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Genetics

सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में प्रॉक्सिमिटी लिगेशन और क्वांटिटेटिव पीसीआर के माध्यम से होमोलोगस रिकॉम्बिनेशन इंटरमीडिएट्स का पता लगाना

Published: September 11, 2022 doi: 10.3791/64240
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

Summary

डी-लूप कैप्चर (डीएलसी) और डी-लूप एक्सटेंशन (डीएलई) परख मात्रात्मक पीसीआर के साथ निकटता बंधाव के सिद्धांत का उपयोग करते हैं ताकि डी-लूप गठन, डी-लूप एक्सटेंशन और सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में एक इंड्यूसेबल डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक की साइट पर उत्पाद गठन की मात्रा निर्धारित की जा सके।

Abstract

सेल चक्र के एस और जी 2 चरणों के दौरान डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक और इंटर-स्ट्रैंड क्रॉस-लिंक सहित डीएनए क्षति की मरम्मत समरूप पुनर्संयोजन (एचआर) द्वारा की जा सकती है। इसके अलावा, एचआर रुकावट या पतन के बाद प्रतिकृति फोर्क बचाव के एक महत्वपूर्ण तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है। इस जटिल मार्ग के कई प्रतिवर्ती और अपरिवर्तनीय चरणों का विनियमन इसकी निष्ठा को बढ़ावा देता है। एचआर के दौरान गठित पुनर्संयोजन मध्यवर्ती का भौतिक विश्लेषण विभिन्न न्यूक्लियोप्रोटीन कारकों और उनके इंटरएक्टर्स द्वारा इन नियंत्रणों के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है। यद्यपि पुनर्संयोजन मार्ग में विशिष्ट घटनाओं और मध्यवर्ती की परख करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित तरीके हैं, लेकिन डी-लूप गठन और विस्तार का पता लगाना, इस मार्ग में दो महत्वपूर्ण कदम, हाल ही में चुनौतीपूर्ण साबित हुए हैं। यहां, एचआर मार्ग में प्रमुख घटनाओं का पता लगाने के लिए कुशल तरीके, अर्थात् डीएनए डबल-फंसे ब्रेक गठन, डी-लूप गठन, डी-लूप एक्सटेंशन, और सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में ब्रेक-प्रेरित प्रतिकृति (बीआईआर) के माध्यम से उत्पादों का गठन वर्णित है। ये परख उच्च संवेदनशीलता वाले उनके प्रासंगिक पुनर्संयोजन मध्यवर्ती और उत्पादों का पता लगाते हैं और सेलुलर व्यवहार्यता से स्वतंत्र होते हैं। डी-लूप, डी-लूप एक्सटेंशन और बीआईआर उत्पाद का पता लगाना निकटता बंधाव पर आधारित है। साथ में, ये परख जनसंख्या स्तर पर एचआर के कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं ताकि मार्ग में महत्वपूर्ण चरणों में एचआर प्रोटीन और नियामकों के कार्यों को बारीकी से संबोधित किया जा सके।

Introduction

होमोलोगस रिकॉम्बिनेशन (एचआर) डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी), इंटर-स्ट्रैंड क्रॉस-लिंक और एसएसडीएनए अंतराल की मरम्मत के साथ-साथ डीएनए क्षति सहिष्णुता के लिए एक मार्ग का एक उच्च-निष्ठा तंत्र है। एचआर डीएनए क्षति की मरम्मत / सहिष्णुता के लिए त्रुटि-प्रवण मार्गों से भिन्न होता है, जैसे कि गैर-होमोलोगस एंड-जॉइनिंग (एनएचईजे) और ट्रांसलेशन संश्लेषण, जिसमें यह मरम्मत की घटना को टेम्पलेट करने के लिए दाता के रूप में एक बरकरार, समरूप डुप्लेक्स डीएनए का उपयोग करता है। इसके अलावा, एचआर मार्ग में कई प्रमुख मध्यवर्ती प्रतिवर्ती हैं, जिससे व्यक्तिगत मार्ग चरणों के उत्तम विनियमन की अनुमति मिलती है। सेल चक्र के एस, जी 2 और एम चरणों के दौरान, एचआर दो-अंत डीएसबी1 की मरम्मत के लिए एनएचईजे के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। इसके अलावा, प्रतिकृति से जुड़े डीएनए क्षति की मरम्मत के लिए डीएनए प्रतिकृति के लिए एचआर आवश्यक है, जिसमें एसएसडीएनए अंतराल और एक तरफा डीएसबी शामिल हैं, और डीएनए घाव बाईपास2 के तंत्र के रूप में।

मानव संसाधन मार्ग में एक महत्वपूर्ण मध्यवर्ती विस्थापन लूप, या डी-लूप (चित्रा 1) है। अंत शोधन के बाद, प्रतिक्रिया में केंद्रीय रिकोम्बिनेस, Rad51, टूटे हुए अणु के नए कटे हुए एसएसडीएनए पर लोड होता है, जिससे एक पेचदार फिलामेंट2 बनता है। Rad51 तब एक उपयुक्त समरूप दाता की पहचान करने के लिए एक होमोलॉजी खोज करता है, आमतौर पर दैहिक कोशिकाओं में बहन क्रोमैटिड। डी-लूप तब बनता है जब रैड 51-एसएसडीएनए फिलामेंट एक समरूप डुप्लेक्स डीएनए पर आक्रमण करता है, जो दाता के पूरक स्ट्रैंड के साथ टूटे हुए स्ट्रैंड के वाटसन-क्रिक बेस पेयरिंग की ओर जाता है, जो विपरीत दाता स्ट्रैंड को विस्थापित करता है। डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा टूटे हुए स्ट्रैंड के 3 'छोर का विस्तार डीएनए क्षति घटना के दौरान खो गए आधारों को बदल देता है और संश्लेषण-निर्भर स्ट्रैंड एनीलिंग (एसडीएसए), डबल-हॉलिडे जंक्शन (डीएचजे), या ब्रेक-प्रेरित प्रतिकृति (बीआईआर) एचआर उप-मार्गों के माध्यम से डीएसडीएनए उत्पाद में विस्तारित डी-लूप मध्यवर्ती के संकल्प को बढ़ावा देता है।

मानव संसाधन मार्ग में मध्यवर्ती की शारीरिक रूप से निगरानी करने वाले परख प्रत्येक चरण (यानी, मार्ग विश्लेषण) के लिए आनुवंशिक आवश्यकताओं के विश्लेषण की अनुमति देते हैं। डीएसबी गठन, अंत शोधन, डीएचजे, बीआईआर प्रतिकृति बुलबुले, और मानव संसाधन उत्पादों को दक्षिणीसोख्ता 3,4,5,6,7 द्वारा आसानी से देखा जाता है। फिर भी, दक्षिणी सोख्ता नवजात और विस्तारित डी-लूप पर रिपोर्ट करने में विफल रहता है, और, इस प्रकार, इन संयुक्त अणुओं को मज़बूती से मापने के लिए एक वैकल्पिक विधि की आवश्यकता होती है 4,8,9। नवजात डी-लूप गठन का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली रणनीति रैड 51 के क्रोमैटिन-इम्यूनोप्रेसिपेशन (सीएचआईपी) मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) 10,11 के साथ युग्मित है। हालांकि, सीएचआईपी-क्यूपीसीआर द्वारा मापा गया डीएसडीएनए के साथ Rad51 संबंध अनुक्रम होमोलॉजी और Rad51 एक्सेसरी फैक्टर Rad5410,11 से स्वतंत्र है। इसके विपरीत, यहां प्रस्तुत डी-लूप विश्लेषण की विधि का उपयोग करके एक सराहनीय संकेत, जिसे डी-लूप कैप्चर (डीएलसी) परख कहा जाता है, डीएसबी गठन, अनुक्रम होमोलॉजी, रैड 51 और रैड 51 सहायक प्रोटीन Rad52 और Rad548 पर निर्भर करता है। यह खोज कि सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया रैड 51-प्रवर्तित डी-लूप गठन विवो में Rad54 पर निर्भर करता है, कई इन विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों के साथ सहमति में है जो दर्शाता है कि नवोदित खमीर Rad51 8,12,13,14,15 द्वारा होमोलॉजी खोज और डी-लूप गठन के लिए Rad54 की आवश्यकता है।

डी-लूप एक्सटेंशन को मापने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण, मुख्य रूप से अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर के माध्यम से, इसी तरह समस्याग्रस्त हैं। डी-लूप विस्तार का पता लगाने के लिए एक विशिष्ट पीसीआर-आधारित परख एक अद्वितीय अनुक्रम को बढ़ाती है, जिसके परिणामस्वरूप ब्रेक साइट और एक अस्थानिक दाता के बीच पुनर्संयोजन और बाद में पुनर्संयोजन से जुड़े डीएनए संश्लेषण, टूटे हुए स्ट्रैंड पर होमोलॉजी के क्षेत्र के प्राइमर अपस्ट्रीम और दाता स्ट्रैंड पर होमोलॉजी के क्षेत्र के एक अन्य प्राइमर डाउनस्ट्रीम के माध्यम से होता है। इस विधि का उपयोग करके, पुनर्संयोजन से जुड़े डीएनए संश्लेषण का पता लगाने के लिए गैर-आवश्यक पोल δ प्रक्रिया कारक पोल 3216 की आवश्यकता होती है। यह खोज इस अवलोकन के साथ संघर्ष करती है कि पीओएल 32 विलोपन का विवो17 में जीन रूपांतरण पर केवल हल्का प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, ये पीसीआर-आधारित परख अस्थायी रूप से डी-लूप एक्सटेंशन और बीआईआर उत्पाद गठन को हल करने में विफल रहते हैं, यह सुझाव देते हुए कि सिग्नल एसएसडीएनए मध्यवर्ती 17,18,19 के बजाय डीएसडीएनए उत्पादों से उत्पन्न होता है। डी-लूप एक्सटेंशन (डीएलई) परख हाल ही में इन विसंगतियों को दूर करने के लिए विकसित की गई थी। डीएलई परख प्रारंभिक 3 'हमलावर अंत9 के डाउनस्ट्रीम ~ 400 बेस जोड़े (बीपी) साइट पर पुनर्संयोजन से जुड़े डीएनए संश्लेषण को निर्धारित करता है। इस विधि से, डी-लूप एक्सटेंशन पोल 32 से स्वतंत्र है और डीएसबी प्रेरण के बाद 4 घंटे के भीतर पता लगाने योग्य है, जबकि बीआईआर उत्पादों को पहली बार 6 घंटे पर देखा जाता है। दरअसल, हैबर और माल्कोवा प्रयोगशालाओं के एक हालिया प्रकाशन ने नोट किया कि जीनोमिक डीएनए की तैयारी की इस विधि का उपयोग करने से एसएसडीएनए संरक्षण 9,20 होता है।

यहां, डीएलसी और डीएलई परख विस्तार से वर्णित हैं। ये परख एस सेरेविसिया (चित्रा 2)8,9 में नवजात और विस्तारित डी-लूप का पता लगाने के लिए निकटता बंधाव पर भरोसा करते हैं। बीआईआर उत्पादों को इसी परख प्रणाली का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। दोनों परखों के लिए, क्रोमोसोम (सीएचआर) वी पर यूआरए 3 लोकस में स्थित एचओ एंडोन्यूक्लिज़ कट साइट पर डीएसबी गठन एक गैलेक्टोज-इंड्यूसेबल प्रमोटर के नियंत्रण में एचओ एंडोन्यूक्लिज़ की अभिव्यक्ति से प्रेरित होता है। Rad51-मध्यस्थता डीएनए स्ट्रैंड आक्रमण से CHR II पर LYS2 लोकस में स्थित एक अस्थानिक दाता की साइट पर नवजात डी-लूप गठन होता है। चूंकि डीएसबी के दाईं ओर दाता के लिए होमोलॉजी का अभाव है, एसडीएसए और डीएचजे गठन के माध्यम से मरम्मत संभव नहीं है। बीआईआर द्वारा डीएसबी की प्रारंभिक मरम्मत संभव है, लेकिन व्यवहार्य उत्पादों का गठन सेंट्रोमियर21 की उपस्थिति से बाधित होता है। यह जानबूझकर डिजाइन उत्पादक डीएसबी मरम्मत को रोकता है, जिससे मरम्मत किए गए डीबीएस के साथ कोशिकाओं द्वारा विकास को फिर से शुरू करने से बचा जा सकता है, जो अन्यथा समय पाठ्यक्रम विश्लेषण के दौरान संस्कृति से आगे निकल सकता है।

डीएलसी परख में, डी-लूप के भीतर हेटरोडुप्लेक्स डीएनए के दो किस्में की सोरालेन क्रॉसलिंकिंग पुनर्संयोजन मध्यवर्ती को संरक्षित करती है। टूटे हुए (कटे हुए) स्ट्रैंड और पाचन पर प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली के बाद, क्रॉसलिंकिंग समरूप टूटे हुए और दाता डीएनए के ऊपर अद्वितीय अनुक्रमों के बंधाव की अनुमति देता है। क्यूपीसीआर का उपयोग करके, प्रत्येक नमूने में मौजूद चिमेरिक डीएनए अणु का स्तर निर्धारित किया जाता है। डीएलई परख में, क्रॉसलिंकिंग की आवश्यकता नहीं होती है, और प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली और पाचन के बाद इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन इसके बजाय टूटे हुए अणु के 5 'छोर को नए विस्तारित 3 ' अंत से जोड़ता है। फिर, क्यूपीसीआर का उपयोग प्रत्येक नमूने में इस चिमेरिक उत्पाद की सापेक्ष मात्रा को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली की अनुपस्थिति में, डीएलई परख डी-लूप विस्तार के बाद बनने वाले बीआईआर (डीएसडीएनए) उत्पाद के सापेक्ष स्तरों पर रिपोर्ट करता है।

जंगली प्रकार के तनाव का उपयोग करके प्रत्येक परख के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं, और पाठकों को पुनर्संयोजन उत्परिवर्ती 8,9 के विश्लेषण के लिए इन परखों के उपयोग के लिए पियाज़ा एटअल.8 और पियाज़ा एट अल.9 को संदर्भित किया जाता है। इस योगदान का उद्देश्य अन्य प्रयोगशालाओं को डीएलसी और डीएलई परख को अपनाने में सक्षम बनाना है, और अनुरोध पर उनके लिए समर्थन उपलब्ध है।

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Protocol

1. पूर्व-विकास, डीएसबी प्रेरण, और नमूना संग्रह

नोट: एडी-उपभेदों के लिए 0.01% एडेनिन के साथ सभी मीडिया के पूरक की सिफारिश की जाती है।

  1. खमीर पेप्टोन डेक्सट्रोज एडेनिन ( वाईपीडीए) (1% खमीर निकालने, 2% पेप्टोन, 2% ग्लूकोज, 2% एगर, 0.001% एडेनिन) पर उपयुक्त अगुणित उपभेदों (तालिका 1 देखें) को बाहर निकालें और 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों तक बढ़ते हैं।
  2. 15 एमएल ग्लास कल्चर ट्यूब में वाईपीडीए के 5 एमएल को टीका लगाने के लिए एक एकल कॉलोनी का उपयोग करें। वातन के लिए झटकों या रोटेशन के साथ संस्कृतियों को 30 डिग्री सेल्सियस पर संतृप्ति तक बढ़ाएं।
  3. डीएलसी परख: लगातार झटकों या व्युत्क्रम के साथ कमरे के तापमान पर रात भर एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सोरालेन को भंग करके फ्यूम हुड में 5 एक्स सोरालेन स्टॉक समाधान (200-प्रूफ इथेनॉल में 0.5 मिलीग्राम / एमएल ट्रायोक्ससलेन) तैयार करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक पारदर्शी फिल्म के साथ स्क्रू टॉप सील करें। सोरालेन के उचित विघटन को सुनिश्चित करने के लिए प्रति 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 7 एमएल से अधिक 5 एक्स सोरालेन स्टॉक समाधान तैयार न करें।
  4. अगले दिन, रातोंरात उगाए गए वाईपीडीए के 5 एमएल का उपयोग करके 50-100 एमएल वाईईपी-लैक्टेट (1% खमीर अर्क, 2% पेप्टोन, 2% डब्ल्यू / डब्ल्यू लैक्टेट, 0.001% एडेनिन) को उचित आकार के फ्लास्क में टीका लगाया जा सके (नवोदित खमीर एक फ्लास्क में बेहतर रूप से बढ़ता है जो संस्कृति की मात्रा का कम से कम 5 गुना है) को ~ 0.03 के ओडी600 में।
  5. 220 आरपीएम पर झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर ~ 16 घंटे के लिए संस्कृति उगाएं। ~ 16 घंटे के बाद, संस्कृति के ओडी600 को मापें और यह ~ 0.5-0.8 होना चाहिए। कम या अधिक उगाई गई संस्कृतियों का उपयोग न करें।
  6. प्रत्येक समय बिंदु के लिए, शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं की उचित मात्रा एकत्र करें और बर्फ पर रखें। आमतौर पर, यह डीएलसी परख के लिए 1 x 108 कोशिकाएं (एक अगुणित जंगली प्रकार के तनाव के लिए ओडी600 1.0 पर लगभग7.5 एमएल कल्चर) और डीएलई परख के लिए 5 x 10 7 कोशिकाएं (ओडी600 1.0 पर लगभग 2.5 एमएल कल्चर) होती हैं।
  7. OD 600 मानों की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, OD रीडिंग को 0.2 या उससे नीचे रखने के लिएOD 600≥0.2 के साथ संस्कृतियों के लिए 1: 5 कमजोर पड़ने की तैयारी करें। जंगली प्रकार के उपभेदों के लिए, डीएलसी विश्लेषण के लिए इष्टतम समय बिंदु 2 घंटे और 6 घंटे के बीच हैं, और डीएलई विश्लेषण के लिए इष्टतम समय बिंदु 4 घंटे और 8 घंटे के बीच हैं (चित्रा 3 और चित्रा 4 देखें)।
  8. डीएलसी परख
    1. प्रत्येक समय बिंदु से पहले, पन्नी में लिपटे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सभी नमूनों के लिए फ्यूम हुड में पर्याप्त 1x psoralen समाधान (0.1 mg/ mL trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0, 20% इथेनॉल) तैयार करें। RT पर छोड़ दें।
    2. नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। पेलेट को 2.5 एमएल 1x सोरालेन घोल में फिर से निलंबित करें और 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, नो-क्रॉसलिंकिंग नियंत्रण के लिए टीई 1 समाधान (50 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 8.0, 50 एमएम ईडीटीए पीएच 8.0) के 2.5 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. नमूने क्रॉसलिंक करें। लंबी लहर (365 एनएम) बल्बों के साथ फिट यूवी क्रॉसलिंकर के लिए, पेट्री व्यंजन को यूवी प्रकाश स्रोत से 1-2 सेमी नीचे रखें, जिसमें ढक्कन को प्लास्टिक या प्लेक्सीग्लास प्लेट के ऊपर हटा दिया गया है जिसे -20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ठंडा किया गया है। यूवी प्रकाश बॉक्स के लिए, पेट्री व्यंजनों को सीधे यूवी प्रकाश स्रोत के ऊपर रखें। कोमल झटकों के साथ 10 मिनट के लिए नमूने को उजागर करें।
      नोट: ~ 50 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर सेट के ऊपर यूवी प्रकाश स्रोत सेट करने की सिफारिश की जाती है।
    4. एक फ्यूम हुड में, नमूने को एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। पेट्री डिश को 2.5 एमएल टीई 1 समाधान के साथ कुल्ला करें और इसे ट्यूब में जोड़ें। नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनैटेंट का ठीक से निपटान करें, और गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. डीएलई परख
    1. नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। स्पिन को दोहराने और छर्रों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने से पहले सेल पेलेट को 2.5 एमएल ठंडे टीई 1 समाधान में धो लें। नमूने अगले चरण में जाने से पहले 1 सप्ताह तक संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  10. 0 घंटे पर नमूना संग्रह के लिए, 20% गैलेक्टोज को जोड़ने से पहले नमूने एकत्र करें। बाद के समय बिंदुओं के लिए, संस्कृतियों में 20% गैलेक्टोज को 2% की अंतिम एकाग्रता में जोड़कर डीएसबी गठन को प्रेरित करें। ऊपर वर्णित शेष नमूने एकत्र करें, डीएसबी प्रेरण के बाद के समय के सापेक्ष पेलेट और फ्रीज करें (यानी, 20% गैलेक्टोज के अतिरिक्त 4 घंटे बाद 4 घंटे का नमूना एकत्र किया जाता है)।

2. सेल स्फेरोप्लास्टिंग, लाइसिस और प्रतिबंध साइट बहाली

  1. बर्फ पर नमूने पिघलाएं। एक सूखे स्नान को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. नमूनों को 1 एमएल स्फेरोप्लास्टिंग बफर (0.4 एम सोर्बिटोल, 0.4 एमकेसीएल, 40 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच 7.2, 0.5 एमएम एमजीसीएल2) में पुन: निलंबित करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. 3.5 μL zymolyase घोल जोड़ें (2% ग्लूकोज, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mg/mL zymolyase 100T; 17.5 μg/mL zymolyase अंतिम सांद्रता)। टैप या व्युत्क्रमण द्वारा धीरे-धीरे मिलाएं। 15 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर बर्फ पर रखें। 15 मिनट इनक्यूबेशन के दौरान, तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ प्राप्त करें।
  4. सेंट्रीफ्यूज 3 मिनट के लिए 2,500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर और नमूने को बर्फ पर रखें। नमूने को 1 एमएल स्फेरोप्लास्टिंग बफर में 3 गुना धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,500 x g पर 3 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. ठंडे 1x प्रतिबंध एंजाइम बफर (50 mM पोटेशियम एसीटेट, 20 mM Tris-एसीटेट, 10 mM मैग्नीशियम एसीटेट, 100 μg / mL BSA pH ~ 8.0 RT पर) के 1 एमएल में नमूनों को फिर से निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज 16,000 x g पर। नमूने को बर्फ पर रखें। 1x धोने के बाद दोहराएं।
  6. ठंडे 1x प्रतिबंध एंजाइम बफर के 1 एमएल में नमूने को पुन: निलंबित करें। नमूना (0.5 एमएल प्रत्येक) को दो 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर 3 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. प्रत्येक नमूने से एक ट्यूब को 1.4x प्रतिबंध एंजाइम बफर के 180 μL में हाइब्रिडिंग ऑलिगोस के साथ पुन: निलंबित किया गया (तालिका 2 देखें) और 1.4x प्रतिबंध एंजाइम बफर के 180 μL में एक ट्यूब को हाइब्रिड किए बिना ओलिगोस को संकरित किए बिना। प्रत्येक हाइब्रिडिंग ऑलिगो को 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) में पुन: निलंबित किया जाता है और 7 nM की अंतिम एकाग्रता पर उपयोग किया जाता है। 1x TE ऑलिगोस को हाइब्रिड किए बिना 1.4x प्रतिबंध एंजाइम बफर में हाइब्रिडिंग ऑलिगोस की जगह लेता है।
    नोट: हाइब्रिडिंग ऑलिगोस को काम करने वाले कमजोर पड़ने पर छोटे एलिकोट में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। हाइब्रिडिंग ऑलिगोस की एकाग्रता को अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है; चर्चा देखें।
  8. स्नैप तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ / इथेनॉल में नमूने फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नमूने इस स्तर पर कई महीनों तक संग्रहीत किए जा सकते हैं।

3. प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट और इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन

  1. बर्फ पर नमूने पिघलाएं। एक सूखे स्नान को 65 डिग्री सेल्सियस और दूसरे को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. बर्फ पर एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में नमूने का 36 μL। भंडारण के लिए शेष नमूने को तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर वापस करें।
  3. 1% एसडीएस (0.1% अंतिम सांद्रता) का 4 μL जोड़ें और ट्यूब के किनारे को धीरे से टैप करके मिलाएं। हर 5 मिनट में सौम्य टैपिंग के साथ 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के तुरंत बाद बर्फ पर नमूने रखें।
    नोट: यह एसडीएस उपचार डीएनए से जुड़े प्रोटीन के विकृतीकरण, परमाणु लिफाफे के घुलनशीलता और प्रतिबंध एंजाइम पाचन और इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन चरणों से पहले क्रोमैटिन पहुंच को बढ़ावा देता है।
  4. 10% ट्राइटन एक्स -100 (1% अंतिम सांद्रता) का 4.5 μL जोड़ें और पाइप द्वारा मिलाएं। प्रत्येक नमूने में प्रतिबंध एंजाइम (इकोआरआई-एचएफ या हिंदIII-एचएफ) के 20-50 यू जोड़ें और हर 20-30 मिनट में सौम्य आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इस समय के दौरान, एक सूखे स्नान को 55 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट करें और पानी के स्नान को 16 डिग्री सेल्सियस पर प्रीसेट करें।
  5. प्रत्येक नमूने में 10% एसडीएस (1.5% अंतिम सांद्रता) का 8.6 μL जोड़ें और पाइपिंग और टैपिंग द्वारा मिलाएं। 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। प्रत्येक नमूने में 10% ट्राइटन एक्स -100 (6% अंतिम सांद्रता) का 80 μL जोड़ें और पाइप द्वारा मिलाएं।
  6. प्रत्येक नमूने में एटीपी के बिना 1x लिगेशन बफर का 660 μL जोड़ें (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2.5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA लिगेज (8 U/नमूना) और कोमल व्युत्क्रम द्वारा मिलाएं। हर 30 मिनट में व्युत्क्रमण के साथ 1.5 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के तुरंत बाद नमूने को बर्फ पर रखें।

4. डीएनए शुद्धिकरण

  1. एक सूखे स्नान को 65 डिग्री सेल्सियस और दूसरे को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। प्रत्येक नमूने (12.5 μg / mL अंतिम सांद्रता) में 10 mg / mL प्रोटीन के 1 μL जोड़ें (1x TE pH 8.0 में तैयार)। 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और इनक्यूबेशन के तुरंत बाद बर्फ पर नमूने रखें जब तक कि वे ठंडा न हो जाएं।
  2. नमूने को 2 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। एक फ्यूम हुड में काम करते हुए, प्रत्येक नमूने में फिनोल / क्लोरोफॉर्म / आइसोमिल अल्कोहल (पी / सी / आईए; पीएच 8.0) की एक समान मात्रा (~ 800 μL) जोड़ें। एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में ~ 30 सेकंड के लिए नमूने और 16,000 x g पर 5-10 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. प्रत्येक नमूने के ऊपरी चरण के 600 μL को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में सावधानीपूर्वक हटा दें। निचले चरण और 2 एमएल ट्यूबों का ठीक से निपटान करें।
  4. प्रत्येक नमूने में 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.2 (~ 60 μL) की 1/10 मात्रा जोड़कर डीएनए को अवक्षेपित करें, इसके बाद आइसोप्रोपेनॉल की 1 मात्रा (~ 660 μL)। नमूने को 5x-10x में बदलें और 30 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
  5. नमूनों को 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें, और फिर एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,500 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। नमूने को बर्फ पर वापस करें, सतह पर तैरने वाला डालें, और ट्यूब को पेपर तौलिया पर निकालें।
  6. डीएनए गोली को 70% इथेनॉल के 200 μL के साथ धोएं। सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 16,500 x g पर, नमूने को बर्फ पर वापस रखें, सतह पर डालें, और एक पाइप के साथ अवशिष्ट अल्कोहल को हटा दें। 15-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर खुली ट्यूबों की टोपी के साथ नमूने सुखाएं।
  7. भंवर द्वारा डीएनए छर्रों को 1x TE के 50 μL में पुन: निलंबित करें। आरटी में 30 मिनट, भंवर के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर 30 मिनट के लिए सूखे स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। भंवर फिर से नमूने, और फिर उन्हें बर्फ पर रखें। नमूने इस स्तर पर कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं, लेकिन डीक्रॉसलिंकिंग (केवल डीएलसी) और क्यूपीसीआर चरणों के लिए तुरंत आगे बढ़ने की सलाह दी जाती है।

5. सोरालेन क्रॉसलिंक रिवर्सल (केवल डीएलसी परख के लिए)

  1. बर्फ पर एक पीसीआर ट्यूब में शुद्ध डीएनए का 9 μL। 1 M KOH (0.1 M अंतिम एकाग्रता) का 1 μL जोड़ें। थर्मोसाइक्लर में 30 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को इनक्यूबेट करें।
  2. सोडियम एसीटेट समाधान के 19.73 μL जोड़ें (0.1 M सोडियम एसीटेट, 9.6 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.0 mM EDTA pH 8.0)। नमूने इस स्तर पर कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं, लेकिन क्यूपीसीआर चरण पर तुरंत आगे बढ़ने की सलाह दी जाती है।

6. मात्रात्मक पीसीआर, नियंत्रण और विश्लेषण

  1. क्रॉसलिंकिंग के साथ या बिना शुद्ध डीएनए के 2 μL का उपयोग करके, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 20 μL qPCR प्रतिक्रिया सेट करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया को डुप्लिकेट में सेट करें। डीएलसी और डीएलई परख दोनों के लिए, पांच नियंत्रण प्रतिक्रियाएं और एक डीएलसी / डीएलई परिमाणीकरण प्रतिक्रिया, या प्रति नमूना कुल छह प्रतिक्रियाएं, डुप्लिकेट में चलती हैं। पूरक तालिका एस 1 और पूरक तालिका एस 2 इन प्रतिक्रियाओं और विश्लेषण को स्थापित करने के लिए एक टेम्पलेट प्रदान करते हैं, और क्यूपीसीआर प्राइमरों के अनुक्रम तालिका 3 में सूचीबद्ध हैं।
  2. प्रत्येक क्यूपीसीआर किट के लिए क्यूपीसीआर साइकिल िंग स्थितियों को अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
    1. उपयोग किए गए क्यूपीसीआर किट के आधार पर निम्नलिखित डीएलसी क्यूपीसीआर स्थितियों का उपयोग करें: प्रारंभिक विकृतीकरण (3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस); प्रवर्धन के 50 दौर (15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 25 सेकंड के लिए 61 डिग्री सेल्सियस, 15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस); पिघलने वक्र विश्लेषण (5 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, निरंतर अधिग्रहण के साथ 97 डिग्री सेल्सियस); और शीतलन (30 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस)।
    2. डीएलई परख के लिए निम्नलिखित क्यूपीसीआर शर्तों का उपयोग करें: प्रारंभिक विकृतीकरण (5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस); प्रवर्धन के 50 दौर (15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, एकल अधिग्रहण के साथ 15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस); पिघलने वक्र विश्लेषण (5 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस, निरंतर अधिग्रहण के साथ 97 डिग्री सेल्सियस); और शीतलन (30 सेकंड के लिए 37 डिग्री सेल्सियस)। ध्यान दें कि विभिन्न QPCR मशीनों / किट के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
  3. डीएलसी परख
    1. नियंत्रण: तालिका 3 में QPCR प्राइमरों की सूची देखें। प्राइमर बाइंडिंग साइटों का एक नक्शा चित्रा एस 1 में दिखाया गया है। प्रासंगिक जीनोमिक सुविधाओं और एम्प्लिकॉन के लिए पूरक अनुक्रम फ़ाइलों के लिए, ए प्लास्मिड संपादक (एपीई) फ़ाइलों की जांच करें; पूरक अनुक्रम फाइलें 1-5.
      1. एआरजी 4 में जीनोमिक डीएनए: एआरजी 4 पर स्थित डीएसडीएनए को बढ़ाने के लिए ओएलडब्ल्यूडीएच 1760 / ओएलडब्ल्यूडीएच 1761 का उपयोग करें। इस प्रतिक्रिया को लोडिंग नियंत्रण के रूप में उपयोग करें और इस नियंत्रण के लिए डीएलसी सिग्नल प्रतिक्रिया को छोड़कर अन्य सभी प्रतिक्रियाओं को सामान्य करें।
      2. डीएपी 2 पर इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन दक्षता: डीएलसी लिगेशन के समानांतर इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन के लिए इकोआरआई पाचन द्वारा बनाए गए 1,904 बीपी टुकड़े का उपयोग करें। इस लिगेशन जंक्शन में प्रवर्धन इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन दक्षता पर रिपोर्ट करता है और एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जिसके लिए डीएलसी सिग्नल सामान्यीकृत होता है।
      3. डीएसबी प्रेरण: प्रेरित डीएसबी को फैलाने वाले क्षेत्र को बढ़ाने के लिए ओएलडब्ल्यूडीएच 1766 / ओएलडब्ल्यूडीएच 1767 का उपयोग करें।
      4. Psoralen क्रॉसलिंकिंग और रिसेक्शन: EcoRI मान्यता साइट के डाउनस्ट्रीम अद्वितीय PhiX क्षेत्र को बढ़ाने के लिए olWDH2019 / olWDH2020 का उपयोग करें। क्रॉसलिंक रिवर्सल के बिना, क्रॉसलिंकिंग दक्षता निर्धारित करने के लिए एआरजी 4 (क्रॉसलिंक्ड डीएसडीएनए) पर एसएसडीएनए (कोई क्रॉसलिंकिंग नहीं) के अनुपात का उपयोग करें। क्रॉसलिंक रिवर्सल के साथ, रिसेक्शन से एआरजी 4 के सापेक्ष सिग्नल के 1 से 0.5 तक प्रगतिशील कमी आएगी।
      5. EcoR मैं साइट बहाली और काटने की पहचान करता हूं: एक क्षेत्र को बढ़ाने के लिए ओएलडब्ल्यूडीएच 1768/ओएलडब्ल्यूडीएच 1764 का उपयोग करें जो डीएसबी के ऊपर बहाल इकोआरआई मान्यता साइट को फैलाता है। olWDH1769/olWDH1763 एक ऐसे क्षेत्र को बढ़ाता है जो DAP2 पर EcoRI प्रतिबंध एंजाइम साइट को फैलाता है। इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन कंट्रोल के रूप में उपयोग करने के लिए इस साइट पर इकोआरआई क्लीवेज करें।
    2. डीएलसी सिग्नल: ओएलडब्ल्यूडीएच 1764/ओएलडब्ल्यूडीएच 1765 का उपयोग करें ताकि कटे हुए (हमलावर) स्ट्रैंड और दाता के इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन द्वारा बनाए गए चिमेरिक डीएनए अणु को बढ़ाया जा सके।
    3. विश्लेषण: प्रत्येक डुप्लिकेट प्रतिक्रियाओं के लिए सीपी मानों के औसत और मानक विचलन की गणना करें। अन्य सभी नियंत्रण QPCR को सामान्य करने के लिए संदर्भ के रूप में ARG4 जीनोमिक डीएनए QPCR CP मानों का उपयोग करें। डीएपी 2 पर इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन कंट्रोल के लिए डीएलसी सिग्नल को सामान्य करें। 2 घंटे पर विशिष्ट डीएलसी सिग्नल मानों के लिए चित्रा 3 देखें।
  4. डीएलई परख
    1. नियंत्रण: तालिका 3 में QPCR प्राइमरों की सूची देखें। प्राइमर बाइंडिंग साइटों का एक नक्शा चित्रा एस 1 में दिखाया गया है। प्रासंगिक जीनोमिक सुविधाओं और एम्प्लिकॉन के लिए पूरक अनुक्रम फ़ाइलों के लिए, ए प्लास्मिड संपादक (एपीई) फाइलें (पूरक अनुक्रम फाइलें 1-5) देखें।
      1. एआरजी 4 में जीनोमिक डीएनए: अनुभाग 6.3.1.1 देखें।
      2. वाईएलआर 050 सी पर इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन दक्षता: 765 बीपी टुकड़ा बनाने के लिए हिंदIII पाचन का उपयोग करें जो डीएलई लिगेशन के समानांतर इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन से गुजरेगा। इस लिगेशन जंक्शन में प्रवर्धन इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन दक्षता पर रिपोर्ट करता है और एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है जिसके लिए डीएलई सिग्नल सामान्यीकृत होता है।
      3. डीएसबी प्रेरण: अनुभाग 6.3.1.3 देखें।
      4. पिछला III मान्यता साइट बहाली और काटने: olWDH2010/olWDH2012 और olWDH2009/2011 का उपयोग एक ऐसे क्षेत्र को बढ़ाने के लिए करें जो टूटे हुए स्ट्रैंड पर हिंदIII प्रतिबंध एंजाइम साइटों को फैलाता है जहां इसे क्रमशः निकाला और विस्तारित किया गया है।
    2. डीएलई सिग्नल: डीएसबी के अपस्ट्रीम में आक्रमण करने वाले स्ट्रैंड के कटे हुए छोर के इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन द्वारा बनाए गए चिमेरिक डीएनए अणु को डीएसबी के नए विस्तारित छोर तक बढ़ाने के लिए ओएलडब्ल्यूडीएच 2009/ओएलडब्ल्यूडीएच 2010 का उपयोग करें।
    3. विश्लेषण: प्रत्येक डुप्लिकेट प्रतिक्रियाओं के लिए सीपी मानों के औसत और मानक विचलन की गणना करें। अन्य सभी नियंत्रण QPCR को सामान्य करने के लिए संदर्भ के रूप में ARG4 जीनोमिक डीएनए QPCR CP मानों का उपयोग करें। YLR050C पर इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन नियंत्रण के लिए DLE सिग्नल को सामान्य करें। 6 घंटे पर विशिष्ट डीएलई सिग्नल मान चित्रा 4 और पिछले प्रकाशन9 में बताए गए हैं।

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Representative Results

डीएलसी परख
डीएलसी परख एक एकल दाता में साइट-विशिष्ट डीएसबी के आक्रमण से गठित नवजात और विस्तारित डी-लूप दोनों का पता लगाता है (चित्रा 2)। सोरालेन क्रॉसलिंकिंग शारीरिक रूप से डी-लूप के भीतर हेटरोडुप्लेक्स डीएनए के माध्यम से टूटे हुए स्ट्रैंड और दाता को जोड़ती है। ब्रेक के कटे हुए स्ट्रैंड पर एक लंबे, संकरण ऑलिगो के साथ प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली प्रतिबंध एंजाइम दरार की अनुमति देती है, इसके बाद टूटे हुए स्ट्रैंड को समीपस्थ दाता को एक चिमेरिक उत्पाद बनाने के लिए बंधाव होता है जिसे क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित किया जाता है। विशेष रूप से, डीएलसी सिग्नल सोरालेन क्रॉसलिंकिंग, हाइब्रिडिंग ऑलिगो, सेंट्रल रिकोम्बिनेस, रैड 51 और रेड 51 एक्सेसरी कारकराड 52 और रेड 548 पर निर्भर करता है। डीएनए हेलिकेस / टोपोइसोमेरेस एसजीएस 1-टॉप 3-आरएमआई 1, एमपीएच 1, और एसआरएस 2 के विलोपन से डीएलसी सिग्नल में वृद्धि होती है।

चित्रा 3 ओलिगो के साथ और बिना तीन प्रतियों में 2 घंटे के बाद डीएसबी प्रेरण पर मानक जंगली प्रकार के तनाव के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। एक महत्वपूर्ण चरण, सोरालेन क्रॉसलिंकिंग में कमी वाला एक नमूना, डुप्लिकेट में भी दिखाया गया है।

जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, सोरालेन क्रॉसलिंकिंग एक महत्वपूर्ण कदम है। इसके बिना व्यावहारिक रूप से कोई पता लगाने योग्य संकेत नहीं है। क्रॉसलिंकिंग दक्षता को एसएसडीएनए से डीएसडीएनए प्रवर्धन के अनुपात के आधार पर मापा जाता है। डीएसडीएनए के विपरीत, एसएसडीएनए न्यूनतम सोरालेन क्रॉसलिंकिंग का अनुभव करता है, और इस प्रकार, एक उच्च संकेत सफल क्रॉसलिंकिंग को इंगित करता है। क्रॉसलिंकिंग दक्षता नमूना संग्रह और क्यूपीसीआर की तैयारी के बीच के समय के आधार पर भिन्न होती है (चित्रा 3, नीचे बाएं पैनल)। नमूना संग्रह और तैयारी के बीच जितना अधिक समय होगा, क्रॉसलिंकिंग दक्षता क्यूपीसीआर नियंत्रण के लिए कम संकेत देखा जाएगा। क्रॉसलिंकिंग दक्षता क्यूपीसीआर नियंत्रण के लिए देखे गए सिग्नल में महत्वपूर्ण अंतर-नमूना भिन्नता चिंता का कारण है, और समय पाठ्यक्रम को त्याग दिया जाना चाहिए।

ARG4 सीपी मान ऑलिगो नमूनों के साथ और बिना संकरण के बीच समान हैं (चित्रा 3, शीर्ष-बाएं पैनल)। एक कम सीपी मान इंगित करता है कि अधिक प्रवर्धन योग्य डीएनए मौजूद है। यह बताता है कि बिना-क्रॉसलिंकिंग नमूनों के लिए एआरजी 4 सीपी मान काफी कम क्यों हैं: क्रॉसलिंकिंग क्यूपीसीआर प्रवर्धन में हस्तक्षेप करता है। क्रॉसलिंकिंग नमूनों के साथ और बिना-क्रॉसलिंकिंग नमूनों के बीच यह अंतर इकोआरआई क्लीवेज क्यूपीसीआर नियंत्रण को छोड़कर सभी क्यूपीसीआर पर लागू होता है, जो एसएसडीएनए / गैर-क्रॉसलिंक्ड डीएसडीएनए को बढ़ाएगा। सभी QPCR नियंत्रण, लेकिन DLC सिग्नल नहीं, ARG4 qPCR सिग्नल के लिए सामान्यीकृत हैं।

सभी नमूनों के लिए, इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन क्यूपीसीआर नियंत्रण उपयुक्त सीमा (चित्रा 3, शीर्ष मध्य पैनल) के भीतर है, और मजबूत डीएसबी प्रेरण है, जैसा कि क्यूपीसीआर नियंत्रण के लिए कम संकेत से स्पष्ट है जो एचओ एंडोन्यूक्लिज़ पहचान साइट (चित्रा 3, शीर्ष-दाएं पैनल) में बढ़ता है। ऑलिगो नमूनों के साथ-संकरण में, कुशल इकोआरआई कटिंग देखी जाती है, और यह क्यूपीसीआर नियंत्रण कम संकेत देता है (चित्रा 3, निचला मध्य पैनल)। इसके विपरीत, क्रॉसलिंकिंग नमूने के साथ बिना-हाइब्रिडिंग ऑलिगो एक उच्च संकेत देते हैं, जैसा कि क्रॉसलिंकिंग दक्षता क्यूपीसीआर नियंत्रण के लिए दिखाया गया है, क्योंकि, इस मामले में, अनकट एसएसडीएनए को एआरजी 4 क्यूपीसीआर सिग्नल (डीएसडीएनए) में प्रवर्धित और सामान्यीकृत किया जा रहा है।

अन्य क्यूपीसीआर के विपरीत, डीएलसी परख के लिए क्यूपीसीआर सिग्नल को इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन क्यूपीसीआर नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत किया जाता है, क्योंकि डीएलसी क्यूपीसीआर द्वारा निर्धारित चिमेरिक अणु लिगेशन पर निर्भर करता है। इस परख8 के लिए पहले प्रकाशित परिणामों को ध्यान में रखते हुए, हाइब्रिडिंग ऑलिगो के साथ 2 घंटे पर औसत डीएलसी सिग्नल 0.030 ± 0.0055 (चित्रा 3, निचला दाएं पैनल) है। जैसा कि अपेक्षित था, यह संकेत हाइब्रिडिंग ऑलिगो और सोरालेन क्रॉसलिंकिंग दोनों पर निर्भर करता है।

डीएलई परख
डीएलई परख साइट-विशिष्ट डीएसबी (चित्रा 2) के जवाब में डी-लूप विस्तार की सटीक निगरानी के लिए अनुमति देता है। यह पहले प्रदर्शित किया गया था कि डीएलई सिग्नल रेड 51 पर निर्भर करता है, प्रतिक्रिया में केंद्रीय रिकोम्बिनेस, जो स्ट्रैंड आक्रमण की मध्यस्थता करता है और इस प्रकार, पुनर्संयोजन से जुड़े डीएनए संश्लेषण9 के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, डीएलई सिग्नल पोल δ, पोल 3 (डीआर, एपी, डब्ल्यूडीएच, अप्रकाशित डेटा) के उत्प्रेरक सबयूनिट पर निर्भर करता है, लेकिन गैर-आवश्यक प्रक्रियात्मकता कारक पोल 32 पर नहीं। डीएलसी सिग्नल के विपरीत, जो पहली बार डीएसबी प्रेरण के बाद 2 घंटे में पता लगाने योग्य हो जाता है, डीएलई सिग्नल पहले डीएसबी प्रेरण के बाद 4 घंटे में बढ़ता है, 4 घंटे और 6 घंटे के बीच नाटकीय रूप से बढ़ता है, और उसके बाद स्थिर होना शुरू हो जाता है, जिसमें बीआईआरउत्पाद गठन 8 के कारण 6 घंटे और 8 घंटे के बीच सिग्नल में अधिकांश वृद्धि होती है। 9.

चूंकि डीएलई परख में निर्धारित चिमेरिक लिगेशन उत्पाद एकल-फंसे हुए हैं, इसलिए सेल स्फेरोप्लास्टिंग और लाइसिस चरण महत्वपूर्ण है। डीएलई सिग्नल में कमी इस कदम के साथ मुद्दों के परिणामस्वरूप हो सकती है, जो न्यूक्लियस जारी कर सकती है और लक्ष्य एसएसडीएनए के क्षरण का कारण बन सकती है।

चित्रा 4 ओलिगोस के साथ और बिना तीन प्रतियों में 6 घंटे के बाद डीएसबी प्रेरण पर मानक जंगली प्रकार के तनाव के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। ऑलिगोस को हाइब्रिड किए बिना जंगली प्रकार का नमूना अकेले डीएसडीएनए बीआईआर उत्पाद का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि ऑलिगो सिग्नल विस्तारित डी-लूप के एसएसडीएनए और डीएसडीएनए बीआईआर उत्पाद दोनों से प्राप्त होता है। एक तीसरा नमूना एक असफल प्रयोग के उदाहरण के रूप में शामिल है।

ARG4 ऑलिगोस नमूनों (चित्रा 4, शीर्ष-बाएं पैनल) के साथ और बिना संकरण के बीच सीपी मान समान थे। ARG4 असफल नमूने के लिए सीपी मान काफी कम थे, यह दर्शाता है कि इस नमूने में सफल नमूनों की तुलना में अधिक जीनोमिक डीएनए है। QPCR नियंत्रणों के लिए QPCR सिग्नल, लेकिन DLE सिग्नल नहीं, ARG4 qPCR सिग्नल के लिए सामान्यीकृत किए गए थे। इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन क्यूपीसीआर नियंत्रण ने ऑलिगोस नमूनों (~ 0.15-0.35 के बीच) के साथ और बिना हाइब्रिडिंग के लिए एक स्वीकार्य संकेत का खुलासा किया, लेकिन असफल नमूने के लिए काफी कम संकेत (चित्रा 4, शीर्ष-मध्य पैनल)। इस असफल नमूने में, एआरजी 4 क्यूपीसीआर नियंत्रण द्वारा इंगित जीनोमिक डीएनए की उच्च मात्रा संभवतः इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन को विफल कर देती है, क्योंकि जीनोमिक डीएनए की उच्च सांद्रता इंटरमॉलिक्युलर लिगेशन का कारण बनेगी।

सभी तीन नमूनों में, मजबूत डीएसबी प्रेरण था (चित्रा 4, शीर्ष-दाएं पैनल)। पिछला निकाले गए और विस्तारित दोनों किस्में पर III दरार संकरण ऑलिगोस की उपस्थिति पर निर्भर करती है। विस्तारित स्ट्रैंड पर, यह डी-लूप एक्सटेंशन पर भी निर्भर करता है। इस प्रकार, हिंदIII दरार साइट पर ऑलिगो नमूनों के साथ और बिना ओलिगो नमूनों (चित्रा 4, नीचे-बाएं पैनल) के बीच निकाले गए स्ट्रैंड पर प्रवर्धन में एक महत्वपूर्ण अंतर था और इन नमूनों के बीच विस्तारित स्ट्रैंड पर हिंदIII मान्यता साइट पर प्रवर्धन में एक छोटा अंतर था (चित्रा 4, नीचे-मध्य पैनल)।

चूंकि डीएलई सिग्नल इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन पर निर्भर करता है, इसलिए इसे इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन क्यूपीसीआर नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। हाइब्रिडिंग ऑलिगोस के साथ 6 घंटे पर औसत डीएलई सिग्नल 0.53 ± 0.17 (चित्रा 4, निचला दाएं पैनल) था, जो इस परख9 के लिए पहले प्रकाशित परिणामों के अनुरूप था। ऑलिगोस को संकरित किए बिना जंगली प्रकार के नमूने के लिए डीएलई सिग्नल इस पूर्व प्रकाशन के साथ समान रूप से संगत था। असफल नमूने के लिए डीएलई सिग्नल अपेक्षा से कम था, संभवतः ऊपर उल्लिखित उस नमूने के साथ मुद्दों को दर्शाता है।

क्रॉसलिंक रिवर्सल
डीएसडीएनए में एपीटी/टीपीए बेस जोड़े के बीच अंतरित सोरालेन अपने फुरान और पाइरोन रिंग्स के माध्यम से यूवी विकिरण पर एक या दोनों विरोधी थाइमिन बेस से सहसंयोजक रूप से जुड़ा हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप (मुख्य रूप से फुरान) मोनो-जोड़ या इंटर-स्ट्रैंड डि-जोड़ (यानी, क्रॉसलिंक्स) क्रमशः22 हो सकते हैं। इन संशोधनों से डीएनए पोलीमरेज़ की प्रगति को अवरुद्ध करने की उम्मीद है, इस प्रकार मात्रात्मक पीसीआर के अभिन्न डीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया को रोक दिया जाता है। नतीजतन, अधिकांश डीएसडीएनए टेम्प्लेट को प्रवर्धित नहीं किया जा सकता है (चित्रा 5 ए, बी)। इसके विपरीत, एसएसडीएनए में बेस जोड़े की अनुपस्थिति इसे सोरालेन क्रॉसलिंकिंग के लिए कम प्रवण बनाती है। इस प्रकार, यह डीएसडीएनए की तुलना में अधिक आसानी से प्रवर्धित होता है, जो एसएसडीएनए बनाम डीएसडीएनए और विभिन्न लंबाई के डीएसडीएनए एम्प्लिकॉन और एपीटी / टीपीए सामग्री (चित्रा 5 ए, बी) के सापेक्ष परिमाणीकरण को विकृत करता है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, मात्रात्मक पीसीआर से पहले सोरालेन क्रॉसलिंक रिवर्सल चरण23 का एक आधार- और गर्मी-उत्प्रेरित उलटा लागू किया गया था। यह विधि केवल पाइरोन-साइड मोनो-जोड़ों की मामूली प्रजातियोंको 23,24 छोड़ देती है। इससे जीनोमिक डीएसडीएनए और इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन कंट्रोल एम्प्लिकॉन की 80 गुना वसूली हुई, यह दर्शाता है कि टेम्पलेट अणुओं के बड़े बहुमत में कम से कम एक फ्यूरान-साइड मोनोडक्ट या इंटर-स्ट्रैंड क्रॉसलिंक (चित्रा 5 बी, सी) था। क्रॉसलिंक रिवर्सल से पहले और बाद में डीएसडीएनए जीनोमिक डीएनए नियंत्रण के सीपी मूल्यों की तुलना क्रॉसलिंकिंग दक्षता का अनुमान प्रदान करती है, जो यहां दिखाई गई सीमा में होनी चाहिए। लघु एम्प्लिकॉन से परे, यह प्रक्रिया 3 केबी लंबे (चित्रा एस 2) तक टेम्पलेट्स को पुनर्स्थापित कर सकती है। एसएसडीएनए एम्प्लिकॉन के लिए कोई बदलाव नहीं देखा गया था, जो एसएसडीएनए (चित्रा 5 बी-डी) के लिए सोरालेन क्रॉसलिंकिंग की कमी के अनुरूप था। यह भी दिखाता है कि क्रॉसलिंक रिवर्सल प्रक्रिया डीएनए23 को पता लगाने योग्य नुकसान नहीं पहुंचाती है। डीएलसी चिमेरा एम्प्लिकॉन की वसूली, जिसमें एक क्रॉसलिंक्ड डीएसडीएनए खंड होता है जो एक गैर-क्रॉसलिंक्ड डीएस-एसएसडीएनए खंड (50 बीपी और 118 बीपी / एनटी) से जुड़ा होता है; चित्र 5A) वसूली में 8 गुना सुधार के साथ डीएसडीएनए और एसएसडीएनए एम्प्लिकॉन के मध्यवर्ती था (चित्रा 5 बी, सी)। क्रॉसलिंक रिवर्सल ने दो डीएसडीएनए एम्प्लिकॉन के सापेक्ष स्तर को प्रभावित नहीं किया, जिसमें इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन नियंत्रण जीनोमिक डीएनए नियंत्रण (चित्रा 5 ई) के सापेक्ष 0.2-0.25 रेंज में शेष रहा। हालांकि, इसने डीएसडीएनए जीनोमिक डीएनए नियंत्रण के सापेक्ष एसएसडीएनए एम्प्लिकॉन की सापेक्ष मात्रा को डीएसडीएनए टेम्पलेट (चित्रा 5 डी) के सापेक्ष एसएसडीएनए के लिए अपेक्षित 0.5 गुना तक 40 गुना अधिक से बदल दिया। इसी तरह, डीएसडीएनए इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन कंट्रोल (चित्रा 5 एफ) के सापेक्ष आंशिक रूप से एसएसडीएनए डीएलसी सिग्नल 6.6 x 10−2 से घटकर 6.6 x 10−3 हो गया। यह हमें इस दृष्टिकोण 4 घंटे के बाद डीएसबी प्रेरण द्वारा पता लगाए गए अंतर-क्रोमोसोमल दाता में डी-लूप संयुक्त अणुओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए प्रेरित करता है, जो सेल आबादी में कुल टूटे हुए अणुओं का औसत 1.3% है। इस तरह के पूर्ण अनुमान डीएसडीएनए और एसएसडीएनए प्रवर्धन के सोरालेन-आधारित विरूपण के साथ नहीं किए जा सकते हैं, जो इस अतिरिक्त क्रॉसलिंक रिवर्सल चरण के मूल्य पर प्रकाश डालता है।

