Summary
Detta protokoll beskriver biotekniken av yttre membranblåsor som en "Plug-and-Display" -vaccinplattform, inklusive produktion, rening, biokonjugering och karakterisering.
Abstract
Biomimetiska nanopartiklar från bakterier eller virus har väckt stort intresse för forskning och utveckling av vaccin. Yttre membranblåsor (OMV) utsöndras huvudsakligen av gramnegativa bakterier under genomsnittlig tillväxt, med en diameter i nanostorlek och självadjuvansaktivitet, vilket kan vara idealiskt för vaccinleverans. OMV har fungerat som ett mångfacetterat leveranssystem för proteiner, nukleinsyror och små molekyler. För att dra full nytta av de biologiska egenskaperna hos OMV användes biotekniska Escherichia coli-härledda OMV som bärare och SARS-CoV-2-receptorbindande domän (RBD) som ett antigen för att konstruera en "Plug-and-Display" -vaccinplattform. Domänerna SpyCatcher (SC) och SpyTag (ST) i Streptococcus pyogenes användes för att konjugera OMV och RBD. Cytolysin A (ClyA) -genen översattes med SC-genen som ett fusionsprotein efter plasmidtransfektion och lämnade ett reaktivt ställe på ytan av OMV: erna. Efter blandning av RBD-ST i ett konventionellt buffertsystem över natten bildades kovalent bindning mellan OMV och RBD. Således uppnåddes ett multivalent visande OMV-vaccin. Genom att ersätta med olika antigener kan OMV-vaccinplattformen effektivt visa en mängd heterogena antigener och därigenom potentiellt snabbt förhindra infektionssjukdomsepidemier. Detta protokoll beskriver en exakt metod för att konstruera OMV-vaccinplattformen, inklusive produktion, rening, biokonjugering och karakterisering.
Introduction
Som en potentiell vaccinplattform har yttre membranblåsor (OMV) väckt mer och mer uppmärksamhet de senaste åren 1,2. OMV, som huvudsakligen utsöndras naturligt av gramnegativa bakterier3, är sfäriska partiklar i nanoskala som består av ett lipid-dubbelskikt, vanligtvis i storleken 20-300 nm4. OMV innehåller olika bakteriella komponenter från föräldrar, inklusive bakteriella antigener och patogenassocierade molekylära mönster (PAMP), som fungerar som fasta immunpotentiatorer5. Genom att dra nytta av deras unika komponenter, naturliga vesikelstruktur och fantastiska gentekniska modifieringsställen har OMV utvecklats för användning inom många biomedicinska områden, inklusive bakterievacciner6, adjuvanser7, cancerimmunterapiläkemedel8, läkemedelsleveransvektorer9 och antibakteriella lim10.
SARS-CoV-2-pandemin, som har spridit sig över hela världen sedan 2020, har tagit hårt på det globala samhället. Den receptorbindande domänen (RBD) i spikprotein (S-protein) kan binda med humant angiotensinkonverterande enzym 2 (ACE2), som sedan förmedlar virusets inträde i cellen11,12,13. Således verkar RBD vara ett främsta mål för vaccinupptäckt14,15,16. Monomer RBD är dock dåligt immunogen, och dess lilla molekylvikt gör det svårt för immunsystemet att känna igen, så adjuvanser krävs ofta17.
För att öka immunogeniciteten hos RBD konstruerades OMV som visade polyvalenta RBD: er. Befintliga studier som använder OMV för att visa RBD förenar vanligtvis RBD med OMV för att uttryckas i bakterier18. RBD är emellertid ett virus-härledd protein, och prokaryot uttryck kommer sannolikt att påverka dess aktivitet. För att lösa detta problem användes SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) -systemet, härrörande från Streptococcus pyogenes, för att bilda en kovalent isopeptid med OMV och RBD i ett konventionellt buffertsystem19. SC-domänen uttrycktes med Cytolysin A (ClyA) som ett fusionsprotein av bioengineered Escherichia coli, och ST uttrycktes med RBD via HEK293F cellulärt uttryckssystem. OMV-SC och RBD-ST blandades och inkuberades över natten. Efter rening genom ultracentrifugering eller storleksuteslutningskromatografi (SEC) ERHÖLLS OMV-RBD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid konstruktion
- Sätt in DNA-kodande SpyCatcher-sekvens (tilläggsfil 1) i en ampicillinresistent pThioHisA-ClyA-plasmid (se materialförteckning) mellan BamH I- och Sal I-platserna för att konstruera plasmiden pThioHisA ClyA-SC efter en tidigare publicerad rapport20.
- Ligate den syntetiserade SpyTag-RBD-Histag-fusionsgenen (Supplementary File 1) till en pcDNA3.1-plasmid (se materialtabell) mellan BamH I- och EcoR I-platserna för att konstruera plasmiden pcDNA3.1 RBD-ST efter en tidigare publicerad rapport19.
2. OMV-SC-förberedelse
- Utför ClyA-SC-omvandling enligt stegen nedan.
- Tillsätt 5 μL pThioHisA ClyA-SC plasmidlösning (50 ng/μL) till 50 μL BL21 kompetent stam, blås försiktigt och låt svalna på is i 30 minuter.
- Placera lösningen i 90 s i vattenbadet vid 42 °C och lägg sedan omedelbart den blandade lösningen på is i 3 minuter.
- Tillsätt 500 μl LB-medium till bakteriesuspensionen och odla efter blandning vid 220 rpm vid 37 °C i 1 timme.
- Platta all transformation på en LB-agarplatta som innehåller ampicillin (100 μg/ml, se materialtabell) och odla över natten vid 37 °C.
OBS: I efterföljande experiment hölls ampicillinet i samma koncentration i mediet. Om inte, kan detta orsaka förlust av plasmider i bakterierna.
- För OMV-SC-produktion utför du stegen nedan.
- Isolera en enda koloni från plattan (steg 2.1.4.) till 20 ml LB (ampicillinresistent) medium och odling över natten vid 220 rpm vid 37 °C.
- Inokulera bakterielösningen (från steg 2.2.1.) till 2 L medium, odla vid 220 rpm, 37 °C i 5 timmar fram till det logaritmiska tillväxtstadiet (OD600nm är mellan 0,6 och 0,8).
- När OD vid 600 nm av bakterielösningen når 0,6-0,8, tillsätt isopropyl beta-D-tiogalaktopyranosid (IPTG, se materialtabell) för att göra den slutliga koncentrationen av bakterielösningen till 0,5 mM och odla sedan över natten vid 220 rpm vid 25 °C.
- Utför OMV-SC-rening.
- Centrifugera bakterielösningen vid 7 000 x g vid 4 °C i 30 minuter.
- Filtrera supernatanten med ett 0,22 μm membranfilter och koncentrera den sedan med ett 100 kD ultrafiltreringsmembran eller ihålig fiberkolonn (se Materialförteckning).
- Filtrera koncentratet genom ett 0,22 μm membranfilter, centrifugera det sedan vid 150 000 x g vid 4 °C i 2 timmar med hjälp av en ultracentrifug (se materialtabell) och kassera supernatanten med en pipett.
- Återsuspendera nederbörden med PBS och förvara den vid −80 °C. Lösningen kan bibehålla långsiktig stabilitet vid −80 °C.
3. RBD-ST-förberedelse
- Utför RBD-ST-transfektion enligt stegen nedan.
- Välj ett lämpligt eukaryot uttryckssystem (t.ex. HEK293F) och odla cellerna över natten vid 130 rpm vid 37 °C efter återhämtning.
- Tillsätt 20 μL HEK293F-celllösning i den automatiska cellräknaren (se materialförteckning), registrera antalet celler, justera koncentrationen till 1 x 106 celler/ml och odla sedan cellerna vid 130 rpm vid 37 °C i 4 timmar.
- Filtrera RBD-ST-plasmid genom ett 0,22 μm membranfilter och tillsätt 300 μg plasmider i cellodlingsmediet (se materialförteckning) tills den slutliga volymen är 10 ml; skaka i 10 s.
- Värm PEI (1 mg/ml, se materialtabell) till 65 °C i vattenbadet, blanda 0,7 ml PEI med 9,3 ml cellodlingsmedium och skaka intermittent i 10 s.
OBS: Skaka inte lösningen kraftigt. Annars kan de resulterande bubblorna påverka transfektionseffektiviteten. - Tillsätt plasmidlösning till PEI-lösningen, skaka blandningen intermittent i 10 s och inkubera den vid 37 °C i 15 minuter.
- Tillsätt blandningen till 280 ml cellodlingsmedium och odling vid 130 rpm vid 37 °C i 5 dagar.
- Utför RBD-ST-rening.
- Centrifugera cellerna vid 6 000 x g vid 25 °C i 20 minuter och använd en pipett för att samla upp supernatanten.
- Fyll kolonnen med 2 ml Ni-NTA-agaros (se materialtabell) och tvätta den 3x med 3x PBS.
- Tillsätt imidazol (se materialtabell) i cellsupernatanten för att göra den slutliga koncentrationen på 20 mM och ladda cellen supernatant 2x.
- Tillsätt 3 kolonnvolymer (CV) PBS som innehåller 20 mM imidazol för tvätt och samla tvättfraktionen.
- Gradientelut med 3 CV PBS innehållande låga till höga koncentrationer (t.ex. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) av imidazol; elute 2x för varje koncentration.
- Använd SDS-PAGE21 för att identifiera RBD-ST i olika koncentrationsgradienter.
4. OMV-RBD biokonjugering och rening
- Bestäm proteinkoncentrationen med BCA-metoden (se materialförteckning).
- Späd den vanliga BSA-proteinlösningen seriellt från 2 mg / ml till 0,0625 mg / ml, späd de renade OMV-SC och RBD-ST 10x och blanda sedan BCA-arbetslösningarna A och B (tillhandahålls i analyssatsen) i förhållandet 50: 1 (v / v).
- Tillsätt utspädd proteinlösning (25 μl/brunn) och blanda med BCA-arbetslösning (200 μl/brunn); inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
- Mät absorbansen (OD) vid 562 nm för varje brunn och beräkna proteinkoncentrationen från standardkurvan22.
- Utför biokonjugering av OMV-SC och RBD-ST enligt stegen nedan.
- Blanda OMV-SC och RBD-ST i PBS i förhållandet 40:1 (w/w).
- Rotera vertikalt för att blanda blandningen över natten vid 15 rpm vid 4 °C.
OBS: Olika antigener kan reagera i olika proportioner. Man kan prova olika reaktionsförhållanden baserat på antigenets egenskaper.
- Verifiera reaktionseffektiviteten.
- Bered 10 μl OMV-SC, RBD-ST och reaktionsprodukten (steg 4.2.). Tillsätt 2,5 μl 5x laddningsbuffert (se materialtabell) och värm proverna vid 100 °C i 5 minuter. Fyll proverna i gelén (10 μl/brunn). Utför elektrofores vid 60 V i 20 min och ändra tillståndet till 120 V i 1 h.
- Överför proteinet från gelén till PVDF western blotting membranes (se materialtabell) vid 100 V i 70 min.
- Sätt membranet i 5% fettfri mjölkpulver/TBST och skaka i 1 timme. Tvätta sedan 3x med TBST i 5 min per tvätt med skakning.
- Sätt membranet i 0,1% His-Tag-antikropp/TBST (se materialtabell) och skaka i 1 h, tvätta sedan 3x med TBST i 5 min per tvätt med skakning.
- Sätt membranet i 0,02% antimus-IgG1-antikropp (HRP)/TBST (se materialtabell) och skaka i 40 min, tvätta sedan 3x med TBST i 5 min per tvätt med skakning.
- Tillsätt förbättrad kemiluminescenslösning (se materialtabell) och exponera membranet.
- Utför rening av OMV-RBD.
- Späd 1 ml reagerad OMV-RBD-lösning till 10 ml och centrifugera utspädningen vid 150 000 x g vid 4 °C i 2 timmar.
- Använd en pipett för att kasta supernatanten och suspendera återstoden med 10 ml PBS. Centrifugera suspensionen vid 150 000 x g vid 4 °C i 2 timmar.
- Kassera supernatanten och suspendera återstoden med 1 ml PBS.
OBS: Om antigenets löslighet är mycket lägre kan samma separationseffekt uppnås genom storleksuteslutningskromatografi19.
5. Karakterisering
- Utför dynamisk ljusspridning (DLS).
- Späd proverna till en koncentration på 100 μg/ml och tillsätt 1 ml prov i provcellen.
- Välj "Storlek" för "Mättyp", "Protein" för "Provmaterial", "Vatten" för "Dispergeringsmedel", "25 °C" för "Temperatur" och ladda sedan prover och mät automatiskt23.
- Ta bilder med transmissionselektronmikroskopi (TEM).
- Späd proverna till 100 μg/ml. Ta ett kopparnät med 200 maskor, tillsätt 20 μl prov till det och låt det absorberas i 10 minuter.
- Använd filterpapper för att transportera bort lösningen, tillsätt 20 μl 3% uranylacetat till stödfilmen och fläcka i 30 s.
- Led av uranylacetatet och torka filmen naturligt vid rumstemperatur i 1 h.
- Ladda proverna till TEM-systemet (se Materialförteckning) och ta bilder vid 80 kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flödesschemat för detta protokoll visas i figur 1. Detta protokoll kan vara ett allmänt tillvägagångssätt för att använda OMV som en vaccinplattform; man behöver bara välja lämpliga uttryckssystem baserat på typen av antigener.
Figur 2 ger ett genomförbart plasmiddesignschema. SC-genen är kopplad till ClyA-genen via en flexibel länkare, medan ST ansluter till 5'-terminalen i RBD-genen med en His-tag-gen för rening och verifiering. Western blot visade att reaktionen gradvis avslutas med ökande OMV-SC (Figur 3A). Efter ultracentrifugering förblev nästan alla oreagerade RBD-ST i supernatanten. Den andra ultracentrifugeringen gav inte ytterligare någon signifikant fördel jämfört med första gången (figur 3B).
Fördelningen av partikelstorlek bestämdes av DLS (figur 4). Den Z-genomsnittliga hydrodynamiska diametern för OMV-SC var 133 nm, medan den var 152,6 nm för OMV-RBD (tabell 1). Dessa skillnader kan bero på att RBD ökar OMV-partikelstorleken efter intensiv visning. Resultaten av TEM (figur 5) överensstämmer med DLS-resultaten. Bilderna visade att OMV: erna alltid har en standard sfärisk struktur, oavsett om de är anslutna till RBD eller inte. Detta indikerar att extraktions-, reaktions- och reningsförhållandena bidrar till att upprätthålla den biologiska aktiviteten hos OMV.
Figur 1: Flödesschema för OMV-RBD-beredning. ClyA-SC-plasmiden omvandlades till E.coli, medan RBD-ST-plasmiden transfekterades till HEK293F-celler. Efter en period av odling isolerades och renades OMV-SC och RBD-ST. Efter biokonjugering i konventionell buffert och ultracentrifugering erhölls OMV-RBD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: De plasmidprofiler som används i denna studie. (A) pThioHisA ClyA-SC plasmid. b) pcDNA RBD-ST plasmid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Verifiering av OMV-RBD med western blot. (A) Utforskningen av reaktionsförhållandet mellan OMV-SC och RBD-ST med anti-6x HisTag. M: molekylviktsmarkör 1: OMV-SC; 2: RBD-ST; 3: OMV: RBD = 10: 1 (w / w); 4: OMV: RBD = 20: 1; 5: OMV:RBD = 40:1. (B) Validering av effektiviteten av ultracentrifugering med anti-6x HisTag. M: molekylviktsmarkör 1: OMV-SC; 2: OMV-RBD pre-ultracentrifugering; 3: RBD-ST; 4: supernatant efter första ultracentrifugering; 5: fällning efter första ultracentrifugering; 6: supernatant efter andra ultracentrifugering; 7: fällning efter andra ultracentrifugering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Partikelstorleksfördelning mätt med DLS . (A) OMV-SC. (B) OMV-RBD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Visualisering av OMV med TEM. (A) OMV-SC (200 μg/ml). B) OMV-RBD (200 μg/ml). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Exempel på namn | Temperatur (°C) | Z-Ave (d.nm) | Pdi |
| OMV-SC | 25 | 133 | 0.483 |
| OMV-RBD | 24.9 | 152.6 | 0.569 |
Tabell 1: Parametrar uppmätta med DLS.
Tilläggsfil 1: Plasmidsekvenser som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att skapa en "Plug-and-Display" nanopartikelvaccinplattform uttrycktes SC-smält ClyA i BL21 (DE3) stammar, som är en av de mest använda modellerna för rekombinant proteinproduktion på grund av dess fördelar i proteinuttryck24, så att det skulle finnas tillräckligt med SC-fragment som visas på ytan av OMV: erna under processen med bakteriespridning. Samtidigt framställdes ett ST-smält målantigen för den kemiska kopplingen mellan antigenerna och OMV. Fördelarna med detta experimentella system och framtida tillämpningsmöjligheter återspeglas huvudsakligen i tre aspekter. Först realiseras "Plug-and-Display" -systemet för olika antigener och biologiska nanopartiklar. Reaktions- och reningsprocessen kan vara snabb och enkel, vilket har betydande fördelar när det gäller att utveckla vacciner för framväxande infektionssjukdomar och andra scenarier. För det andra uppnår det målet att visa antigen med hög densitet och tillhandahåller en vaccindesignmetod för vissa antigener med låg immunogenicitet. För det tredje är det individuella uttrycket av OMV och RBD (antigent protein) fördelaktigt för att säkerställa hög antigenaktivitet eftersom konventionella prokaryota uttryckssystem saknar funktioner som särskilda kofaktorer, molekylära chaperoner och post-translationella modifieringar, vilket kan leda till proteinförlust och felveckning.
Under processen med plasmidkonstruktion valdes ClyA som ett mål för att ansluta till SC huvudsakligen på grund av den lösa fatformade strukturen hos C-terminalen i ClyA. Studier har visat att autotransportören hemoglobinproteas (Hbp) kan visa antigener från Streptococcus lunginflammation och Mycobacterium tuberculosis25,26. Annars, om antigenet som ska visas är från en prokaryot, är det möjligt att konstruera antigenerna direkt i C-terminalen för ClyA utan att använda SC / ST-konjugering. Denna metod kan resultera i OMV med högre visningstäthet, men det finns fortfarande en risk att de antigena proteinerna inte viks korrekt. Det är viktigt att notera att en flexibel länkare måste utformas och användas när SC / ST sätts in i målfragmentet, vilket hjälper till att förbättra reaktionseffektiviteten mellan SC och ST. Länksekvensen som användes här var GSGGSGGSGTG, och andra flexibla länkare kan också väljas.
Förutom SC/ST-systemet för klickkemikonjugering används också Snooptag/Snoopcatcher och Sortase A-konjugering för kovalent konjugering mellan proteiner27,28. Samtidigt har det också rapporterats att införandet av flera olika länksystem på samma vektor29 eller användningen av samma kopplingssystem för flera antigener19 kan uppnå syftet att visa flera heterologa antigener på samma vektor, och sedan kan polyvalenta eller multifunktionella vacciner framställas.
Hög cytotoxicitet och lågt utbyte begränsar den utbredda användningen av OMV som vaccinplattformar 4,30. Vissa LPS-relaterade gener har slagits ut i stammen som används i detta protokoll, enligt relevant litteratur31,32,33, för att minska cytotoxiciteten hos OMV. 1,18 mg OMV kan extraheras från varje 1 liter av bakterielösningen med den metod som införs i detta protokoll. Utbytet är fortfarande lägre än för vissa genetiskt modifierade högvesikelproducerande stammar34. Vid behov kan högtryckshomogenisering också främja spiring av bakteriemembranet för att producera fler OMV, vilket kan uppnå förbättrat utbyte och visningstäthet samtidigt35.
Induktionsförhållandena är avgörande för densiteten hos SC som visas på OMV: s yta. Vi övervakade uttrycket av målproteinet genom SDS-PAGE och screenade sedan ut induktionstillståndet, som är relativt milt och uttrycker mer protein. Olika proteiner kan kräva olika induktionsförhållanden, och förändringar i induktionsförhållandena kan leda till skillnader i densiteten hos SC som visas på ytan av OMV: erna. Justering av antigen- och bärarförhållandet efter att de experimentella förhållandena har ändrats för att utforska det mest lämpliga reaktionsförhållandet föreslås. Dessutom kan rening av OMV-RBD uppnås genom SEM eller ultracentrifugering. Båda metoderna prövades; ultracentrifugering är bekvämare, och den resulterande OMV hade en renhet som liknar SEM-protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av nyckelprogrammet för Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) och Chinese National Natural Science Foundation Project (nr 31670936, 82041045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin sodium | Sangon Biotech | A610028 | |
| Automated cell counter | Countstar | BioTech | |
| BCA protein quantification Kit | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc Touching Imaging System | Bio-rad | ||
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| Electrophoresis apparatus | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| Goat pAb to mouse IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| High speed freezing centrifuge | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag mouse mAb | Cell signaling technology | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | A600277 | |
| Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside | Sangon Biotech | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| Non-fat powdered milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| OPM-293 cell culture medium | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Polyethylenimine Linear | Polysciences | 23966-1 | |
| Prestained protein ladder | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC plasmid | Wuhan genecreat biological techenology | ||
| PVDF Western Blotting Membranes | Roche | 03010040001 | |
| Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column) | GE healthcare | ||
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Beyotime | P0015 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution) | Thermo | 34577 | |
| Suspension instrument | Life Technology | Hula Mixer | |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | HT7800 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | XPN-100 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A610961 |
References
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A.
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications. Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).
- Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles. Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).
- Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines. Frontiers in Immunology. 10, 683 (2019).
- Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).
- Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy. Cancers. 11 (9), 1314 (2019).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).
- Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy. Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Robbiani, D. F., et al. Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).
- Wang, M. Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- Yang, S., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials. The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).
- Wang, Z., et al. mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants. Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).
- Amanat, F., et al. SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2. Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).
- Tan, H. X., et al. Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques. Nature Communication. 12 (1), 1403 (2021).
- Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2. Frontiers in Microbiology. 12, 752739 (2021).
- Ma, X., et al. Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses. Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).
- Yang, Z., et al. RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2. Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).
- Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples. Journal of Visualized Experiments. (123), e55341 (2017).
- Arslan, A., et al. Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum. Journal of Visualized Experiments. (178), e63001 (2021).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification. Journal of Visualized Experiments. (117), e54458 (2016).
- Kim, S., et al. Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3). Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).
- Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach. Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).
- Kuipers, K., et al. Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization. Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).
- Veggiani, G., et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).
- Saunders, K. O., et al. Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses. Nature. 594, 553-559 (2021).
- van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles. Frontiers in Microbiology. 11, 890 (2020).
- Needham, B. D., et al. Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).
- Zanella, I., et al. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066 (2021).
- Wang, J. L., et al. Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).
- Liu, Q., et al. Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge. Scientific Reports. 6, 34776 (2016).
- Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development. Frontiers in Microbiology. 12, 629090 (2021).
- Hua, L., et al. A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity. Advanced Materials. 33 (43), 2103923 (2021).
