Summary
本协议将外膜囊泡的生物工程描述为“即插即用”疫苗平台,包括生产、纯化、生物偶联和表征。
Abstract
从细菌或病毒中获得的仿生纳米颗粒引起了人们对疫苗研究和开发的极大兴趣。外膜囊泡(OMV)在平均生长过程中主要由革兰氏阴性菌分泌,具有纳米级直径和自佐活性,可能是疫苗递送的理想选择。OMV作为蛋白质、核酸和小分子的多方面递送系统发挥作用。为了充分利用OMV的生物学特性,利用生物工程大 肠杆菌衍生的OMV作为载体,以SARS-CoV-2受体结合域(RBD)为抗原,构建“即插即用”疫苗平台。 化脓性链球菌 中的SpyCatcher(SC)和SpyTag(ST)结构域用于偶联OMV和RBD。质粒转染后,溶细胞素A(ClyA)基因与SC基因一起翻译为融合蛋白,在OMV表面留下反应位点。在常规缓冲系统中将RBD-ST混合过夜后,OMV和RBD之间形成了共价结合。因此,实现了多价显示OMV疫苗。通过用多种抗原代替,OMVs疫苗平台可以有效地显示多种异质抗原,从而有可能快速预防传染病流行。该协议描述了构建OMV疫苗平台的精确方法,包括生产,纯化,生物偶联和表征。
Introduction
作为潜在的疫苗平台,外膜囊泡(OMV)近年来越来越受到关注1,2。OMV主要由革兰氏阴性菌3自然分泌,是由脂质双层组成的球形纳米级颗粒,通常大小为20-300纳米4。OMV含有各种亲本细菌成分,包括细菌抗原和病原体相关分子模式(PAMP),可作为固体免疫增强剂5。得益于其独特的成分、天然囊泡结构和出色的基因工程修饰位点,OMV已被开发用于许多生物医学领域,包括细菌疫苗6,佐剂7,癌症免疫治疗药物8,药物递送载体9和抗菌粘合剂10。
自2020年以来在全球蔓延的SARS-CoV-2大流行对全球社会造成了沉重打击。刺突蛋白(S蛋白)中的受体结合域(RBD)可以与人血管紧张素转换酶2(ACE2)结合,然后介导病毒进入细胞11,12,13。因此,RBD似乎是疫苗发现的主要目标14,15,16。然而,单体RBD的免疫原性较差,其小分子量使免疫系统难以识别,因此通常需要佐剂17。
为了提高RBD的免疫原性,构建了显示多价RBD的OMV。使用OMV显示RBD的现有研究通常将RBD与OMV融合以在细菌中表达18。然而,RBD是一种病毒来源的蛋白质,原核表达可能会影响其活性。为了解决这个问题,使用源自 化脓性链球菌的SpyTag(ST)/SpyCatcher(SC)系统在常规缓冲系统中与OMV和RBD形成共价同价肽19。SC结构域通过生物工程大 肠杆菌以溶细胞素A(ClyA)作为融合蛋白表达,ST通过HEK293F细胞表达系统与RBD表达。OMV-SC和RBD-ST混合并孵育过夜。经超速离心或体积排阻色谱(SEC)纯化后,得到OMV-RBD。
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Protocol
1. 质粒构建
- 将编码 SpyCatcher 序列(补充文件1)的DNA插入BamH I和Sal I位点之间的氨苄青霉素耐药pThioHisA-ClyA质粒(参见 材料表),以构建质粒pThioHisA ClyA-SC之前发表的报告20。
- 将合成的SpyTag-RBD-Histag融合基因(补充文件1)连接成BamH I和EcoR I位点之间的pcDNA3.1质粒(参见 材料表),以构建质粒pcDNA3.1 RBD-ST,根据先前发表的报告19。
2. OMV-SC制备
- 按照以下步骤执行 ClyA-SC 转换。
- 将 5 μL pThioHisA ClyA-SC 质粒溶液 (50 ng/μL) 加入 50 μL BL21 感受态菌株中,轻轻吹气,在冰上冷却 30 分钟。
- 将溶液置于42°C的水浴中90秒,然后立即将混合溶液放在冰上3分钟。
- 向细菌悬浮液中加入500μLLB培养基,混合后,在37°C下以220rpm培养1小时。
- 将所有转化物接种到含有氨苄青霉素(100μg/ mL,参见 材料表)的LB琼脂平板上,并在37°C下培养过夜。
注意:在随后的实验中,氨苄西林在培养基中保持相同的浓度。否则,这可能会导致细菌中的质粒丢失。
- 对于 OMV-SC 生产,请执行以下步骤。
- 从平板(步骤2.1.4)中分离单个菌落至20mL LB(氨苄西林耐药)培养基中,并在37°C下以220rpm培养过夜。
- 将细菌溶液(从步骤2.2.1)接种到2L培养基中,以220rpm,37°C培养5小时,直到对数生长阶段(OD600nm 在0.6至0.8之间)。
- 当细菌溶液600nm处的OD达到0.6-0.8时,加入异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,参见 材料表),使细菌溶液的最终浓度为0.5mM,然后在25°C下以220rpm培养过夜。
- 进行OMV-SC纯化。
- 将细菌溶液在4°C下以7,000× g 离心30分钟。
- 用0.22μm膜过滤器过滤上清液,然后使用100kD超滤膜或中空纤维柱将其浓缩(参见 材料表)。
- 通过0.22μm膜过滤器过滤浓缩物,然后使用超速离心机在4°C下以150,000× g 离心2小时(参见 材料表),并用移液管弃去上清液。
- 用PBS重悬沉淀并将其储存在-80°C。 该溶液可在−80°C下保持长期稳定性。
3. RBD-ST 制备
- 按照以下步骤进行RBD-ST转染。
- 选择合适的真核表达系统(例如,HEK293F),并在恢复后在37°C下以130rpm培养细胞过夜。
- 将20μLHEK293F细胞溶液加入自动细胞计数器中(参见 材料表),记录细胞数,将浓度调节至1 x 106 个细胞/ mL,然后将细胞在37°C下以130rpm培养4小时。
- 通过0.22μm膜过滤器过滤RBD-ST质粒,并将300μg质粒加入细胞培养基中(参见 材料表),直到最终体积为10mL;摇晃10秒。
- 在水浴中将PEI(1mg / mL,见 材料表)加热至65°C,将0.7mLPEI与9.3mL细胞培养基混合,并间歇摇动10秒。
注意:不要剧烈摇晃溶液。否则,产生的气泡可能会影响转染效率。 - 将质粒溶液加入PEI溶液中,间歇摇动混合物10秒,并在37°C下孵育15分钟。
- 将混合物加入280mL细胞培养基中,并在37°C下以130rpm培养5天。
- 进行RBD-ST纯化。
- 将细胞在25°C下以6,000× g 离心20分钟,并使用移液管收集上清液。
- 用 2 mL Ni-NTA 琼脂糖填充色谱柱(参见 材料表),并用 3x PBS 洗涤 3 次。
- 将咪唑(参见 材料表)加入细胞上清液中,使终浓度为20mM,并加载细胞上清液2x。
- 加入含有20mM咪唑的PBS的3柱体积(CV)进行洗涤,并收集洗涤级分。
- 用含有低至高浓度(例如,0.3 M、0.4 M、0.5 M)咪唑的 3 CV PBS 梯度洗脱;每种浓度洗脱2x。
- 使用 SDS-PAGE21 识别不同浓度梯度中的 RBD-ST。
4. OMV-RBD生物偶联纯化
- 通过BCA方法测定蛋白质浓度(见 材料表)。
- 将标准BSA蛋白溶液从2 mg / mL连续稀释至0.0625 mg / mL,稀释纯化的OMV-SC和RBD-ST 10x,然后以50:1(v / v)的比例混合BCA工作溶液A和B(在测定试剂盒中提供)。
- 加入稀释的蛋白质溶液(25μL/孔)并与BCA工作溶液(200μL/孔)混合;在37°C孵育30分钟。
- 测量每个孔的562nm处的吸光度(OD),并从标准曲线22计算蛋白质浓度。
- 按照以下步骤对OMV-SC和RBD-ST进行生物偶联。
- 在PBS中以40:1(w/w)的比例混合OMV-SC和RBD-ST。
- 垂直旋转以在4°C下以15rpm混合混合物过夜。
注意:不同的抗原可能以不同的比例发生反应。可以根据抗原的特性尝试不同的反应比例。
- 验证反应效率。
- 制备 10 μL OMV-SC、RBD-ST 和反应产物(步骤 4.2)。加入 2.5 μL 5x 上样缓冲液(参见 材料表),并将样品在 100 °C 下加热 5 分钟。将样品上样到凝胶中(10 μL/孔)。在60V下进行电泳20分钟,并将条件更改为120V1小时。
- 将蛋白质从凝胶转移到PVDF蛋白质印迹膜(参见 材料表)中,在100 V下70分钟。
- 将膜放入5%脱脂奶粉/ TBST中,摇晃1小时。然后,用TBST洗涤3次,每次摇动洗涤5分钟。
- 将膜放入0.1%His-Tag抗体/ TBST(参见 材料表)中并摇动1小时,然后用TBST洗涤3次,每次摇动洗涤5分钟。
- 将膜放入0.02%抗小鼠IgG1抗体(HRP)/ TBST(参见 材料表)中并摇动40分钟,然后用TBST洗涤3次,每次摇匀洗涤5分钟。
- 加入增强的化学发光溶液(见 材料表)并暴露膜。
- 进行OMV-RBD的纯化。
- 将1mL反应的OMV-RBD溶液稀释至10mL,并在4°C下以150,000× g 离心稀释液2小时。
- 使用移液管弃去上清液,并用 10 mL PBS 悬浮残留物。将悬浮液在4°C下以150,000× g 离心2小时。
- 弃去上清液并用 1 mL PBS 悬浮残留物。
注意:如果抗原的溶解度要低得多,则通过体积排阻色谱19可以实现相同的分离效果。
5. 表征
- 执行动态光散射 (DLS)。
- 将样品稀释至 100 μg/mL 浓度,然后将 1 mL 样品加入样品池中。
- 为“测量类型”选择“尺寸”,“蛋白质”为“样品材料”,“水”为“分散剂”,“25°C”为“温度”,然后加载样品并自动测量23。
- 使用透射电子显微镜 (TEM) 捕获图像。
- 将样品稀释至 100 μg/mL。取一个 200 目铜网格,向其中加入 20 μL 样品,并使其被吸收 10 分钟。
- 使用滤纸吸掉溶液,向支撑膜中加入 20 μL 3% 乙酸铀酰,染色 30 秒。
- 吸掉乙酸铀酰并在室温下自然干燥薄膜1小时。
- 将样品加载到TEM系统(参见 材料表)并在80 kV下捕获图像。
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Representative Results
该协议的流程图如图 1 所示。该协议可能是利用OMV作为疫苗平台的一般方法;只需要根据抗原的类型选择合适的表达系统。
图2提供了可行的质粒设计方案。SC基因通过柔性接头与ClyA基因连接,而ST通过His标签基因连接到RBD基因的5'末端进行纯化和验证。蛋白质印迹显示,随着OMV-SC的增加,反应逐渐完成(图3A)。超速离心后,几乎所有未反应的RBD-ST都保留在上清液中。与第一次相比,第二次超速离心没有提供进一步的显着优势(图3B)。
粒径的分布由DLS确定(图4)。OMV-SC的Z平均流体动力学直径为133 nm,而OMV-RBD的Z平均流体动力学直径为152.6 nm(表1)。这些差异可能是因为RBD在密集显示后增加了OMV粒径。TEM的结果(图5)与DLS结果一致。图像显示,无论是否连接到RBD,OMV始终具有标准的球形结构。这表明提取、反应和纯化条件有利于维持OMV的生物活性。
图1:OMV-RBD制备流程图。将ClyA-SC质粒转化为大肠杆菌,将RBD-ST质粒转染到HEK293F细胞中。经过一段时间的培养,OMV-SC和RBD-ST被分离和纯化。在常规缓冲液中生物偶联并超速离心后,得到OMV-RBD。请点击此处查看此图的大图。
图2:本研究中使用的质粒谱。 (A)pThioHisA ClyA-SC质粒。(二)PCDNA RBD-ST质粒。请点击此处查看此图的大图。
图3:通过蛋白质印迹验证OMV-RBD 。 (A)探索OMV-SC和RBD-ST与抗6x HisTag之间的反应比。M:分子量标记1:OMV-SC;2: RBD-ST;3: OMV:RBD = 10:1 (w/w);4: OMV:RBD = 20:1;5:OMV:RBD = 40:1。(B) 验证使用抗 6x HisTag 进行超速离心的效率。M:分子量标记1:OMV-SC;2:OMV-RBD预超速离心;3: RBD-ST;4:上清液后首次超速离心;5:沉淀后第一次超速离心;6:上清液后第二次超速离心;7:第二次超速离心后沉淀。 请点击此处查看此图的大图。
图4:通过DLS测量的粒度分布 。 (A)OMV-SC。(b) OMV-RBD。 请点击此处查看此图的大图。
图 5:通过 TEM 对 OMV 的可视化。 (A) OMV-SC (200 μg/mL)。(B) OMV-RBD(200微克/毫升)。 请点击此处查看此图的大图。
示例名称 | 温度(°C) | Z-Ave (d.nm) | 钝 |
OMV-SC | 25 | 133 | 0.483 |
OMV-RBD | 24.9 | 152.6 | 0.569 |
表 1:DLS 测量的参数。
补充文件1:本研究中使用的质粒序列。请点击此处下载此文件。
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Discussion
为了创建一个“即插即显示”的纳米颗粒疫苗平台,SC融合的ClyA在BL21(DE3)菌株中表达,BL21(DE3)菌株因其在蛋白质表达方面的优势而成为重组蛋白生产中使用最广泛的模型之一24,因此在细菌增殖过程中OMV表面会有足够的SC片段显示。同时,制备了ST融合的靶抗原,用于抗原与OMV之间的化学偶联。该实验方案的优势和未来应用前景主要体现在三个方面。首先,实现不同抗原和生物纳米颗粒的“即插即用”系统。反应和纯化过程可以快速直接,这在开发针对紧急传染病和其他场景的疫苗方面具有显着优势。其次,实现了高密度抗原显示的目标,为一些免疫原性低的抗原提供了疫苗设计方法。第三,OMV和RBD(抗原蛋白)的个体表达有利于确保高抗原活性,因为传统的原核表达系统缺乏特定辅因子、分子伴侣和翻译后修饰等功能,这可能导致蛋白质损失和错误折叠。
在质粒构建过程中,ClyA被选为与SC连接的靶标,主要是由于ClyA的C端松散的桶形结构。研究表明,血红蛋白酶(Hbp)自转运蛋白酶可以显示 来自肺炎链球菌 和 结核分枝杆菌25,26的抗原。否则,如果要显示的抗原来自原核生物,则可以在不使用SC / ST偶联的情况下将抗原直接构建到ClyA的C端中。这种方法可能会导致OMV具有更高的显示密度,但仍存在抗原蛋白无法正确折叠的风险。需要注意的是,当SC/ST插入目标片段时,需要设计和使用柔性接头,这有助于提高SC和ST之间的反应效率。这里使用的接头序列是GSGGSGGSGTG,也可以选择其他灵活的接头。
除了用于点击化学偶联的SC / ST系统外,Snooptag/Snoopcatcher和Sortase A偶联也常用于蛋白质27,28之间的共价偶联。同时,也有报道,在同一载体29 上引入多个不同的连接系统或对多个抗原19 使用相同的连接系统可以达到在同一载体上显示多个异源抗原的目的,然后可以制备多价或多功能疫苗。
高细胞毒性和低产量限制了OMV作为疫苗平台的广泛使用4,30。根据相关文献31,32,33,在本协议中使用的菌株中已经敲除了一些LPS相关基因,以降低OMV的细胞毒性。通过本协议中引入的方法,可以从每1L细菌溶液中提取1.18mg的OMV。产量仍低于一些转基因高囊泡产菌株34。如有必要,高压均质还可以促进细菌膜的萌发,产生更多的OMV,可以提高产量和显示密度的同时达到35。
感应条件对于OMV表面显示的SC密度至关重要。我们通过SDS-PAGE监测靶蛋白的表达,然后筛选出诱导条件,诱导条件相对温和,表达更多的蛋白质。不同的蛋白质可能需要不同的诱导条件,诱导条件的变化可能导致OMV表面显示的SC密度的差异。建议在实验条件改变后调整抗原和载体比,探索最合适的反应比。此外,OMV-RBD的纯化可以通过SEM或超速离心来实现。两种方法都尝试过;超速离心更方便,所得OMV的纯度与SEM方案相似。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了重庆市自然科学基金重点项目(No.cstc2020jcyj-zdxmX0027)和中国国家自然科学基金项目(第31670936号,82041045)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
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