Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" القائمة على حويصلات الغشاء الخارجي التي تعرض مجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/64213
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

Summary

يصف البروتوكول الحالي الهندسة الحيوية للحويصلات الغشائية الخارجية بأنها منصة لقاح "التوصيل والعرض" ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.

Abstract

اجتذبت الجسيمات النانوية المحاكية بيولوجيا التي تم الحصول عليها من البكتيريا أو الفيروسات اهتماما كبيرا بالبحث والتطوير في مجال اللقاحات. تفرز الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) بشكل أساسي بواسطة البكتيريا سالبة الجرام أثناء متوسط النمو ، بقطر نانوي ونشاط مساعد ذاتي ، والذي قد يكون مثاليا لتوصيل اللقاح. عملت OMVs كنظام توصيل متعدد الأوجه للبروتينات والأحماض النووية والجزيئات الصغيرة. للاستفادة الكاملة من الخصائص البيولوجية ل OMVs ، تم استخدام OMVs المشتقة من الإشريكية القولونية المهندسة بيولوجيا كحامل ومجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2 (RBD) كمستضد لبناء منصة لقاح "التوصيل والعرض". تم تطبيق نطاقات SpyCatcher (SC) و SpyTag (ST) في Streptococcus pyogenes على OMVs و RBD المرافقين. تمت ترجمة جين Cytolysin A (ClyA) مع جين SC كبروتين اندماج بعد نقل البلازميد ، تاركا موقعا تفاعليا على سطح OMVs. بعد خلط RBD-ST في نظام عازلة تقليدي بين عشية وضحاها ، تم تشكيل الربط التساهمي بين OMVs و RBD. وهكذا ، تم تحقيق لقاح OMV متعدد التكافؤ. من خلال الاستبدال بمستضدات متنوعة ، يمكن لمنصة لقاح OMVs عرض مجموعة متنوعة من المستضدات غير المتجانسة بكفاءة ، وبالتالي منع أوبئة الأمراض المعدية بسرعة. يصف هذا البروتوكول طريقة دقيقة لبناء منصة لقاح OMV ، بما في ذلك الإنتاج والتنقية والاقتران الحيوي والتوصيف.

Introduction

كمنصة لقاح محتملة ، جذبت الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) المزيد والمزيد من الاهتمام في السنوات الأخيرة 1,2. OMVs ، التي تفرزها بشكل طبيعي البكتيريا سالبة الجرام3 ، هي جسيمات نانوية كروية تتكون من طبقة ثنائية دهنية ، عادة بحجم 20-300 نانومتر4. تحتوي OMVs على مكونات بكتيرية أبوية مختلفة ، بما في ذلك المستضدات البكتيرية والأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، والتي تعمل كمحفزات مناعية صلبة5. بالاستفادة من مكوناتها الفريدة ، وهيكل الحويصلة الطبيعية ، ومواقع تعديل الهندسة الوراثية الرائعة ، تم تطوير OMVs للاستخدام في العديد من المجالات الطبية الحيوية ، بما في ذلك اللقاحات البكتيرية6 ، والمواد المساعدة7 ، وأدوية العلاج المناعي للسرطان8 ، ونواقل توصيل الدواء9 ، والمواد اللاصقة المضادة للبكتيريا10.

تسبب جائحة SARS-CoV-2 ، الذي انتشر في جميع أنحاء العالم منذ عام 2020 ، في خسائر فادحة في المجتمع العالمي. يمكن أن يرتبط مجال ربط المستقبلات (RBD) في بروتين سبايك (بروتين S) بالإنزيم المحول للأنجيوتنسين البشري 2 (ACE2) ، والذي يتوسط بعد ذلك دخول الفيروس إلى الخلية11،12،13. وبالتالي ، يبدو أن RBD هو الهدف الرئيسي لاكتشاف اللقاح14،15،16. ومع ذلك ، فإن RBD الأحادي ضعيف المناعة ، ووزنه الجزيئي الصغير يجعل من الصعب على الجهاز المناعي التعرف عليه ، لذلك غالبا ما تكون المواد المساعدة مطلوبة17.

من أجل زيادة مناعة RBD ، تم إنشاء OMVs التي تعرض RBDs متعددة التكافؤ. عادة ما تدمج الدراسات الحالية التي تستخدم OMV لعرض RBD RBD مع OMV ليتم التعبير عنها في البكتيريا18. ومع ذلك ، فإن RBD هو بروتين مشتق من الفيروس ، ومن المرجح أن يؤثر التعبير بدائي النواة على نشاطه. لحل هذه المشكلة ، تم استخدام نظام SpyTag (ST) / SpyCatcher (SC) ، المشتق من Streptococcus pyogenes ، لتشكيل إيزوببتيد تساهمي مع OMV و RBD في نظام عازلة تقليدي19. تم التعبير عن مجال SC مع Cytolysin A (ClyA) كبروتين اندماج بواسطة الإشريكية القولونية المهندسة بيولوجيا ، وتم التعبير عن ST باستخدام RBD عبر نظام التعبير الخلوي HEK293F. تم خلط OMV-SC و RBD-ST وحضنهما بين عشية وضحاها. بعد التنقية عن طريق الطرد المركزي الفائق أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، تم الحصول على OMV-RBD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بناء البلازميد

  1. أدخل تسلسل SpyCatcher لترميز الحمض النووي (الملف التكميلي 1) في بلازميد pThioHisA-ClyA المقاوم للأمبيسيلين (انظر جدول المواد) بين موقعي BamH I و Sal I لبناء pThioHisA ClyA-SC البلازميد بعد تقرير منشور مسبقا20.
  2. قم بربط جين الاندماج SpyTag-RBD-Histag المركب (الملف التكميلي 1) في بلازميد pcDNA3.1 (انظر جدول المواد) بين موقعي BamH I و EcoR I لبناء pcDNA3.1 RBD-ST البلازميد بعد تقرير منشور مسبقا19.

2. إعداد OMV-SC

  1. قم بإجراء تحويل ClyA-SC باتباع الخطوات أدناه.
    1. أضف 5 ميكرولتر من محلول البلازميد pThioHisA ClyA-SC (50 نانوغرام / ميكرولتر) إلى 50 ميكرولتر من سلالة BL21 المختصة ، ونفخ برفق ، واتركه يبرد على الثلج لمدة 30 دقيقة.
    2. ضع المحلول لمدة 90 ثانية في حمام مائي على حرارة 42 درجة مئوية ، ثم ضع المحلول المختلط على الثلج على الفور لمدة 3 دقائق.
    3. أضف 500 ميكرولتر من وسط LB إلى المعلق البكتيري ، وبعد الخلط ، استزرع عند 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. ضع كل التحويل على صفيحة أجار LB تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) واستزراع طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: في التجارب اللاحقة ، تم الاحتفاظ بالأمبيسلين بنفس التركيز في الوسط. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد يتسبب ذلك في فقدان البلازميدات في البكتيريا.
  2. لإنتاج OMV-SC ، قم بتنفيذ الخطوات أدناه.
    1. اعزل مستعمرة واحدة من اللوحة (الخطوة 2.1.4) إلى 20 مل من وسط LB (المقاوم للأمبيسيلين) واستزرع طوال الليل عند 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بتلقيح المحلول البكتيري (من الخطوة 2.2.1.) إلى وسط 2 لتر ، استزراع عند 220 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات حتى مرحلة النمو اللوغاريتمي (OD600nm بين 0.6 إلى 0.8).
    3. عندما يصل OD عند 600 نانومتر من المحلول البكتيري إلى 0.6-0.8 ، أضف الأيزوبروبيل بيتا-D-thiogalactopyranoside (IPTG ، انظر جدول المواد) لجعل التركيز النهائي للمحلول البكتيري 0.5 mM ، ثم استزرع بين عشية وضحاها عند 220 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية.
  3. أداء تنقية OMV-SC.
    1. جهاز طرد مركزي للمحلول البكتيري عند 7000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بتصفية المادة الطافية باستخدام مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بتركيزها باستخدام غشاء ترشيح فائق 100 كيلو متر أو عمود ألياف مجوف (انظر جدول المواد).
    3. قم بتصفية المركز من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر ، ثم قم بطرده بالطرد المركزي عند 150000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة باستخدام جهاز طرد مركزي فائق (انظر جدول المواد) ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
    4. أعد تعليق هطول الأمطار باستخدام PBS وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية. يمكن أن يحافظ المحلول على الاستقرار على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.

3. إعداد RBD-ST

  1. قم بإجراء نقل RBD-ST باتباع الخطوات أدناه.
    1. حدد نظام تعبير حقيقي النواة مناسب (على سبيل المثال ، HEK293F) وقم بزراعة الخلايا طوال الليل عند 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية بعد التعافي.
    2. أضف 20 ميكرولتر من محلول خلية HEK293F إلى عداد الخلايا الآلي (انظر جدول المواد) ، وسجل عدد الخلايا ، واضبط التركيز على 1 × 106 خلايا / مل ، ثم استزرع الخلايا عند 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    3. قم بتصفية بلازميد RBD-ST من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر ، وأضف 300 ميكروغرام من البلازميدات إلى وسط زراعة الخلية (انظر جدول المواد) حتى يصبح الحجم النهائي 10 مل ؛ يهز لمدة 10 ثوان.
    4. سخني PEI (1 مجم / مل ، انظر جدول المواد) إلى 65 درجة مئوية في حمام مائي ، واخلطي 0.7 مل من PEI مع 9.3 مل من وسط زراعة الخلايا ، ورجيه بشكل متقطع لمدة 10 ثوان.
      ملاحظة: لا تهز المحلول بقوة. خلاف ذلك ، قد تؤثر الفقاعات الناتجة على كفاءة النقل.
    5. أضف محلول البلازميد إلى محلول جزيرة الأمير إدوارد ، ورج الخليط بشكل متقطع لمدة 10 ثوان ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    6. يضاف الخليط إلى 280 مل من وسط زراعة الخلايا والمزرعة عند 130 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
  2. أداء تنقية RBD-ST.
    1. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 6000 × جم عند 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة واستخدم ماصة لجمع المادة الطافية.
    2. املأ العمود ب 2 مل من أغاروز Ni-NTA (انظر جدول المواد) واغسله 3x مع 3x PBS.
    3. أضف إيميدازول (انظر جدول المواد) إلى طاف الخلية لجعل التركيز النهائي 20 mM ، وقم بتحميل طاف الخلية 2x.
    4. أضف 3 مجلدات أعمدة (CV) من PBS تحتوي على 20 مللي متر من إيميدازول للغسيل ، واجمع جزء الغسيل.
    5. التدرج الليوت مع 3 CV من PBS تحتوي على تركيزات منخفضة إلى عالية (على سبيل المثال ، 0.3 م ، 0.4 م ، 0.5 م) من إيميدازول ؛ elute 2x لكل تركيز.
    6. استخدم SDS-PAGE21 لتحديد RBD-ST في تدرجات تركيز مختلفة.

4. الاقتران الحيوي OMV-RBD والتنقية

  1. تحديد تركيز البروتين بطريقة BCA (انظر جدول المواد).
    1. قم بتخفيف محلول بروتين BSA القياسي بشكل تسلسلي من 2 مجم / مل إلى 0.0625 مجم / مل ، وقم بتخفيف OMV-SC و RBD-ST 10x المنقى ، ثم امزج محاليل عمل BCA A و B (المتوفرة في مجموعة الفحص) بنسبة 50: 1 (v / v).
    2. إضافة محلول البروتين المخفف (25 ميكرولتر / بئر) وتخلط مع محلول عمل BCA (200 ميكرولتر / بئر) ؛ احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. قم بقياس الامتصاص (OD) عند 562 نانومتر لكل بئر واحسب تركيز البروتين من المنحنى القياسي22.
  2. قم بإجراء الاقتران الحيوي ل OMV-SC و RBD-ST باتباع الخطوات أدناه.
    1. امزج OMV-SC و RBD-ST في PBS بنسبة 40: 1 (وزن / وزن).
    2. قم بتدويره عموديا لخلط الخليط طوال الليل عند 15 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قد تتفاعل مولدات الضد المختلفة بنسب مختلفة. يمكن للمرء أن يجرب نسب تفاعل مختلفة بناء على خصائص مولد الضد.
  3. تحقق من كفاءة التفاعل.
    1. قم بإعداد 10 ميكرولتر من OMV-SC ، RBD-ST ، ومنتج التفاعل (الخطوة 4.2.). أضف 2.5 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت 5x (انظر جدول المواد) ، وقم بتسخين العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بتحميل العينات في الجل (10 ميكرولتر / بئر). أداء الكهربائي في 60 فولت لمدة 20 دقيقة وتغيير الحالة إلى 120 فولت لمدة 1 ساعة.
    2. انقل البروتين من الجل إلى أغشية النشاف الغربية PVDF (انظر جدول المواد) عند 100 فولت لمدة 70 دقيقة.
    3. ضع الغشاء في 5٪ حليب مجفف خالي الدسم / TBST ورجه لمدة 1 ساعة. ثم اغسل 3 مرات باستخدام TBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة مع الرج.
    4. ضع الغشاء في 0.1٪ من الأجسام المضادة His-Tag / TBST (انظر جدول المواد) ورجه لمدة ساعة واحدة ، ثم اغسل 3x باستخدام TBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة مع الرج.
    5. ضع الغشاء في 0.02٪ من الأجسام المضادة IgG1 المضادة للفأر (HRP) / TBST (انظر جدول المواد) ورجها لمدة 40 دقيقة ، ثم اغسلها 3 مرات باستخدام TBST لمدة 5 دقائق لكل غسلة مع الرج.
    6. أضف محلول التلألؤ الكيميائي المحسن (انظر جدول المواد) وكشف الغشاء.
  4. أداء تنقية OMV-RBD.
    1. قم بتخفيف 1 مل من محلول OMV-RBD المتفاعل إلى 10 مل ، وجهاز الطرد المركزي للتخفيف عند 150000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
    2. استخدم ماصة للتخلص من المادة الطافية وتعليق البقايا ب 10 مل من PBS. جهاز طرد مركزي للتعليق عند 150000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
    3. تخلص من المادة الطافية وقم بتعليق البقايا مع 1 مل من PBS.
      ملاحظة: إذا كانت قابلية ذوبان المستضد أقل بكثير ، فيمكن تحقيق نفس تأثير الفصل عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم19.

5. التوصيف

  1. إجراء تشتت الضوء الديناميكي (DLS).
    1. قم بتخفيف العينات إلى تركيز 100 ميكروغرام / مل وأضف 1 مل من العينة إلى خلية العينة.
    2. اختر "الحجم" ل "نوع القياس" ، و "البروتين" ل "مادة العينة" ، و "الماء" ل "المشتت" ، و "25 درجة مئوية" ل "درجة الحرارة" ، ثم قم بتحميل العينات والقياس تلقائيا23.
  2. التقط الصور باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM).
    1. تمييع العينات إلى 100 ميكروغرام / مل. خذ شبكة نحاسية من 200 شبكة ، وأضف 20 ميكرولتر من العينة إليها ، واتركها تمتص لمدة 10 دقائق.
    2. استخدم ورق الترشيح لفتيل المحلول ، وأضف 20 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل 3٪ إلى فيلم الدعم ، وقم بتلطيخه لمدة 30 ثانية.
    3. خلات اليورانيل وتجفيف الفيلم بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    4. قم بتحميل العينات إلى نظام TEM (انظر جدول المواد) والتقط الصور بجهد 80 كيلو فولت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 1 المخطط الانسيابي لهذا البروتوكول. يمكن أن يكون هذا البروتوكول نهجا عاما لاستخدام OMVs كمنصة لقاح. يحتاج المرء فقط إلى اختيار أنظمة التعبير المناسبة بناء على نوع المستضدات.

يوفر الشكل 2 مخطط تصميم بلازميد ممكن. يرتبط جين SC بجين ClyA عبر رابط مرن ، بينما يتصل ST بالطرف 5 'من جين RBD مع جين His-tag للتنقية والتحقق. أظهرت اللطخة الغربية أن التفاعل يكتمل تدريجيا مع زيادة OMV-SC (الشكل 3 أ). بعد الطرد المركزي الفائق ، بقي كل RBD-ST غير المتفاعل تقريبا في المادة الطافية. لم يوفر الطرد المركزي الفائق الثاني ميزة كبيرة أخرى على المرة الأولى (الشكل 3 ب).

تم تحديد توزيع حجم الجسيمات بواسطة DLS (الشكل 4). كان متوسط القطر الهيدروديناميكي Z ل OMV-SC 133 نانومتر ، بينما كان 152.6 نانومتر ل OMV-RBD (الجدول 1). قد تكون هذه الاختلافات بسبب RBD يزيد من حجم جسيمات OMV بعد العرض المكثف. تتوافق نتائج TEM (الشكل 5) مع نتائج DLS. أظهرت الصور أن OMVs لها دائما بنية كروية قياسية ، سواء كانت متصلة ب RBD أم لا. يشير هذا إلى أن ظروف الاستخراج والتفاعل والتنقية مواتية للحفاظ على النشاط البيولوجي ل OMVs.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي لإعداد OMV-RBD. تم تحويل بلازميد ClyA-SC إلى E.coli ، بينما تم نقل بلازميد RBD-ST إلى خلايا HEK293F. بعد فترة من الزراعة ، تم عزل وتنقية OMV-SC و RBD-ST. بعد الاقتران الحيوي في المخزن المؤقت التقليدي والطرد المركزي الفائق ، تم الحصول على OMV-RBD. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: ملامح البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة. أ: بلازميد pThioHisA ClyA-SC. (ب) بلازميد PCDNA RBD-ST. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: التحقق من OMV-RBD بواسطة اللطخة الغربية. (أ) استكشاف نسبة التفاعل بين OMV-SC و RBD-ST باستخدام Anti-6x HisTag. M: علامة الوزن الجزيئي 1: OMV-SC ؛ 2: RBD-ST ؛ 3: OMV: RBD = 10: 1 (وزن / وزن) ؛ 4: OMV: RBD = 20: 1 ؛ 5: OMV: RBD = 40: 1. (ب) التحقق من كفاءة الطرد المركزي الفائق باستخدام HisTag المضاد ل 6x. M: علامة الوزن الجزيئي 1: OMV-SC ؛ 2: OMV-RBD قبل الطرد المركزي الفائق. 3: RBD-ST ؛ 4: طاف بعد أول طرد مركزي فائق ؛ 5: ترسب بعد الطرد المركزي الفائق الأول ؛ 6: طافي بعد الطرد المركزي الثاني ؛ 7: ترسب بعد الطرد المركزي الفائق الثاني. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: توزيع حجم الجسيمات المقاس بواسطة DLS . (أ) OMV-SC. (ب) OMV-RBD. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تصور OMVs بواسطة TEM. (A) OMV-SC (200 ميكروغرام / مل). (ب) OMV-RBD (200 ميكروغرام/مل). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اسم العينة درجة الحرارة (°C) Z-Ave (d.nm) بي دي آي
OMV-SC 25 133 0.483
OMV-RBD 24.9 152.6 0.569

الجدول 1: المعلمات المقاسة بواسطة DLS.

الملف التكميلي 1: تسلسلات البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لإنشاء منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" ، تم التعبير عن ClyA المنصهر SC في سلالات BL21 (DE3) ، والتي تعد واحدة من أكثر النماذج استخداما لإنتاج البروتين المؤتلف بسبب مزاياها في التعبير البروتيني24 ، بحيث يكون هناك ما يكفي من شظايا SC المعروضة على سطح OMVs أثناء عملية انتشار البكتيريا. في الوقت نفسه ، تم إعداد مستضد مستهدف منصهر ST للاقتران الكيميائي بين المستضدات و OMVs. تنعكس مزايا هذا المخطط التجريبي وآفاق التطبيق المستقبلي بشكل أساسي في ثلاثة جوانب. أولا ، يتم تحقيق نظام "التوصيل والعرض" للمستضدات المختلفة والجسيمات النانوية البيولوجية. يمكن أن تكون عملية التفاعل والتنقية سريعة ومباشرة ، والتي لها مزايا كبيرة في تطوير لقاحات للأمراض المعدية الناشئة وغيرها من السيناريوهات. ثانيا ، يحقق هدف عرض مستضد عالي الكثافة ويوفر طريقة تصميم لقاح لبعض المستضدات ذات المناعة المنخفضة. ثالثا ، يعد التعبير الفردي ل OMVs و RBD (البروتين المستضدي) مفيدا لضمان نشاط مستضد مرتفع لأن أنظمة التعبير بدائية النواة التقليدية تفتقر إلى وظائف مثل العوامل المساعدة المعينة ، والمرافقين الجزيئيين ، وتعديلات ما بعد الترجمة ، مما قد يؤدي إلى فقدان البروتين واختلاله.

في عملية بناء البلازميد ، تم اختيار ClyA كهدف للاتصال ب SC ويرجع ذلك أساسا إلى الهيكل الفضفاض على شكل برميل للمحطة C ل ClyA. أظهرت الدراسات أن الناقل الذاتي للهيموغلوبين البروتيني (Hbp) يمكنه عرض مستضدات من الالتهاب الرئوي العقدية والمتفطرة السلية25,26. خلاف ذلك ، إذا كان المستضد المراد عرضه من بدائية النواة ، فمن الممكن بناء المستضدات مباشرة في الطرف C ل ClyA دون استخدام اقتران SC / ST. قد تؤدي هذه الطريقة إلى OMVs ذات كثافة عرض أعلى ، ولكن لا يزال هناك خطر من أن البروتينات المستضدية لن تطوى بشكل صحيح. من المهم ملاحظة أنه يجب تصميم رابط مرن واستخدامه عند إدخال SC / ST في الجزء المستهدف ، مما يساعد على تحسين كفاءة التفاعل بين SC و ST. كان تسلسل الرابط المستخدم هنا هو GSGGSGGSGTG ، ويمكن أيضا تحديد روابط مرنة أخرى.

بالإضافة إلى نظام SC / ST لاقتران كيمياء النقر ، يستخدم Snooptag / Snoopcatcher واقتران Sortase A بشكل شائع للاقتران التساهمي بين البروتينات27,28. وفي الوقت نفسه، أفيد أيضا بأن إدخال عدة نظم ربط مختلفة على نفس الناقل29 أو استخدام نفس نظام الربط لمستضدات متعددة19 يمكن أن يحقق الغرض من عرض مستضدات متعددة غير متجانسة على نفس الناقل، ومن ثم يمكن تحضير لقاحات متعددة التكافؤ أو متعددة الوظائف.

تحد السمية الخلوية العالية والعائد المنخفض من الاستخدام الواسع النطاق ل OMVs كمنصات لقاح 4,30. تم التخلص من بعض الجينات المرتبطة ب LPS في السلالة المستخدمة في هذا البروتوكول ، وفقا للأدبيات ذات الصلة31،32،33 ، من أجل تقليل السمية الخلوية ل OMVs. يمكن استخراج 1.18 ملغ من OMVs من كل 1 لتر من المحلول البكتيري بالطريقة المقدمة في هذا البروتوكول. لا يزال العائد أقل من محصول بعض السلالات المعدلة وراثيا عالية إنتاج الحويصلات34. إذا لزم الأمر ، يمكن أن يؤدي التجانس عالي الضغط أيضا إلى تعزيز إنبات الغشاء البكتيري لإنتاج المزيد من OMVs ، والتي يمكن أن تحقق إنتاجية محسنة وكثافة عرض في نفس الوقت35.

تعتبر ظروف الحث حاسمة لكثافة SC المعروضة على سطح OMVs. راقبنا تعبير البروتين المستهدف من خلال SDS-PAGE ثم فحصنا حالة الحث ، وهي خفيفة نسبيا وتعبر عن المزيد من البروتين. قد تتطلب البروتينات المختلفة ظروف تحريض مختلفة ، وقد تؤدي التغييرات في ظروف الحث إلى اختلافات في كثافة SC المعروضة على سطح OMVs. يقترح تعديل نسبة المستضد والناقل بعد تغيير الظروف التجريبية لاستكشاف نسبة التفاعل الأنسب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحقيق تنقية OMV-RBD عن طريق SEM أو الطرد المركزي الفائق. تمت تجربة كلتا الطريقتين. الطرد المركزي الفائق أكثر ملاءمة ، وكان OMV الناتج نقاء مشابها لبروتوكول SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الرئيسي لمؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ومشروع المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 31670936، 82041045).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin sodium Sangon Biotech A610028
Automated cell counter Countstar BioTech
BCA protein quantification Kit cwbio cw0014s
ChemiDoc Touching Imaging System Bio-rad
Danamic Light Scattering Malvern Zetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatus Cavoy Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST Buffer Sangon Biotech C520009
Goat pAb to mouse IgG1 Abcam ab97240
High speed freezing centrifuge Bioridge H2500R
His-Tag mouse mAb Cell signaling technology 2366s
Imidazole Sangon Biotech A600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Sangon Biotech A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow Qiagen 70691
Non-fat powdered milk Sangon Biotech A600669
OPM-293 cell culture medium Opm biosciences 81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmid Wuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer saline ZSGB-bio ZLI-9061
Polyethylenimine Linear Polysciences 23966-1
Prestained protein ladder Thermo 26616
pThioHisA ClyA-SC plasmid Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting Membranes Roche 03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x) Beyotime P0015
Sodium chloride Sangon Biotech A100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) Thermo 34577
Suspension instrument Life Technology Hula Mixer
Transmission Electron Microscope Hitachi HT7800
Tryptone Oxoid LP0042B
Ultracentrifuge Beckman coulter XPN-100
Ultraviolet spectrophotometer Hitachi U-3900
Yeast extract Sangon Biotech A610961

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
  2. Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. 50, 101433 (2020).
  3. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  4. Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
  5. Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
  6. Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
  7. Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
  8. Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
  9. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
  10. Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
  11. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  12. Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
  13. Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
  14. Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
  15. Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
  16. Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
  17. Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
  18. Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
  19. Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
  20. Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
  21. Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
  22. Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
  23. Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
  24. Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
  25. Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
  26. Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
  27. Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
  28. Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
  29. van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
  30. Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
  31. Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
  32. Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
  33. Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
  34. Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
  35. Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 185،
منصة لقاح الجسيمات النانوية "التوصيل والعرض" القائمة على حويصلات الغشاء الخارجي التي تعرض مجال ربط مستقبلات SARS-CoV-2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, R., Li, G. C., Jing, H. M.,… More

Feng, R., Li, G. C., Jing, H. M., Liu, C., Xue, R. Y., Zou, Q. M., Li, H. B. A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain. J. Vis. Exp. (185), e64213, doi:10.3791/64213 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter