Den nåværende protokollen beskriver bioengineering av ytre membranvesikler for å være en “Plug-and-Display” vaksineplattform, inkludert produksjon, rensing, biokonjugering og karakterisering.
Biomimetiske nanopartikler hentet fra bakterier eller virus har tiltrukket seg stor interesse for vaksineforskning og utvikling. Ytre membranvesikler (OMV) utskilles hovedsakelig av gramnegative bakterier under gjennomsnittlig vekst, med en nanostørrelsesdiameter og selvadjuvant aktivitet, noe som kan være ideelt for vaksinelevering. OMV-er har fungert som et mangefasettert leveringssystem for proteiner, nukleinsyrer og små molekyler. For å dra full nytte av de biologiske egenskapene til OMV-er, ble bioengineerte Escherichia coli-avledede OMV-er benyttet som bærer og SARS-CoV-2-reseptorbindende domene (RBD) som et antigen for å konstruere en “Plug-and-Display” vaksineplattform. Domenene SpyCatcher (SC) og SpyTag (ST) i Streptococcus pyogenes ble brukt på konjugerte OMVer og RBD. Cytolysin A (ClyA) -genet ble oversatt med SC-genet som et fusjonsprotein etter plasmidtransfeksjon, og etterlot et reaktivt sted på overflaten av OMVene. Etter blanding av RBD-ST i et konvensjonelt buffersystem over natten, ble det dannet kovalent binding mellom OMV-ene og RBD. Dermed ble en multivalent OMV-vaksine oppnådd. Ved å erstatte med forskjellige antigener, kan OMVs vaksineplattform effektivt vise en rekke heterogene antigener, og dermed potensielt raskt forhindre smittsomme sykdomsepidemier. Denne protokollen beskriver en presis metode for å konstruere OMV-vaksineplattformen, inkludert produksjon, rensing, biokonjugering og karakterisering.
Som en potensiell vaksineplattform har ytre membranvesikler (OMV) tiltrukket seg mer og mer oppmerksomhet de siste årene 1,2. OMV-er, hovedsakelig utskilt naturlig av gramnegative bakterier3, er sfæriske nanoskalapartikler sammensatt av et lipid-dobbeltlag, vanligvis i størrelsen 20-300 nm4. OMV-er inneholder forskjellige foreldrebakterielle komponenter, inkludert bakterielle antigener og patogenassosierte molekylære mønstre (PAMPs), som fungerer som faste immunpotensiatorer5. Ved å dra nytte av deres unike komponenter, naturlige vesikkelstruktur og gode genteknologiske modifikasjonssteder, har OMV-er blitt utviklet for bruk i mange biomedisinske felt, inkludert bakterielle vaksiner6, adjuvanser7, kreftimmunterapimedisiner8, legemiddelleveringsvektorer9 og antibakterielle lim10.
SARS-CoV-2-pandemien, som har spredt seg over hele verden siden 2020, har gått hardt utover det globale samfunnet. Det reseptorbindende domenet (RBD) i piggprotein (S-protein) kan binde seg til humant angiotensinkonverterende enzym 2 (ACE2), som deretter formidler virusets inntreden i cellen11,12,13. Dermed ser RBD ut til å være et hovedmål for vaksineoppdagelse14,15,16. Imidlertid er monomer RBD dårlig immunogen, og den lille molekylvekten gjør det vanskelig for immunsystemet å gjenkjenne, så adjuvanser er ofte nødvendig17.
For å øke immunogenisiteten til RBD ble OMV-er som viste polyvalente RBD-er konstruert. Eksisterende studier som bruker OMV for å vise RBD, smelter vanligvis RBD med OMV som skal uttrykkes i bakterier18. Imidlertid er RBD et virusavledet protein, og prokaryotisk uttrykk vil sannsynligvis påvirke aktiviteten. For å løse dette problemet ble SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) -systemet, avledet fra Streptococcus pyogenes, brukt til å danne et kovalent isopeptid med OMV og RBD i et konvensjonelt buffersystem19. SC-domenet ble uttrykt med Cytolysin A (ClyA) som et fusjonsprotein av bioengineered Escherichia coli, og ST ble uttrykt med RBD via HEK293F cellulære ekspresjonssystem. OMV-SC og RBD-ST ble blandet og inkubert over natten. Etter rensing ved ultrasentrifugering eller størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) BLE OMV-RBD oppnådd.
For å skape en “Plug-and-Display” nanopartikkelvaksineplattform ble SC-smeltet ClyA uttrykt i BL21 (DE3) stammer, som er en av de mest brukte modellene for rekombinant proteinproduksjon på grunn av fordelene i proteinuttrykk24, slik at det ville være nok SC-fragment som vises på overflaten av OMVene under prosessen med bakterieproliferasjon. Samtidig ble det fremstilt et ST-smeltet målantigen for den kjemiske koblingen mellom antigenene og OMV-ene. Denne eksperimentelle ordningens fordeler og…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av nøkkelprogrammet til Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) og Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 31670936, 82041045).
Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |