Detta protokoll beskriver biotekniken av yttre membranblåsor som en “Plug-and-Display” -vaccinplattform, inklusive produktion, rening, biokonjugering och karakterisering.
Biomimetiska nanopartiklar från bakterier eller virus har väckt stort intresse för forskning och utveckling av vaccin. Yttre membranblåsor (OMV) utsöndras huvudsakligen av gramnegativa bakterier under genomsnittlig tillväxt, med en diameter i nanostorlek och självadjuvansaktivitet, vilket kan vara idealiskt för vaccinleverans. OMV har fungerat som ett mångfacetterat leveranssystem för proteiner, nukleinsyror och små molekyler. För att dra full nytta av de biologiska egenskaperna hos OMV användes biotekniska Escherichia coli-härledda OMV som bärare och SARS-CoV-2-receptorbindande domän (RBD) som ett antigen för att konstruera en “Plug-and-Display” -vaccinplattform. Domänerna SpyCatcher (SC) och SpyTag (ST) i Streptococcus pyogenes användes för att konjugera OMV och RBD. Cytolysin A (ClyA) -genen översattes med SC-genen som ett fusionsprotein efter plasmidtransfektion och lämnade ett reaktivt ställe på ytan av OMV: erna. Efter blandning av RBD-ST i ett konventionellt buffertsystem över natten bildades kovalent bindning mellan OMV och RBD. Således uppnåddes ett multivalent visande OMV-vaccin. Genom att ersätta med olika antigener kan OMV-vaccinplattformen effektivt visa en mängd heterogena antigener och därigenom potentiellt snabbt förhindra infektionssjukdomsepidemier. Detta protokoll beskriver en exakt metod för att konstruera OMV-vaccinplattformen, inklusive produktion, rening, biokonjugering och karakterisering.
Som en potentiell vaccinplattform har yttre membranblåsor (OMV) väckt mer och mer uppmärksamhet de senaste åren 1,2. OMV, som huvudsakligen utsöndras naturligt av gramnegativa bakterier3, är sfäriska partiklar i nanoskala som består av ett lipid-dubbelskikt, vanligtvis i storleken 20-300 nm4. OMV innehåller olika bakteriella komponenter från föräldrar, inklusive bakteriella antigener och patogenassocierade molekylära mönster (PAMP), som fungerar som fasta immunpotentiatorer5. Genom att dra nytta av deras unika komponenter, naturliga vesikelstruktur och fantastiska gentekniska modifieringsställen har OMV utvecklats för användning inom många biomedicinska områden, inklusive bakterievacciner6, adjuvanser7, cancerimmunterapiläkemedel8, läkemedelsleveransvektorer9 och antibakteriella lim10.
SARS-CoV-2-pandemin, som har spridit sig över hela världen sedan 2020, har tagit hårt på det globala samhället. Den receptorbindande domänen (RBD) i spikprotein (S-protein) kan binda med humant angiotensinkonverterande enzym 2 (ACE2), som sedan förmedlar virusets inträde i cellen11,12,13. Således verkar RBD vara ett främsta mål för vaccinupptäckt14,15,16. Monomer RBD är dock dåligt immunogen, och dess lilla molekylvikt gör det svårt för immunsystemet att känna igen, så adjuvanser krävs ofta17.
För att öka immunogeniciteten hos RBD konstruerades OMV som visade polyvalenta RBD: er. Befintliga studier som använder OMV för att visa RBD förenar vanligtvis RBD med OMV för att uttryckas i bakterier18. RBD är emellertid ett virus-härledd protein, och prokaryot uttryck kommer sannolikt att påverka dess aktivitet. För att lösa detta problem användes SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) -systemet, härrörande från Streptococcus pyogenes, för att bilda en kovalent isopeptid med OMV och RBD i ett konventionellt buffertsystem19. SC-domänen uttrycktes med Cytolysin A (ClyA) som ett fusionsprotein av bioengineered Escherichia coli, och ST uttrycktes med RBD via HEK293F cellulärt uttryckssystem. OMV-SC och RBD-ST blandades och inkuberades över natten. Efter rening genom ultracentrifugering eller storleksuteslutningskromatografi (SEC) ERHÖLLS OMV-RBD.
För att skapa en “Plug-and-Display” nanopartikelvaccinplattform uttrycktes SC-smält ClyA i BL21 (DE3) stammar, som är en av de mest använda modellerna för rekombinant proteinproduktion på grund av dess fördelar i proteinuttryck24, så att det skulle finnas tillräckligt med SC-fragment som visas på ytan av OMV: erna under processen med bakteriespridning. Samtidigt framställdes ett ST-smält målantigen för den kemiska kopplingen mellan antigenerna och OMV. Fördelarna med detta experimen…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av nyckelprogrammet för Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) och Chinese National Natural Science Foundation Project (nr 31670936, 82041045).
Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |