Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/64213
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון "Plug-and-Display", כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

Abstract

ננו-חלקיקים ביומימטיים המתקבלים מחיידקים או מווירוסים משכו עניין רב במחקר ובפיתוח חיסונים. שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) מופרשות בעיקר על ידי חיידקים גראם-שליליים במהלך גדילה ממוצעת, עם קוטר בגודל ננומטרי ופעילות אדג'ובנטית עצמית, שעשויה להיות אידיאלית להעברת חיסונים. OMVs תפקדו כמערכת אספקה רבת פנים לחלבונים, חומצות גרעין ומולקולות קטנות. כדי לנצל את מלוא המאפיינים הביולוגיים של OMVs, נעשה שימוש ב-OMVs שמקורם ב-Escherichia coli שעברו הנדסה ביולוגית כנשא ותחום קשירת קולטן SARS-CoV-2 (RBD) כאנטיגן לבניית פלטפורמת חיסון "הכנס-והצג". תחומי SpyCatcher (SC) ו- SpyTag (ST) בסטרפטוקוקוס פיוגנס יושמו כדי להצמיד OMVs ו- RBD. הגן Cytolysin A (ClyA) תורגם עם הגן SC כחלבון היתוך לאחר טרנספקציה פלסמידית, והשאיר אתר תגובתי על פני השטח של OMVs. לאחר ערבוב RBD-ST במערכת חיץ קונבנציונלית בן לילה, נוצר קשירה קוולנטית בין OMVs ו- RBD. כך הושג חיסון OMV רב-ערכי. על ידי החלפה באנטיגנים מגוונים, פלטפורמת החיסון OMVs יכולה להציג ביעילות מגוון אנטיגנים הטרוגניים, ובכך למנוע במהירות מגיפות של מחלות זיהומיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה מדויקת לבניית פלטפורמת החיסון OMV, כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

Introduction

כפלטפורמת חיסון פוטנציאלית, שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) משכו יותר ויותר תשומת לב בשנים האחרונות 1,2. OMVs, המופרשים באופן טבעי בעיקר על ידי חיידקים גראם שליליים3, הם חלקיקים ננומטריים כדוריים המורכבים מדו-שכבת שומנים, בדרך כלל בגודל של 20-300 ננומטר4. OMVs מכילים רכיבים שונים של חיידקי הורים, כולל אנטיגנים חיידקיים ותבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים (PAMPs), המשמשים כפוטנציאטורים חיסוניים מוצקים5. הודות למרכיביהם הייחודיים, מבנה השלפוחית הטבעי ואתרי שינוי נהדרים בהנדסה גנטית, OMVs פותחו לשימוש בתחומים ביו-רפואיים רבים, כולל חיסונים חיידקיים6, אדג'ובנטים7, תרופות אימונותרפיות לסרטן8, וקטורים למתן תרופות9 ודבקים אנטי-בקטריאליים10.

מגיפת SARS-CoV-2, שהתפשטה ברחבי העולם מאז 2020, גבתה מחיר כבד מהחברה העולמית. תחום קשירת הקולטן (RBD) בחלבון ספייק (חלבון S) יכול להיקשר עם אנזים ממיר אנגיוטנסין אנושי 2 (ACE2), אשר לאחר מכן מתווך את כניסת הנגיף לתא11,12,13. לפיכך, נראה כי RBD הוא יעד עיקרי לגילוי חיסונים14,15,16. עם זאת, RBD מונומרי הוא אימונוגני גרוע, והמשקל המולקולרי הקטן שלו מקשה על מערכת החיסון לזהות, ולכן אדג'ובנטים נדרשים לעתים קרובות17.

על מנת להגביר את האימונוגניות של RBD, נבנו OMVs המציגים RBDs רב-ערכיים. מחקרים קיימים המשתמשים ב-OMV להצגת RBD בדרך כלל ממזגים RBD עם OMV כדי להתבטא בחיידקים18. עם זאת, RBD הוא חלבון שמקורו בנגיף, וביטוי פרוקריוטי עשוי להשפיע על פעילותו. כדי לפתור בעיה זו, נעשה שימוש במערכת SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC), הנגזרת מ-Streptococcus pyogenes, ליצירת איזופפטיד קוולנטי עם OMV ו-RBD במערכת חיץ קונבנציונלית19. תחום ה-SC בא לידי ביטוי עם ציטוליזין A (ClyA) כחלבון היתוך על ידי קולי Escherichia מהונדס ביולוגית, ו-ST התבטא עם RBD באמצעות מערכת הביטוי התאית HEK293F. OMV-SC ו- RBD-ST היו מעורבים ודוגרו בן לילה. לאחר טיהור על ידי ultracentrifugation או כרומטוגרפיה אי הכללת גודל (SEC), OMV-RBD התקבל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בנייה פלסמידית

  1. הכנס את רצף SpyCatcher המקודד DNA (קובץ משלים 1) לתוך פלסמיד pThioHisA-ClyA עמיד לאמפיצילין (ראה טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו- Sal I כדי לבנות את הפלסמיד pThioHisA ClyA-SC בעקבות דו"חשפורסם בעבר 20.
  2. ליגייט את גן ההיתוך SpyTag-RBD-Histag המסונתז (קובץ משלים 1) לפלסמיד pcDNA3.1 (ראה טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו- EcoR I כדי לבנות את הפלסמיד pcDNA3.1 RBD-ST בעקבות דו"חשפורסם בעבר 19.

2. הכנת OMV-SC

  1. בצע המרה של ClyA-SC בהתאם לשלבים הבאים.
    1. הוסיפו 5 μL של תמיסת פלסמיד pThioHisA ClyA-SC (50 ננוגרם/מיקרול) ל-50 מיקרוגרם של זן BL21 מוכשר, נשפו בעדינות והניחו להתקרר על קרח למשך 30 דקות.
    2. מניחים את התמיסה במשך 90 שניות באמבט המים ב 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מיד לשים את הפתרון המעורב על קרח במשך 3 דקות.
    3. הוסיפו 500 μL של מדיום LB לתרחיף החיידקי, ולאחר הערבוב, תרבית ב-220 סל"ד ב-37°C למשך שעה אחת.
    4. צלחת את כל הטרנספורמציה על צלחת אגר LB המכילה אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל, ראה טבלת חומרים) ותרבית לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: בניסויים מאוחרים יותר, האמפיצילין נשמר באותו ריכוז בתווך. אם לא, זה עלול לגרום לאובדן פלסמידים בחיידקים.
  2. עבור ייצור OMV-SC, בצע את השלבים הבאים.
    1. לבודד מושבה בודדת מהצלחת (שלב 2.1.4.) עד 20 מ"ל של LB (עמיד לאמפיצילין) בינוני ותרבות לילה ב-220 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. לחסן את התמיסה החיידקית (משלב 2.2.1.) למדיום 2 ליטר, תרבית ב 220 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות עד שלב הצמיחה הלוגריתמית (OD600nm הוא בין 0.6 ל 0.8).
    3. כאשר ה-OD ב-600 ננומטר של תמיסת החיידקים מגיע ל-0.6-0.8, הוסיפו איזופרופיל בטא-D-thiogalactopyranoside (IPTG, ראו טבלת חומרים) כדי שהריכוז הסופי של תמיסת החיידקים יהיה 0.5 mM, ולאחר מכן תרבית לילה ב-220 סל"ד ב-25 מעלות צלזיוס.
  3. בצע טיהור OMV-SC.
    1. צנטריפוגה של תמיסת החיידקים ב-7,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. סנן את הסופר-נטנט עם מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן רכז אותו באמצעות ממברנת אולטרה-סינון של 100 kD או עמודת סיבים חלולים (ראה טבלת חומרים).
    3. סנן את התרכיז דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, לאחר מכן צנטריפוגה ב-150,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים), והשלך את הסופר-נטנט עם פיפטה.
    4. להשעות את המשקעים עם PBS ולאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס. הפתרון יכול לשמור על יציבות לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס.

3. הכנת RBD-ST

  1. בצע טרנספקציה של RBD-ST לפי השלבים הבאים.
    1. בחר מערכת ביטוי אאוקריוטית מתאימה (למשל, HEK293F) ותרבת את התאים במשך הלילה ב-130 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס לאחר ההתאוששות.
    2. הוסף 20 μL של תמיסת תאי HEK293F לתוך מונה התאים האוטומטי (ראה טבלת חומרים), תעד את מספר התאים, התאם את הריכוז ל-1 x 106 תאים למ"ל, ולאחר מכן תרבית את התאים ב-130 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
    3. סנן פלסמיד RBD-ST דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, והוסף 300 מיקרוגרם של פלסמידים למדיום תרבית התא (ראה טבלת חומרים) עד שהנפח הסופי הוא 10 מ"ל; לנער במשך 10 שניות.
    4. יש לחמם PEI (1 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) ל-65°C באמבט המים, לערבב 0.7 מ"ל של PEI עם 9.3 מ"ל של מדיום תרבית תאים, ולנער לסירוגין במשך 10 שניות.
      הערה: אין לנער את התמיסה במרץ. אחרת, הבועות המתקבלות עשויות להשפיע על יעילות הטרנספקציה.
    5. מוסיפים תמיסת פלסמיד לתמיסת PEI, מנערים את התערובת לסירוגין במשך 10 שניות ומדגרים אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    6. מוסיפים את התערובת ל-280 מ"ל של תרבית תאים בינונית ותרבית ב-130 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
  2. בצע טיהור RBD-ST.
    1. צנטריפוגה של התאים ב 6,000 x גרם ב 25 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולהשתמש פיפטה כדי לאסוף את supernatant.
    2. מלאו את העמודה ב-2 מ"ל של אגרוז Ni-NTA (ראו טבלת חומרים) ושטפו אותה פי 3 עם 3x PBS.
    3. הוסיפו אימידזול (ראו טבלת חומרים) לסופרנטנט של התא כדי להגיע לריכוז הסופי של 20 מ"מ, והעמיסו את הסופרנטנט של התא פי 2.
    4. הוסיפו 3 נפחי עמודות (CV) של PBS המכילים 20 מ"מ של אימידזול לכביסה, ואספו את חלק הכביסה.
    5. גרדיאנט אלוטה עם 3 CV של PBS המכיל ריכוזים נמוכים עד גבוהים (למשל, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M) של imidazole; elute 2x עבור כל ריכוז.
    6. השתמש ב- SDS-PAGE21 כדי לזהות את RBD-ST במעברי ריכוז שונים.

4. ביו-קונגציה וטיהור OMV-RBD

  1. קבעו את ריכוז החלבון בשיטת BCA (ראו טבלת חומרים).
    1. לדלל באופן סדרתי את תמיסת חלבון ה-BSA הסטנדרטית מ-2 מ"ג/מ"ל ל-0.0625 מ"ג/מ"ל, לדלל את ה-OMV-SC המטוהר ואת RBD-ST 10x, ולאחר מכן לערבב פתרונות עבודה של BCA A ו-B (המסופקים בערכת הבדיקה) ביחס של 50:1 (v/v).
    2. מוסיפים תמיסת חלבון מדולל (25 μL/well) ומערבבים עם תמיסה עובדת BCA (200 μL/well); לדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. מדוד את הספיגה (OD) ב-562 ננומטר של כל באר וחשב את ריכוז החלבון מהעקומה הסטנדרטית22.
  2. בצע התאמה ביולוגית של OMV-SC ו- RBD-ST לפי השלבים הבאים.
    1. ערבב OMV-SC ו-RBD-ST ב-PBS ביחס של 40:1 (w/w).
    2. סובבו אנכית כדי למזג את התערובת למשך הלילה ב-15 סל"ד ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: אנטיגנים שונים עשויים להגיב בפרופורציות שונות. אפשר לנסות יחסי תגובה שונים המבוססים על מאפייני האנטיגן.
  3. ודא את יעילות התגובה.
    1. הכן 10 μL של OMV-SC, RBD-ST ואת מוצר התגובה (שלב 4.2.). הוסף 2.5 μL של מאגר העמסה פי 5 (ראה טבלת חומרים), וחמם את הדגימות ב-100 °C למשך 5 דקות. יש להעמיס את הדגימות לתוך הג'ל (10 μL/well). בצע אלקטרופורזה ב 60 V במשך 20 דקות ולשנות את המצב ל 120 V במשך שעה אחת.
    2. מעבירים את החלבון מהג'ל לממברנות PVDF מערביות (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 100 וולט למשך 70 דקות.
    3. הכניסו את הממברנה לאבקת חלב 5% ללא שומן/TBST ונערו במשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לשטוף 3x עם TBST במשך 5 דקות לכל כביסה עם טלטול.
    4. הכניסו את הממברנה לנוגדן His-Tag/TBST של 0.1% (ראו טבלת חומרים) ונערו במשך שעה אחת, ולאחר מכן שטפו 3x עם TBST למשך 5 דקות לכל כביסה עם טלטול.
    5. הכניסו את הממברנה לנוגדן IgG1 נגד עכברים (HRP)/TBST (ראו טבלת חומרים) ונערו במשך 40 דקות, ולאחר מכן שטפו 3 פעמים עם TBST למשך 5 דקות לכל כביסה עם טלטול.
    6. מוסיפים תמיסת כימילומינסנציה משופרת (ראו טבלת חומרים) וחושפים את הממברנה.
  4. בצע טיהור של OMV-RBD.
    1. יש לדלל 1 מ"ל של תמיסת OMV-RBD מגיבה ל-10 מ"ל, ולבצע צנטריפוגה של דילול ב-150,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    2. השתמש פיפטה כדי להשליך את supernatant ולהשעות את השאריות עם 10 מ"ל של PBS. צנטריפוגה המתלים ב 150,000 x גרם ב 4 °C במשך 2 שעות.
    3. השליכו את הסופר-נטנט והשעו את השאריות עם 1 מ"ל של PBS.
      הערה: אם המסיסות של האנטיגן נמוכה בהרבה, ניתן להשיג את אותו אפקט הפרדה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל19.

5. אפיון

  1. בצע פיזור אור דינמי (DLS).
    1. דלל את הדגימות לריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל והוסף 1 מ"ל דגימה לתא הדגימה.
    2. בחר "גודל" עבור "סוג מדידה", "חלבון" עבור "חומר מדגם", "מים" עבור "פיזור", "25 °C" עבור "טמפרטורה", ולאחר מכן טען דגימות ומדוד באופן אוטומטי23.
  2. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM).
    1. יש לדלל את הדגימות ל-100 מיקרוגרם/מ"ל. קח רשת נחושת של 200 רשת, הוסף לה 20 μL של דגימה, ואפשר לה להיספג במשך 10 דקות.
    2. השתמש בנייר סינון כדי לפתות את התמיסה, הוסף 20 μL של 3% אורניל אצטט לסרט התמיכה, והכתים במשך 30 שניות.
    3. יש לפות את האורניל אצטט ולייבש את הסרט באופן טבעי בטמפרטורת החדר למשך שעה.
    4. טען את הדגימות למערכת TEM (ראה טבלת חומרים) ולכוד תמונות ב- 80 kV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תרשים הזרימה של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. פרוטוקול זה יכול להיות גישה כללית לשימוש ב-OMVs כפלטפורמת חיסונים; צריך רק לבחור את מערכות הביטוי המתאימות על סמך סוג האנטיגנים.

איור 2 מספק סכימת תכנון פלסמידית אפשרית. הגן SC מחובר לגן ClyA באמצעות מקשר גמיש, בעוד ST מתחבר למסוף 5' של הגן RBD עם גן תג שלו לטיהור ואימות. כתם מערבי הראה שהתגובה מסתיימת בהדרגה עם עלייה ב-OMV-SC (איור 3A). לאחר האולטרה-צנטריפוגציה, כמעט כל ה-RBD-ST שלא הופעלו נשארו בסופר-סנטר. האולטרה-צנטריפוגציה השנייה לא סיפקה יתרון משמעותי נוסף בפעם הראשונה (איור 3B).

התפלגות גודל החלקיקים נקבעה על-ידי DLS (איור 4). הקוטר ההידרודינמי הממוצע Z של OMV-SC היה 133 ננומטר, בעוד שהוא היה 152.6 ננומטר עבור OMV-RBD (טבלה 1). הבדלים אלה עשויים להיות בגלל RBD מגדיל את גודל חלקיקי OMV לאחר תצוגה אינטנסיבית. התוצאות של TEM (איור 5) עקביות עם תוצאות ה-DLS. התמונות הראו של-OMVs יש תמיד מבנה כדורי סטנדרטי, בין אם הם מחוברים ל-RBD ובין אם לא. זה מצביע על כך שתנאי המיצוי, התגובה והטיהור תורמים לשמירה על הפעילות הביולוגית של OMVs.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה של הכנת OMV-RBD. פלסמיד ClyA-SC הפך ל-E.coli, ואילו פלסמיד RBD-ST הומר לתאי HEK293F. לאחר תקופה של תרבות, OMV-SC ו- RBD-ST בודדו וטוהרו. לאחר bioconjugation בחיץ קונבנציונאלי אולטרה centrifugation, OMV-RBD התקבל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: פרופילי הפלסמיד ששימשו במחקר זה . (A) פלסמיד pThioHisA ClyA-SC. (ב) פלסמיד PCDNA RBD-ST. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אימות של OMV-RBD על ידי כתם מערבי. (A) חקר יחס התגובה בין OMV-SC ו-RBD-ST עם אנטי-6x HisTag. M: סמן משקל מולקולרי 1: OMV-SC; 2: RBD-ST; 3: OMV:RBD = 10:1 (w/w); 4: OMV:RBD = 20:1; 5: OMV:RBD = 40:1. (B) אימות היעילות של אולטרה-צנטריפוגציה עם אנטי-6x HisTag. M: סמן משקל מולקולרי 1: OMV-SC; 2: OMV-RBD טרום-אולטרה-צנטריפוגציה; 3: RBD-ST; 4: סופר-ננטנט פוסט אולטרה-צנטריפוגציה ראשונה; 5: לזרז לאחר האולטרה-צנטריפוגציה הראשונה; 6: סופר-נטנט לאחר האולטרה-צנטריפוגציה השנייה; 7: לזרז לאחר האולטרה-צנטריפוגציה השנייה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: התפלגות גודל החלקיקים נמדדה על-ידי DLS . (A) OMV-SC. (ב) OMV-RBD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: הדמיה של OMVs על-ידי TEM. (A) OMV-SC (200 מיקרוגרם/מ"ל). (B) OMV-RBD (200 מיקרוגרם/מ"ל). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שם לדוגמה טמפרטורה (צלסיוס) Z-Ave (d.nm) PDI
OMV-SC 25 133 0.483
OMV-RBD 24.9 152.6 0.569

טבלה 1: פרמטרים הנמדדים על ידי DLS.

קובץ משלים 1: רצפי פלסמיד ששימשו במחקר הנוכחי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי ליצור פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "Plug-and-Display", ClyA שהתמזגה ב-SC באה לידי ביטוי בזני BL21(DE3), שהוא אחד המודלים הנפוצים ביותר לייצור חלבונים רקומביננטיים בגלל יתרונותיו בביטוי חלבונים24, כך שיהיה מספיק מקטע SC המוצג על פני השטח של ה-OMVs במהלך תהליך התפשטות החיידקים. במקביל, אנטיגן מטרה שהתמזג ST הוכן לצימוד הכימי בין האנטיגנים ל- OMVs. היתרונות של תוכנית ניסיונית זו וסיכויי היישום העתידיים משתקפים בעיקר בשלושה היבטים. ראשית, מערכת "Plug-and-Display" של אנטיגנים שונים וננו-חלקיקים ביולוגיים מתממשת. תהליך התגובה והטיהור יכול להיות מהיר ופשוט, ויש לו יתרונות משמעותיים בפיתוח חיסונים למחלות זיהומיות מתפתחות ותרחישים אחרים. שנית, הוא משיג את המטרה של הצגת אנטיגן בצפיפות גבוהה ומספק שיטת תכנון חיסון עבור אנטיגנים מסוימים עם אימונוגניות נמוכה. שלישית, הביטוי האינדיבידואלי של OMVs ו-RBD (חלבון אנטיגני) מועיל להבטיח פעילות אנטיגן גבוהה מכיוון שמערכות ביטוי פרוקריוטיות קונבנציונליות חסרות פונקציות כגון גורמים משלימים מסוימים, מלווים מולקולריים ושינויים לאחר תרגום, שעלולים להוביל לאובדן חלבונים ולקיפול שגוי.

בתהליך של בניית פלסמיד, ה- ClyA נבחר כיעד להתחבר ל- SC בעיקר בשל המבנה הרופף בצורת חבית של מסוף C של ClyA. מחקרים הראו כי אוטוטרנספורטר המוגלובין פרוטאז (Hbp) יכול להציג אנטיגנים מדלקת ריאות סטרפטוקוקוס ושחפת מיקובקטריום25,26. אחרת, אם האנטיגן שיוצג הוא מפרוקריוט, ניתן לבנות את האנטיגנים ישירות לתוך מסוף C של ClyA ללא שימוש בהצמדת SC/ST. שיטה זו עלולה לגרום ל-OMVs עם צפיפות תצוגה גבוהה יותר, אך עדיין קיים סיכון שהחלבונים האנטיגניים לא יתקפלו כראוי. חשוב לציין כי יש לתכנן ולהשתמש במקשר גמיש כאשר SC/ST מוכנס למקטע המטרה, מה שעוזר לשפר את יעילות התגובה בין SC ל-ST. רצף המקשרים ששימש כאן היה GSGGSGGSGTG, וניתן לבחור גם מקשרים גמישים אחרים.

בנוסף למערכת SC/ST להצמדת קליק-כימיה, סנופטג/סנופצ'ר ו-Sortase A משמשים בדרך כלל גם להצמדה קוולנטית בין חלבונים27,28. יחד עם זאת, דווח גם כי הכנסת מספר מערכות קישור שונות על אותו וקטור29 או שימוש באותה מערכת קישור למספר אנטיגנים19 יכולים להשיג את המטרה של הצגת אנטיגנים הטרולוגיים מרובים על אותו וקטור, ואז ניתן להכין חיסונים רב-תכליתיים או רב-תכליתיים.

ציטוטוקסיות גבוהה ותפוקה נמוכה מגבילות את השימוש הנרחב ב-OMVs כפלטפורמות חיסון 4,30. כמה גנים הקשורים ל-LPS הושחתו בזן המשמש בפרוטוקול זה, על פי הספרות הרלוונטית31,32,33, על מנת להפחית את הציטוטוקסיות של OMVs. ניתן להפיק 1.18 מ"ג OMVs מכל ליטר 1 ליטר של תמיסת החיידקים בשיטה שהוצגה בפרוטוקול זה. התשואה עדיין נמוכה מזו של כמה זנים מהונדסים גנטית המייצרים שלפוחית גבוהה34. במידת הצורך, הומוגניזציה בלחץ גבוה יכולה גם לקדם את הנביטה של קרום החיידק כדי לייצר יותר OMVs, אשר יכול להשיג תפוקה משופרת והצגת צפיפות באותו זמן35.

תנאי האינדוקציה חיוניים לצפיפות ה- SC המוצגת על פני השטח של ה- OMVs. עקבנו אחר הביטוי של חלבון המטרה באמצעות SDS-PAGE ולאחר מכן סקרנו את מצב האינדוקציה, שהוא קל יחסית ומבטא יותר חלבון. חלבונים שונים עשויים לדרוש תנאי אינדוקציה שונים, ושינויים בתנאי האינדוקציה עשויים להוביל להבדלים בצפיפות ה-SC המוצגת על פני השטח של ה-OMVs. מומלץ להתאים את יחס האנטיגן והנשא לאחר שינוי תנאי הניסוי כדי לחקור את יחס התגובה המתאים ביותר. בנוסף, טיהור של OMV-RBD יכול להיות מושגת על ידי SEM או ultracentrifugation. שתי השיטות נוסו; ultracentrifugation נוח יותר, ואת OMV וכתוצאה מכך היה טוהר דומה פרוטוקול SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המפתח של קרן מדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג (לא. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ופרויקט הקרן הלאומית הסינית למדעי הטבע (מס' 31670936, 82041045).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin sodium Sangon Biotech A610028
Automated cell counter Countstar BioTech
BCA protein quantification Kit cwbio cw0014s
ChemiDoc Touching Imaging System Bio-rad
Danamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatus Cavoy Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer Sangon Biotech C520009
Goat pAb to mouse IgG1 Abcam ab97240
High speed freezing centrifuge Bioridge H2500R
His-Tag mouse mAb Cell signaling technology 2366s
Imidazole Sangon Biotech A600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Sangon Biotech A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow Qiagen 70691
Non-fat powdered milk Sangon Biotech A600669
OPM-293 cell culture medium Opm biosciences 81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid Wuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer saline ZSGB-bio ZLI-9061
Polyethylenimine Linear Polysciences 23966-1
Prestained protein ladder Thermo 26616
pThioHisA ClyA-SC plasmid Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting Membranes Roche 03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x) Beyotime P0015
Sodium chloride Sangon Biotech A100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) Thermo 34577
Suspension instrument Life Technology Hula Mixer
Transmission Electron Microscope Hitachi HT7800
Tryptone Oxoid LP0042B
Ultracentrifuge Beckman coulter XPN-100
Ultraviolet spectrophotometer Hitachi U-3900
Yeast extract Sangon Biotech A610961

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
  3. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  4. Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
  5. Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
  6. Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
  7. Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
  8. Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
  9. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
  10. Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
  11. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  12. Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
  13. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
  14. Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
  15. Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
  16. Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
  17. Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
  18. Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
  19. Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
  20. Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
  21. Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
  22. Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
  23. Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
  24. Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
  25. Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
  26. Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
  27. Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  28. Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
  29. van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
  30. Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
  31. Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
  32. Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
  33. Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
  34. Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
  35. Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 185
פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, R., Li, G. C., Jing, H. M.,… More

Feng, R., Li, G. C., Jing, H. M., Liu, C., Xue, R. Y., Zou, Q. M., Li, H. B. A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain. J. Vis. Exp. (185), e64213, doi:10.3791/64213 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter