Summary
El presente protocolo describe la bioingeniería de vesículas de membrana externa como una plataforma de vacunas "Plug-and-Display", que incluye producción, purificación, bioconjugación y caracterización.
Abstract
Las nanopartículas biomiméticas obtenidas de bacterias o virus han atraído un interés sustancial en la investigación y el desarrollo de vacunas. Las vesículas de membrana externa (OMV) son secretadas principalmente por bacterias gramnegativas durante el crecimiento promedio, con un diámetro de tamaño nanométrico y actividad autoadyuvante, que puede ser ideal para la administración de vacunas. Los OMV han funcionado como un sistema de administración multifacético de proteínas, ácidos nucleicos y moléculas pequeñas. Para aprovechar al máximo las características biológicas de los OMV, se utilizaron OMV derivados de Escherichia coli de bioingeniería como portador y el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 como antígeno para construir una plataforma de vacuna "Plug-and-Display". Los dominios SpyCatcher (SC) y SpyTag (ST) en Streptococcus pyogenes se aplicaron para conjugar OMV y RBD. El gen de la citolisina A (ClyA) se tradujo con el gen SC como una proteína de fusión después de la transfección de plásmidos, dejando un sitio reactivo en la superficie de los OMV. Después de mezclar RBD-ST en un sistema tampón convencional durante la noche, se formó una unión covalente entre los OMV y RBD. Por lo tanto, se logró una vacuna OMV de visualización multivalente. Al reemplazarla con diversos antígenos, la plataforma de vacunas OMV puede mostrar de manera eficiente una variedad de antígenos heterogéneos, lo que podría prevenir rápidamente las epidemias de enfermedades infecciosas. Este protocolo describe un método preciso para construir la plataforma de vacunas OMV, incluida la producción, purificación, bioconjugación y caracterización.
Introduction
Como plataforma potencial de vacunación, las vesículas de membrana externa (OMV) han atraído cada vez más atención en los últimos años 1,2. Los OMV, secretados principalmente naturalmente por bacterias gramnegativas3, son partículas esféricas a nanoescala compuestas por una bicapa lipídica, generalmente en el tamaño de 20-300 nm4. Los OMV contienen varios componentes bacterianos parentales, incluidos antígenos bacterianos y patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), que sirven como potenciadores inmunes sólidos5. Beneficiándose de sus componentes únicos, estructura natural de vesículas y excelentes sitios de modificación de ingeniería genética, los OMV se han desarrollado para su uso en muchos campos biomédicos, incluidas las vacunas bacterianas6, los adyuvantes7, los medicamentos de inmunoterapia contra el cáncer8, los vectores de administración de medicamentos9 y los adhesivos antibacterianos10.
La pandemia de SARS-CoV-2, que se ha extendido por todo el mundo desde 2020, ha tenido un alto costo en la sociedad mundial. El dominio de unión al receptor (RBD) en la proteína espiga (proteína S) puede unirse con la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (ACE2), que luego media la entrada del virus en la célula11,12,13. Por lo tanto, RBD parece ser un objetivo principal para el descubrimiento de vacunas14,15,16. Sin embargo, el RBD monomérico es poco inmunogénico, y su pequeño peso molecular dificulta el reconocimiento del sistema inmunitario, por lo que a menudo se requieren adyuvantes17.
Con el fin de aumentar la inmunogenicidad de RBD, se construyeron OMV que mostraban RBD polivalentes. Los estudios existentes que utilizan OMV para mostrar RBD generalmente fusionan RBD con OMV para ser expresado en bacterias18. Sin embargo, RBD es una proteína derivada del virus, y es probable que la expresión procariota afecte su actividad. Para resolver este problema, se utilizó el sistema SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), derivado de Streptococcus pyogenes, para formar un isopéptido covalente con OMV y RBD en un sistema tampón convencional19. El dominio SC se expresó con citolisina A (ClyA) como una proteína de fusión por Escherichia coli de bioingeniería, y ST se expresó con RBD a través del sistema de expresión celular HEK293F. OMV-SC y RBD-ST se mezclaron e incubaron durante la noche. Después de la purificación por ultracentrifugación o cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), SE OBTUVO OMV-RBD.
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Protocol
1. Construcción de plásmidos
- Inserte la secuencia SpyCatcher que codifica ADN (Archivo Suplementario 1) en un plásmido pThioHisA-ClyA resistente a la ampicilina (ver Tabla de materiales) entre los sitios BamH I y Sal I para construir el plásmido pThioHisA ClyA-SC siguiendo un informe previamente publicado20.
- Ligate el gen de fusión SpyTag-RBD-Histag sintetizado (Archivo Suplementario 1) en un plásmido pcDNA3.1 (ver Tabla de Materiales) entre los sitios BamH I y EcoR I para construir el plásmido pcDNA3.1 RBD-ST siguiendo un informe previamente publicado19.
2. Preparación OMV-SC
- Realice la transformación ClyA-SC siguiendo los pasos a continuación.
- Añadir 5 μL de solución plásmida pThioHisA ClyA-SC (50 ng/μL) a 50 μL de cepa competente BL21, soplar suavemente y dejar enfriar en hielo durante 30 min.
- Colocar la solución durante 90 s en el baño maría a 42 °C, y luego poner inmediatamente la solución mezclada en hielo durante 3 min.
- Añadir 500 μL de medio LB a la suspensión bacteriana y, después de mezclar, cultivar a 220 rpm a 37 °C durante 1 h.
- Colocar toda la transformación en una placa de agar LB que contenga ampicilina (100 μg/ml, ver Tabla de materiales) y cultivar durante la noche a 37 °C.
NOTA: En experimentos posteriores, la ampicilina se mantuvo en la misma concentración en el medio. Si no, esto puede causar pérdida de plásmidos en las bacterias.
- Para la producción OMV-SC, realice los pasos a continuación.
- Aislar una sola colonia de la placa (paso 2.1.4.) a 20 ml de medio LB (resistente a la ampicilina) y cultivar durante la noche a 220 rpm a 37 °C.
- Inocular la solución bacteriana (a partir de la etapa 2.2.1.) en un medio de 2 L, cultivar a 220 rpm, 37 °C durante 5 h hasta la fase de crecimiento logarítmico (el DO600nm está entre 0,6 y 0,8).
- Cuando el OD a 600 nm de la solución bacteriana alcance 0.6-0.8, agregue isopropil-D-tiogalactopiranosido (IPTG, ver Tabla de materiales) para que la concentración final de la solución bacteriana sea de 0.5 mM, y luego cultive durante la noche a 220 rpm a 25 ° C.
- Realizar la purificación OMV-SC.
- Centrifugar la solución bacteriana a 7.000 g a 4 °C durante 30 min.
- Filtrar el sobrenadante con un filtro de membrana de 0,22 μm, luego concentrarlo usando una membrana de ultrafiltración de 100 kD o una columna de fibra hueca (ver Tabla de materiales).
- Filtrar el concentrado a través de un filtro de membrana de 0,22 μm, luego centrifugarlo a 150.000 x g a 4 °C durante 2 h con una ultracentrífuga (ver Tabla de materiales) y desechar el sobrenadante con una pipeta.
- Resuspender la precipitación con PBS y almacenarla a −80 °C. La solución puede mantener la estabilidad a largo plazo a -80 °C.
3. Preparación RBD-ST
- Realice la transfección RBD-ST siguiendo los pasos a continuación.
- Seleccione un sistema de expresión eucariota apropiado (por ejemplo, HEK293F) y cultive las células durante la noche a 130 rpm a 37 °C después de la recuperación.
- Añadir 20 μL de solución celular HEK293F en el contador celular automatizado (ver Tabla de materiales), registrar el número de células, ajustar la concentración a 1 x 106 células/ml y, a continuación, cultivar las células a 130 rpm a 37 °C durante 4 h.
- Filtrar el plásmido RBD-ST a través de un filtro de membrana de 0,22 μm y añadir 300 μg de plásmidos en el medio de cultivo celular (ver Tabla de materiales) hasta que el volumen final sea de 10 ml; Agitar durante 10 s.
- Calentar la IPE (1 mg/ml, ver tabla de materiales) a 65 °C en el baño maría, mezclar 0,7 ml de IPE con 9,3 ml de medio de cultivo celular y agitar intermitentemente durante 10 s.
NOTA: No agite la solución vigorosamente. De lo contrario, las burbujas resultantes pueden afectar la eficiencia de la transfección. - Añadir solución plásmida a la solución de PEI, agitar la mezcla intermitentemente durante 10 s e incubarla a 37 °C durante 15 min.
- Añadir la mezcla a 280 ml de medio de cultivo celular y cultivar a 130 rpm a 37 °C durante 5 días.
- Realizar la purificación RBD-ST.
- Centrifugar las células a 6.000 x g a 25 °C durante 20 min y utilizar una pipeta para recoger el sobrenadante.
- Llene la columna con 2 ml de agarosa Ni-NTA (consulte la Tabla de materiales) y lávela 3 veces con 3 PBS.
- Agregue imidazol (consulte la Tabla de materiales) en el sobrenadante celular para hacer la concentración final de 20 mM, y cargue el sobrenadante celular 2x.
- Agregue 3 volúmenes de columna (CV) de PBS que contengan 20 mM de imidazol para el lavado y recoja la fracción de lavado.
- Eluido de gradiente con 3 CV de PBS que contiene concentraciones bajas a altas (por ejemplo, 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) de imidazol; Eluya 2x para cada concentración.
- Utilice SDS-PÁGINA21 para identificar el RBD-ST en diferentes gradientes de concentración.
4. Bioconjugación y purificación OMV-RBD
- Determinar la concentración de proteína por el método BCA (ver Tabla de materiales).
- Diluir en serie la solución estándar de proteína BSA de 2 mg/ml a 0,0625 mg/ml, diluir el OMV-SC purificado y RBD-ST 10x, luego mezclar las soluciones de trabajo BCA A y B (proporcionadas en el kit de ensayo) en una proporción de 50:1 (v/v).
- Añadir solución de proteína diluida (25 μL/pocillo) y mezclar con solución de trabajo BCA (200 μL/pocillo); incubar a 37 °C durante 30 min.
- Medir la absorbancia (OD) a 562 nm de cada pocillo y calcular la concentración de proteína a partir de la curva estándar22.
- Realice la bioconjugación de OMV-SC y RBD-ST siguiendo los pasos a continuación.
- Mezcle OMV-SC y RBD-ST en PBS en una proporción de 40:1 (w/w).
- Gire verticalmente para mezclar la mezcla durante la noche a 15 rpm a 4 °C.
NOTA: Diferentes antígenos pueden reaccionar en diferentes proporciones. Se podrían probar diferentes relaciones de reacción basadas en las características del antígeno.
- Verifique la eficiencia de la reacción.
- Preparar 10 μL de OMV-SC, RBD-ST y el producto de reacción (paso 4.2.). Añadir 2,5 μL de tampón de carga 5x (véase la Tabla de materiales) y calentar las muestras a 100 °C durante 5 min. Cargue las muestras en el gel (10 μL/pocillo). Realizar electroforesis a 60 V durante 20 min y cambiar la condición a 120 V durante 1 h.
- Transfiera la proteína del gel a las membranas Western Blotting de PVDF (consulte la Tabla de materiales) a 100 V durante 70 min.
- Poner la membrana en leche en polvo sin grasa al 5% / TBST y agitar durante 1 h. Luego, lavar 3 veces con TBST durante 5 minutos por lavado con agitación.
- Coloque la membrana en anticuerpo His-Tag al 0,1% / TBST (consulte la Tabla de materiales) y agite durante 1 h, luego lave 3 veces con TBST durante 5 minutos por lavado con agitación.
- Coloque la membrana en anticuerpos IgG1 (HRP)/TBST anti-ratón al 0,02% (consulte la Tabla de materiales) y agite durante 40 minutos, luego lave 3 veces con TBST durante 5 minutos por lavado con agitación.
- Agregue una solución de quimioluminiscencia mejorada (consulte la Tabla de materiales) y exponga la membrana.
- Realizar la purificación de OMV-RBD.
- Diluir 1 ml de solución de OMV-RBD reaccionada a 10 ml y centrifugar la dilución a 150.000 g a 4 °C durante 2 h.
- Utilice una pipeta para desechar el sobrenadante y suspenda el residuo con 10 ml de PBS. Centrifugar la suspensión a 150.000 g a 4 °C durante 2 h.
- Desechar el sobrenadante y suspender el residuo con 1 mL de PBS.
NOTA: Si la solubilidad del antígeno es mucho menor, se puede lograr el mismo efecto de separación mediante cromatografía de exclusión de tamaño19.
5. Caracterización
- Realizar dispersión dinámica de luz (DLS).
- Diluir las muestras a una concentración de 100 μg/ml y añadir 1 ml de muestra en la celda de muestra.
- Elija "Tamaño" para "Tipo de medición", "Proteína" para "Material de muestra", "Agua" para "Dispersante", "25 °C" para "Temperatura", y luego cargue muestras y mida automáticamente23.
- Capture imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
- Diluir las muestras a 100 μg/ml. Tome una rejilla de cobre de malla 200, agréguele 20 μL de muestra y deje que se absorba durante 10 minutos.
- Use papel de filtro para absorber la solución, agregue 20 μL de acetato de uranilo al 3% a la película de soporte y tiñe durante 30 s.
- Mecha el acetato de uranilo y seca la película naturalmente a temperatura ambiente durante 1 h.
- Cargue las muestras en el sistema TEM (consulte Tabla de materiales) y capture imágenes a 80 kV.
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Representative Results
El diagrama de flujo para este protocolo se muestra en la Figura 1. Este protocolo podría ser un enfoque general para utilizar OMV como plataforma de vacunación; Solo hay que elegir los sistemas de expresión adecuados en función del tipo de antígenos.
La Figura 2 proporciona un esquema de diseño de plásmidos factible. El gen SC está conectado con el gen ClyA a través de un enlazador flexible, mientras que ST se conecta al terminal 5' del gen RBD con un gen His-tag para purificación y verificación. Western blot mostró que la reacción se completa gradualmente con el aumento de OMV-SC (Figura 3A). Después de la ultracentrifugación, casi todos los RBD-ST no reaccionados permanecieron en el sobrenadante. La segunda ultracentrifugación no proporcionó una ventaja significativa adicional sobre la primera vez (Figura 3B).
La distribución del tamaño de partícula fue determinada por DLS (Figura 4). El diámetro hidrodinámico promedio Z de OMV-SC fue de 133 nm, mientras que fue de 152,6 nm para OMV-RBD (Tabla 1). Estas diferencias pueden deberse a que RBD aumenta el tamaño de partícula OMV después de una visualización intensiva. Los resultados de TEM (Figura 5) son consistentes con los resultados de DLS. Las imágenes mostraron que los OMV siempre tienen una estructura esférica estándar, ya sea que estén conectados a RBD o no. Esto indica que las condiciones de extracción, reacción y purificación son propicias para mantener la actividad biológica de los OMV.
Figura 1: Diagrama de flujo de preparación OMV-RBD. El plásmido ClyA-SC se transformó en E. coli, mientras que el plásmido RBD-ST se transfectó en células HEK293F. Después de un período de cultivo, OMV-SC y RBD-ST fueron aislados y purificados. Después de la bioconjugación en tampón convencional y ultracentrifugación, se obtuvo OMV-RBD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los perfiles de plásmidos utilizados en este estudio. (A) plásmido pThioHisA ClyA-SC. (B) Plásmido PCDNA RBD-ST. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Verificación de OMV-RBD por Western blot. (A) La exploración de la relación de reacción entre OMV-SC y RBD-ST con anti-6x HisTag. M: marcador de peso molecular 1: OMV-SC; 2: RBD-ST; 3: OMV:RBD = 10:1 (w/w); 4: OMV:RBD = 20:1; 5: OMV:RBD = 40:1. (B) Validación de la eficiencia de la ultracentrifugación con anti-6x HisTag. M: marcador de peso molecular 1: OMV-SC; 2: OMV-RBD pre-ultracentrifugación; 3: RBD-ST; 4: sobrenadante después de la primera ultracentrifugación; 5: precipitar después de la primera ultracentrifugación; 6: sobrenadante después de la segunda ultracentrifugación; 7: precipitar después de la segunda ultracentrifugación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Distribución del tamaño de partícula medida por DLS . (A) OMV-SC. (B) OMV-RBD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Visualización de OMVs por TEM. (A) OMV-SC (200 μg/mL). (B) OMV-RBD (200 μg/mL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de la muestra | Temperatura (°C) | Z-Ave (d.nm) | Pdi |
| OMV-SC | 25 | 133 | 0.483 |
| OMV-RBD | 24.9 | 152.6 | 0.569 |
Tabla 1: Parámetros medidos por DLS.
Archivo complementario 1: Secuencias de plásmidos utilizadas en el presente estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Para crear una plataforma de vacuna de nanopartículas "Plug-and-Display", ClyA fusionado con SC se expresó en cepas BL21 (DE3), que es uno de los modelos más utilizados para la producción de proteínas recombinantes debido a sus ventajas en la expresión de proteínas24, de modo que habría suficiente fragmento SC en la superficie de los OMV durante el proceso de proliferación de bacterias. Al mismo tiempo, se preparó un antígeno diana fusionado con ST para el acoplamiento químico entre los antígenos y los OMV. Las ventajas de este esquema experimental y las perspectivas de aplicación futura se reflejan principalmente en tres aspectos. Primero, se realiza el sistema "Plug-and-Display" de diferentes antígenos y nanopartículas biológicas. El proceso de reacción y purificación podría ser rápido y sencillo, lo que tiene ventajas significativas en el desarrollo de vacunas para enfermedades infecciosas emergentes y otros escenarios. En segundo lugar, logra el objetivo de mostrar antígenos de alta densidad y proporciona un método de diseño de vacunas para algunos antígenos con baja inmunogenicidad. En tercer lugar, la expresión individual de OMV y RBD (proteína antigénica) es beneficiosa para garantizar una alta actividad de antígenos porque los sistemas de expresión procariota convencionales carecen de funciones tales como cofactores particulares, chaperonas moleculares y modificaciones postraduccionales, lo que puede conducir a la pérdida de proteínas y al plegamiento incorrecto.
En el proceso de construcción de plásmidos, el ClyA fue elegido como un objetivo para conectarse con SC principalmente debido a la estructura suelta en forma de barril del C-terminal de ClyA. Los estudios han demostrado que el autotransportador de hemoglobina proteasa (Hbp) puede mostrar antígenos de Streptococcus pneumonia y Mycobacterium tuberculosis25,26. De lo contrario, si el antígeno que se mostrará es de un procariota, es posible construir los antígenos directamente en el C-terminal de ClyA sin usar la conjugación SC / ST. Este método puede resultar en OMV con mayor densidad de visualización, pero todavía existe el riesgo de que las proteínas antigénicas no se plieguen correctamente. Es importante tener en cuenta que es necesario diseñar y utilizar un enlazador flexible cuando se inserta SC/ST en el fragmento de destino, lo que ayuda a mejorar la eficiencia de reacción entre SC y ST. La secuencia de enlazadores utilizada aquí fue GSGGSGGSGTG, y también se pueden seleccionar otros enlazadores flexibles.
Además del sistema SC/ST para la conjugación química de clics, la conjugación Snooptag/Snoopcatcher y Sortase A también se utilizan comúnmente para la conjugación covalente entre proteínas27,28. Al mismo tiempo, también se ha informado que la introducción de múltiples sistemas de enlace diferentes en el mismo vector29 o el uso del mismo sistema de enlace para múltiples antígenos19 puede lograr el propósito de mostrar múltiples antígenos heterólogos en el mismo vector, y luego se pueden preparar vacunas polivalentes o multifuncionales.
La alta citotoxicidad y el bajo rendimiento limitan el uso generalizado de OMV como plataformas de vacunas 4,30. Algunos genes relacionados con LPS han sido eliminados en la cepa utilizada en este protocolo, de acuerdo con la literatura relevante31,32,33, con el fin de reducir la citotoxicidad de los OMV. Se pueden extraer 1,18 mg de OMV de cada 1 L de la solución bacteriana por el método introducido en este protocolo. El rendimiento es aún inferior al de algunas cepas modificadas genéticamente de alta producción de vesículas34. Si es necesario, la homogeneización a alta presión también puede promover la germinación de la membrana bacteriana para producir más OMV, lo que puede lograr un mejor rendimiento y mostrar densidad al mismo tiempo35.
Las condiciones de inducción son cruciales para la densidad de SC que se muestra en la superficie de los OMV. Monitoreamos la expresión de la proteína diana a través de SDS-PAGE y luego descartamos la condición de inducción, que es relativamente leve y expresa más proteína. Diferentes proteínas pueden requerir diferentes condiciones de inducción, y los cambios en las condiciones de inducción pueden conducir a diferencias en la densidad de SC que se muestra en la superficie de los OMV. Se sugiere ajustar la relación antígeno y portador después de que cambien las condiciones experimentales para explorar la relación de reacción más apropiada. Además, la purificación de OMV-RBD se puede lograr mediante SEM o ultracentrifugación. Se probaron ambos métodos; la ultracentrifugación es más conveniente, y el OMV resultante tenía una pureza similar al protocolo SEM.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) y el Proyecto de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31670936, 82041045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
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