Het huidige protocol beschrijft de bio-engineering van buitenmembraanblaasjes als een “Plug-and-Display” vaccinplatform, inclusief productie, zuivering, bioconjugatie en karakterisering.
Biomimetische nanodeeltjes verkregen uit bacteriën of virussen hebben aanzienlijke belangstelling getrokken voor vaccinonderzoek en -ontwikkeling. Buitenmembraanblaasjes (OMV’s) worden voornamelijk uitgescheiden door gramnegatieve bacteriën tijdens de gemiddelde groei, met een nanodiameter en zelfadjuvante activiteit, wat ideaal kan zijn voor de levering van vaccins. OMV’s hebben gefunctioneerd als een veelzijdig afgiftesysteem voor eiwitten, nucleïnezuren en kleine moleculen. Om ten volle te profiteren van de biologische kenmerken van OMV’s, werden bio-technische Escherichia coli-afgeleide OMV’s gebruikt als drager en SARS-CoV-2 receptorbindingsdomein (RBD) als een antigeen om een “Plug-and-Display” vaccinplatform te bouwen. De SpyCatcher (SC) en SpyTag (ST) domeinen in Streptococcus pyogenes werden toegepast om OMV’s en RBD te conjugeren. Het Cytolysine A (ClyA) gen werd vertaald met het SC gen als een fusie-eiwit na plasmide transfectie, waardoor een reactieve plaats op het oppervlak van de OMV’s achterbleef. Na het ‘s nachts mengen van RBD-ST in een conventioneel buffersysteem werd een covalente binding gevormd tussen de OMV’s en RBD. Zo werd een multivalent omv-vaccin bereikt. Door te vervangen door diverse antigenen, kan het OMV-vaccinplatform efficiënt een verscheidenheid aan heterogene antigenen weergeven, waardoor epidemieën van infectieziekten mogelijk snel worden voorkomen. Dit protocol beschrijft een nauwkeurige methode voor het bouwen van het OMV-vaccinplatform, inclusief productie, zuivering, bioconjugatie en karakterisering.
Als potentieel vaccinplatform hebben buitenmembraanblaasjes (OMV’s) de afgelopen jaren steeds meer aandacht getrokken 1,2. OMV’s, voornamelijk van nature uitgescheiden door gramnegatieve bacteriën3, zijn bolvormige deeltjes op nanoschaal die bestaan uit een lipide bilayer, meestal in de grootte van 20-300 nm4. OMV’s bevatten verschillende ouderlijke bacteriële componenten, waaronder bacteriële antigenen en pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), die dienen als solide immuunpotentiators5. Profiterend van hun unieke componenten, natuurlijke blaasjesstructuur en geweldige genetische manipulatiemodificatielocaties, zijn OMV’s ontwikkeld voor gebruik op vele biomedische gebieden, waaronder bacteriële vaccins6, adjuvantia7, kankerimmunotherapiegeneesmiddelen8, medicijnafgiftevectoren9 en antibacteriële kleefstoffen10.
De SARS-CoV-2-pandemie, die zich sinds 2020 wereldwijd heeft verspreid, heeft een zware tol geëist van de wereldwijde samenleving. Het receptorbindende domein (RBD) in spike-eiwit (S-eiwit) kan binden met humaan angiotensine-converterend enzym 2 (ACE2), dat vervolgens de binnenkomst van het virus in de cel bemiddelt 11,12,13. RBD lijkt dus een belangrijk doelwit te zijn voor vaccinontdekking 14,15,16. Monomere RBD is echter slecht immunogeen en het kleine molecuulgewicht maakt het moeilijk voor het immuunsysteem om te herkennen, dus adjuvantia zijn vaak nodig17.
Om de immunogeniciteit van RBD te verhogen, werden OMV’s met polyvalente RBD’s geconstrueerd. Bestaande studies die OMV gebruiken om RBD weer te geven, fuseren RBD meestal met OMV om tot expressie te komen in bacteriën18. RBD is echter een van het virus afgeleid eiwit en prokaryote expressie heeft waarschijnlijk invloed op de activiteit ervan. Om dit probleem op te lossen, werd het SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) systeem, afgeleid van Streptococcus pyogenes, gebruikt om een covalent isopeptide met OMV en RBD te vormen in een conventioneel buffersysteem19. Het SC-domein werd uitgedrukt met Cytolysine A (ClyA) als een fusie-eiwit door bio-engineered Escherichia coli, en ST werd uitgedrukt met RBD via het HEK293F cellulaire expressiesysteem. OMV-SC en RBD-ST werden ‘s nachts gemengd en geïncubeerd. Na zuivering door ultracentrifugatie of grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) werd OMV-RBD verkregen.
Om een “Plug-and-Display” nanodeeltjesvaccinplatform te creëren, werd SC-gefuseerde ClyA uitgedrukt in BL21 (DE3) -stammen, een van de meest gebruikte modellen voor recombinante eiwitproductie vanwege de voordelen in eiwitexpressie24, zodat er voldoende SC-fragment op het oppervlak van de OMV’s zou worden weergegeven tijdens het proces van bacterieproliferatie. Tegelijkertijd werd een ST-gesmolten doelantigeen voorbereid voor de chemische koppeling tussen de antigenen en OMV’s. De voordelen van d…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Sleutelprogramma van de Chongqing Natural Science Foundation (Nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) en het Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 31670936, 82041045).
Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |