يصف البروتوكول الحالي الهندسة الحيوية للحويصلات الغشائية الخارجية بأنها منصة لقاح “التوصيل والعرض” ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.
اجتذبت الجسيمات النانوية المحاكية بيولوجيا التي تم الحصول عليها من البكتيريا أو الفيروسات اهتماما كبيرا بالبحث والتطوير في مجال اللقاحات. تفرز الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) بشكل أساسي بواسطة البكتيريا سالبة الجرام أثناء متوسط النمو ، بقطر نانوي ونشاط مساعد ذاتي ، والذي قد يكون مثاليا لتوصيل اللقاح. عملت OMVs كنظام توصيل متعدد الأوجه للبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الصغيرة. للاستفادة الكاملة من الخصائص البيولوجية ل OMVs ، تم استخدام OMVs المشتقة من الإشريكية القولونية المهندسة بيولوجيا كحامل ومجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2 (RBD) كمستضد لبناء منصة لقاح “التوصيل والعرض”. تم تطبيق نطاقات SpyCatcher (SC) و SpyTag (ST) في Streptococcus pyogenes على OMVs و RBD المرافقين. تمت ترجمة جين Cytolysin A (ClyA) مع جين SC كبروتين اندماج بعد نقل البلازميد ، تاركا موقعا تفاعليا على سطح OMVs. بعد خلط RBD-ST في نظام عازلة تقليدي بين عشية وضحاها ، تم تشكيل الربط التساهمي بين OMVs و RBD. وهكذا ، تم تحقيق لقاح OMV متعدد التكافؤ. من خلال الاستبدال بمستضدات متنوعة ، يمكن لمنصة لقاح OMVs عرض مجموعة متنوعة من المستضدات غير المتجانسة بكفاءة ، وبالتالي منع أوبئة الأمراض المعدية بسرعة. يصف هذا البروتوكول طريقة دقيقة لبناء منصة لقاح OMV ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.
كمنصة لقاح محتملة ، جذبت الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) المزيد والمزيد من الاهتمام في السنوات الأخيرة 1,2. OMVs ، التي تفرزها بشكل طبيعي البكتيريا سالبة الجرام3 ، هي جسيمات نانوية كروية تتكون من طبقة ثنائية دهنية ، عادة بحجم 20-300 نانومتر4. تحتوي OMVs على مكونات بكتيرية أبوية مختلفة ، بما في ذلك المستضدات البكتيرية والأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، والتي تعمل كمحفزات مناعية صلبة5. بالاستفادة من مكوناتها الفريدة ، وهيكل الحويصلة الطبيعية ، ومواقع تعديل الهندسة الوراثية الرائعة ، تم تطوير OMVs للاستخدام في العديد من المجالات الطبية الحيوية ، بما في ذلك اللقاحات البكتيرية6 ، والمواد المساعدة7 ، وأدوية العلاج المناعي للسرطان8 ، ونواقل توصيل الدواء9 ، والمواد اللاصقة المضادة للبكتيريا10.
تسبب جائحة SARS-CoV-2 ، الذي انتشر في جميع أنحاء العالم منذ عام 2020 ، في خسائر فادحة في المجتمع العالمي. يمكن أن يرتبط مجال ربط المستقبلات (RBD) في بروتين سبايك (بروتين S) بالإنزيم المحول للأنجيوتنسين البشري 2 (ACE2) ، والذي يتوسط بعد ذلك دخول الفيروس إلى الخلية11،12،13. وبالتالي ، يبدو أن RBD هو الهدف الرئيسي لاكتشاف اللقاح14،15،16. ومع ذلك ، فإن RBD الأحادي ضعيف المناعة ، ووزنه الجزيئي الصغير يجعل من الصعب على الجهاز المناعي التعرف عليه ، لذلك غالبا ما تكون المواد المساعدة مطلوبة17.
من أجل زيادة مناعة RBD ، تم إنشاء OMVs التي تعرض RBDs متعددة التكافؤ. عادة ما تدمج الدراسات الحالية التي تستخدم OMV لعرض RBD RBD مع OMV ليتم التعبير عنها في البكتيريا18. ومع ذلك ، فإن RBD هو بروتين مشتق من الفيروس ، ومن المرجح أن يؤثر التعبير بدائي النواة على نشاطه. لحل هذه المشكلة ، تم استخدام نظام SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) ، المشتق من Streptococcus pyogenes ، لتشكيل إيزوببتيد تساهمي مع OMV و RBD في نظام عازلة تقليدي19. تم التعبير عن مجال SC مع Cytolysin A (ClyA) كبروتين اندماج بواسطة الإشريكية القولونية المهندسة بيولوجيا ، وتم التعبير عن ST باستخدام RBD عبر نظام التعبير الخلوي HEK293F. تم خلط OMV-SC و RBD-ST وحضنهما بين عشية وضحاها. بعد التنقية عن طريق الطرد المركزي الفائق أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، تم الحصول على OMV-RBD.
لإنشاء منصة لقاح الجسيمات النانوية “التوصيل والعرض” ، تم التعبير عن ClyA المنصهر SC في سلالات BL21 (DE3) ، والتي تعد واحدة من أكثر النماذج استخداما لإنتاج البروتين المؤتلف بسبب مزاياها في التعبير البروتيني24 ، بحيث يكون هناك ما يكفي من شظايا SC المعروضة على سطح OMVs أثناء عملية انتشار ال?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الرئيسي لمؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ومشروع المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 31670936، 82041045).
Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |