanabilir bir plazmid tasarım şeması sağlar. SC geni, esnek bir bağlayıcı aracılığıyla ClyA genine bağlanırken, ST, saflaştırma ve doğrulama için RBD geninin 5' terminaline bir His-tag geni ile bağlanır. Western blot, reaksiyonun artan OMV-SC ile kademeli olarak tamamlandığını göstermiştir (Şekil 3A). Ultrasantrifüjlemeden sonra, reaksiyona girmemiş RBD-ST'nin neredeyse tamamı süpernatantta kaldı. İkinci ultrasantrifüjleme ilk kez daha önemli bir avantaj sağlamadı (Şekil 3B).
Partikül boyutunun dağılımı DLS ile belirlenmiştir (Şekil 4). OMV-SC'nin Z-ortalama hidrodinamik çapı 133 nm, OMV-RBD için ise 152.6 nm idi (Tablo 1). Bu farklılıklar, RBD'nin yoğun görüntülemeden sonra OMV partikül boyutunu arttırmasından kaynaklanıyor olabilir. TEM sonuçları (Şekil 5) DLS sonuçları ile tutarlıdır. Görüntüler, OMV'lerin RBD'ye bağlı olsun ya da olmasın, her zaman standart bir küresel yapıya sahip olduğunu gösterdi. Bu, ekstraksiyon, reaksiyon ve saflaştırma koşullarının OMV'lerin biyolojik aktivitesini korumak için elverişli olduğunu gösterir.
Resim 1: OMV-RBD hazırlığının akış şeması. ClyA-SC plazmidi E.coli'ye dönüştürülürken, RBD-ST plazmidi HEK293F hücrelerine dönüştürüldü. Bir süre kültürlendikten sonra, OMV-SC ve RBD-ST izole edildi ve saflaştırıldı. Konvansiyonel tamponda biyokonjugasyon ve ultrasantrifüjleme sonrası OMV-RBD elde edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bu çalışmada kullanılan plazmid profilleri. (A) pThioHisA ClyA-SC plazmid. (B) pcDNA RBD-ST plazmid. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: OMV-RBD'nin western blot ile doğrulanması. (A) OMV-SC ve RBD-ST arasındaki reaksiyon oranının anti-6x HisTag ile araştırılması. M: moleküler ağırlık belirteci 1: OMV-SC; 2: RBD-ST; 3: OMV:RBD = 10:1 (w/w); 4: OMV:RBD = 20:1; 5: OMV:RBD = 40:1. (B) Anti-6x HisTag ile ultrasantrifüjleme verimliliğinin doğrulanması. M: moleküler ağırlık belirteci 1: OMV-SC; 2: OMV-RBD ön ultrasantrifüjleme; 3: RBD-ST; 4: süpernatant sonrası ilk ultrasantrifüjleme; 5: ilk ultrasantrifüjleme sonrası çökeltmek; 6: süpernatant sonrası ikinci ultrasantrifüjleme; 7: ikinci ultrasantrifüjleme sonrası çökeltin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: DLS ile ölçülen partikül boyutu dağılımı . (A) OMV-SC. (B) OMV-RBD. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: OMV'lerin TEM . (A) OMV-SC (200 μg/mL) ile görselleştirilmesi. (B) OMV-RBD (200 μg/mL). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek Adı | Sıcaklık (°C) | Z-Ave (d.nm) | Pdı |
| OMV-SC | 25 | 133 | 0.483 |
| OMV-RBD | 24.9 | 152.6 | 0.569 |
Tablo 1: DLS ile ölçülen parametreler.
Ek Dosya 1: Bu çalışmada kullanılan plazmid dizileri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir "Tak ve Görüntüle" nanopartikül aşı platformu oluşturmak için, SC-kaynaşmış ClyA, protein ekspresyonu24'teki avantajları nedeniyle rekombinant protein üretimi için en yaygın kullanılan modellerden biri olan BL21 (DE3) suşlarında ifade edildi, böylece bakteri çoğalması işlemi sırasında OMV'lerin yüzeyinde yeterli SC fragmanı gösterilecekti. Aynı zamanda, antijenler ve OMV'ler arasındaki kimyasal eşleşme için ST-kaynaşmış bir hedef antijen hazırlandı. Bu deneysel şemanın avantajları ve gelecekteki uygulama beklentileri temel olarak üç açıdan yansıtılmaktadır. İlk olarak, farklı antijenlerin ve biyolojik nanopartiküllerin "Tak ve Göster" sistemi gerçekleştirilir. Reaksiyon ve saflaştırma süreci hızlı ve basit olabilir, bu da acil bulaşıcı hastalıklar ve diğer senaryolar için aşı geliştirmede önemli avantajlara sahiptir. İkincisi, yüksek yoğunluklu antijen görüntüleme hedefine ulaşır ve düşük immünojenisiteye sahip bazı antijenler için aşı tasarım yöntemi sağlar. Üçüncüsü, OMV'lerin ve RBD'nin (antijenik protein) bireysel ekspresyonu, yüksek antijen aktivitesi sağlamak için faydalıdır, çünkü geleneksel prokaryotik ekspresyon sistemleri, protein kaybına ve yanlış katlanmaya yol açabilecek belirli kofaktörler, moleküler şaperonlar ve translasyonel modifikasyonlar gibi fonksiyonlardan yoksundur.
Plazmid yapımı sürecinde, ClyA, esas olarak ClyA'nın C-terminalinin gevşek namlu şeklindeki yapısı nedeniyle SC ile bağlantı kurmak için bir hedef olarak seçildi. Çalışmalar, hemoglobin proteaz (Hbp) ototransporterinin Streptococcus pnömonisi ve Mycobacterium tuberculosis 25,26'dan antijenler gösterebileceğini göstermiştir. Aksi takdirde, görüntülenecek antijen bir prokaryottan geliyorsa, antijenleri SC / ST konjugasyonu kullanmadan doğrudan ClyA'nın C-terminaline inşa etmek mümkündür. Bu yöntem, daha yüksek görüntüleme yoğunluğuna sahip OMV'lere neden olabilir, ancak antijenik proteinlerin doğru şekilde katlanmaması riski hala vardır. Hedef parçaya SC/ST yerleştirildiğinde esnek bir bağlayıcının tasarlanması ve kullanılması gerektiğine dikkat etmek önemlidir, bu da SC ve ST arasındaki reaksiyon verimliliğini artırmaya yardımcı olur. Burada kullanılan bağlayıcı dizisi GSGGSGGSGTG idi ve diğer esnek bağlayıcılar da seçilebilir.
Klik-kimya konjugasyonu için SC / ST sistemine ek olarak, Snooptag / Snoopcatcher ve Sortase A konjugasyonu da proteinler arasındaki kovalent konjugasyon için yaygın olarak kullanılmaktadır27,28. Aynı zamanda, aynı vektör29 üzerine birden fazla farklı bağlantı sisteminin sokulmasının veya birden fazla antijen19 için aynı bağlantı sisteminin kullanılmasının, aynı vektör üzerinde birden fazla heterolog antijenin gösterilmesi amacına ulaşabileceği ve daha sonra çok değerli veya çok fonksiyonlu aşıların hazırlanabileceği bildirilmiştir.
Yüksek sitotoksisite ve düşük verim, OMV'lerin aşı platformları olarak yaygın kullanımını sınırlamaktadır 4,30. LPS ile ilişkili bazı genler, OMV'lerin sitotoksisitesini azaltmak için ilgili literatür31,32,33'e göre, bu protokolde kullanılan suşta nakavt edilmiştir. Bu protokolde tanıtılan yöntemle bakteriyel çözeltinin her 1 L'sinden 1.18 mg OMV ekstrakte edilebilir. Verim hala genetiği değiştirilmiş bazı yüksek vezikül üreten suşlarınkinden daha düşüktür34. Gerekirse, yüksek basınçlı homojenizasyon, daha fazla OMV üretmek için bakteri zarının çimlenmesini de teşvik edebilir, bu da daha iyi verim elde edebilir ve aynı zamanda yoğunluğu gösterebilir35.
İndüksiyon koşulları, OMV'lerin yüzeyinde görüntülenen SC yoğunluğu için çok önemlidir. Hedef proteinin ekspresyonunu SDS-PAGE ile izledik ve daha sonra nispeten hafif olan ve daha fazla protein ifade eden indüksiyon durumunu eledik. Farklı proteinler farklı indüksiyon koşulları gerektirebilir ve indüksiyon koşullarındaki değişiklikler, OMV'lerin yüzeyinde görüntülenen SC yoğunluğunda farklılıklara yol açabilir. Deney koşulları değiştikten sonra antijen ve taşıyıcı oranının ayarlanarak en uygun reaksiyon oranının araştırılması önerilmektedir. Ek olarak, OMV-RBD'nin saflaştırılması SEM veya ultrasantrifüjleme ile sağlanabilir. Her iki yöntem de denendi; ultrasantrifüjleme daha uygundur ve ortaya çıkan OMV, SEM protokolüne benzer bir saflığa sahipti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı'nın Anahtar Programı tarafından desteklenmiştir (Hayır. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Projesi (No. 31670936, 82041045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
References
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A.
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
- Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
- Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
- Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
- Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
- Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
- Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
- Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
- Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
- Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
- Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
- Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
- Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
- Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
- Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
- Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
- Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
- Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
- Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
- Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
- van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
- Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
- Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
- Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
- Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
- Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
- Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).