Figure 1
चित्रा 1: समरूप पुनर्संयोजन और संकल्प उप-मार्ग। डीएनए क्षति के बाद जिसके परिणामस्वरूप एक या दो-अंत डीएसबी (दिखाया गया) या एसएसडीएनए अंतर होता है, डीएनए के 5' से 3 ' रिसेक्शन से 3' एसएसडीएनए ओवरहैंग का पता चलता है, जिस पर रैड 51 फिलामेंट बनता है, जो इसके सहायक कारकों द्वारा सहायता प्राप्त करता है। Rad51 तब जीनोम को एक बरकरार डुप्लेक्स डीएनए (यानी, दाता) के लिए खोजता है, जिस पर मरम्मत की घटना को टेम्पलेट करना है। यह प्रक्रिया डीएनए स्ट्रैंड आक्रमण में समाप्त होती है, जिसमें टूटे हुए स्ट्रैंड वाटसन-क्रिक बेस डबल-फंसे डीएनए दाता के पूरक स्ट्रैंड के साथ जुड़ते हैं, विपरीत स्ट्रैंड को विस्थापित करते हैं और नवजात डी-लूप बनाते हैं। इस डी-लूप को या तो उलट दिया जा सकता है ताकि रैड 51 होमोलॉजी खोज को एक अलग दाता का चयन करने की अनुमति मिल सके या डीएनए क्षति घटना के दौरान खोए गए ठिकानों को बदलने के लिए डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा विस्तारित किया जा सके। उत्पाद में इस विस्तारित डी-लूप मध्यवर्ती को हल करने के लिए तीन एचआर उप-मार्ग उपलब्ध हैं। सबसे पहले, विस्तारित डी-लूप को हेलिकेस द्वारा बाधित किया जा सकता है, जिससे ब्रेक के नए विस्तारित छोर को संश्लेषण-निर्भर स्ट्रैंड एनीलिंग (एसडीएसए) नामक प्रक्रिया में दूसरे छोर तक पहुंचने की अनुमति मिलती है। फिल-इन डीएनए संश्लेषण और बंधाव तब उत्पाद गठन का कारण बनता है। वैकल्पिक रूप से, ब्रेक का दूसरा छोर विस्थापित दाता स्ट्रैंड को नष्ट कर सकता है, जिससे डबल-हॉलिडे जंक्शन (डीएचजे) बन सकता है। डीएचजे के न्यूक्लियोलाइटिक रिज़ॉल्यूशन के परिणामस्वरूप या तो क्रॉसओवर (सीओ) या गैर-क्रॉसओवर (एनसीओ) होता है, जबकि डीएचजे विघटन (नहीं दिखाया गया) केवल एनसीओ उत्पादों में होता है। अंत में, डीएसबी के दूसरे छोर को संलग्न करने में विफलता के परिणामस्वरूप ब्रेक-प्रेरित प्रतिकृति (बीआईआर) होता है, एक म्यूटाजेनिक प्रक्रिया जिसमें हजारों बेस जोड़े को दाता से टूटे हुए स्ट्रैंड पर कॉपी किया जाता है। यह प्रक्रिया अभिसरण प्रतिकृति कांटा या गुणसूत्र के अंत तक विस्तारित हो सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: डी-लूप कैप्चर (डीएलसी), डी-लूप एक्सटेंशन (डीएलई), और ब्रेक-प्रेरित प्रतिकृति (बीआईआर) उत्पाद गठन परख का आधार। डीएसबी गठन जीएएल 1 प्रमोटर के नियंत्रण में एक साइट-विशिष्ट एंडोन्यूक्लिज़ द्वारा संचालित होता है। डीएसबी प्रेरण एक नवजात डी-लूप के गठन की ओर जाता है। डीएलसी परख में, डीएनए का इंटर-स्ट्रैंड क्रॉसलिंकिंग इस संरचना को संरक्षित करता है, जिसे बाद में निकाला जाता है। प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली एक लंबे ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ संकरण के माध्यम से प्राप्त की जाती है, और फिर डीएनए को एक उत्पाद बनाने के लिए पचाया और लिगेट किया जाता है जिसे मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। डीएलई परख इस बात में भिन्न है कि डीएनए क्रॉस-लिंक्ड नहीं है, और इसके बजाय, ब्रेक के एक तरफ एसएसडीएनए के दो सिरों के बीच इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन उत्पाद बनता है, 3 'छोर को डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा बढ़ाया गया है। क्यूपीसीआर का उपयोग फिर से चिमेरिक लिगेशन उत्पाद के गठन को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। डीएलई परख के माध्यम से डी-लूप विस्तार का पता लगाने के लिए भी प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, डबल-फंसे हुए बीआईआर उत्पाद का पता डबल-स्ट्रैंडेड बीआईआर उत्पाद को हाइब्रिडिंग ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के बिना डीएलई परख प्राइमरों का उपयोग करके लगाया जाता है। आर इंगित करता है कि एक प्रतिबंध एंजाइम साइट एंजाइम दरार के लिए सक्षम है; (आर) एक प्रतिबंध एंजाइम साइट को इंगित करता है जिसे काटा नहीं जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: डीएसबी प्रेरण के बाद 2 घंटे पर डी-लूप के डीएलसी परख विश्लेषण से प्रतिनिधि परिणाम। इस प्रोटोकॉल में वर्णित क्यूपीसीआर द्वारा नमूने एकत्र, तैयार और विश्लेषण किए गए थे। नीले प्रतीक एन = 3 के लिए ऑलिगोस को संकरण करने के साथ मानक जंगली प्रकार के तनाव के परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं। हरे रंग के प्रतीक एन = 3 के लिए ऑलिगोस को संकरित किए बिना जंगली प्रकार के तनाव के परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं। मोटी लाल रेखा माध्य को दर्शाती है। बैंगनी प्रतीक सोरालेन क्रॉसलिंकिंग के बिना नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं लेकिन एन = 2 के लिए ऑलिगोस को संकरण के साथ। प्रतीक ों से संकेत मिलता है कि नमूने एक ही संस्कृति से प्राप्त होते हैं। क्रॉसलिंकिंग दक्षता में अंतर-प्रयोगात्मक अंतर कुछ क्यूपीसीआर नियंत्रणों में परिवर्तनशीलता पेश कर सकते हैं, लेकिन तब तक समस्याग्रस्त नहीं होते हैं जब तक कि एक प्रयोग के भीतर इन क्यूपीसीआर नियंत्रणों में कोई अंतर-नमूना परिवर्तनशीलता न हो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: डीएलई परख विश्लेषण 6 एच पोस्ट-डीएसबी प्रेरण से प्रतिनिधि परिणाम। इस प्रोटोकॉल में वर्णित क्यूपीसीआर द्वारा नमूने एकत्र, तैयार और विश्लेषण किए गए थे। नीले प्रतीक एन = 3 के लिए ऑलिगोस को संकरण करने के साथ मानक जंगली प्रकार के तनाव के परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं। हरे रंग के प्रतीक एन = 3 के लिए ऑलिगोस को संकरित किए बिना जंगली प्रकार के तनाव के परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं। मोटी लाल रेखा माध्य को दर्शाती है। ध्यान दें कि ऑलिगोस नमूने के साथ और बिना संकरण के नमूने एक ही संस्कृतियों से प्राप्त होते हैं। बैंगनी हीरा एन = 1 के लिए ऑलिगोस को संकरित किए बिना एक असफल नमूने का प्रतिनिधित्व करता है। प्रतीक इंगित करते हैं कि नमूने एक ही संस्कृति से प्राप्त होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
(ए) सोरालेन-डीएनए मोनो-जोड़ (*) और इंटर-स्ट्रैंड क्रॉसलिंक (एक्स) विशेष रूप से डीएसडीएनए पर होते हैं और एसएसडीएनए टेम्प्लेट के विपरीत डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा इसके प्रवर्धन को रोकते हैं। यह अंतर क्यूपीसीआर द्वारा डीएसडीएनए- और एसएसडीएनए युक्त टेम्प्लेट की मात्रा में पूर्वाग्रह का परिचय देता है। इस पूर्वाग्रह को सोरालेन क्रॉसलिंक के उलट होने पर दूर किया जा सकता है। (बी) डीएसडीएनए (जीनोमिक, लिगेशन), एसएसडीएनए और मिश्रित डीएस-एसएसडीएनए (डीएलसी) एम्प्लिकॉन के प्रतिनिधि सीपी मान 4 घंटे के बाद डीएसबी प्रेरण प्राप्त करते हैं। डेटा व्यक्तिगत मूल्यों और चार जैविक प्रतिकृतियों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) क्रॉसलिंक रिवर्सल पर प्रवर्धन वसूली, (बी) में सीपी मानों से गणना की जाती है। (डी) सोरालेन क्रॉसलिंक रिवर्सल के साथ और बिना जीनोमिक डीएसडीएनए नियंत्रण के सापेक्ष एसएसडीएनए प्रवर्धन। रिवर्सल होने पर, एसएसडीएनए एम्प्लिकॉन जीनोमिक डीएसडीएनए नियंत्रण के अपेक्षित 0.5 पर बढ़ता है। (ई) डीएसडीएनए इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन नियंत्रण जीनोमिक डीएसडीएनए नियंत्रण के साथ और बिना सोरालेन क्रॉसलिंक रिवर्सल के साथ। (एफ) डीएसडीएनए बंधाव नियंत्रण के सापेक्ष डीएलसी सिग्नल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: वर्तमान डीएलसी / डीएलई परख प्रणाली और प्रस्तावित संशोधन। ऊपर: वर्तमान डीएलसी / डीएलई परख ब्रेक साइट और दाता दिखाए गए हैं। नीचे: डीएलसी / डीएलई परख ब्रेक साइट और दाता में नियोजित संशोधन। (I) 117 बीपी एचओ एंडोन्यूक्लिज़ कट साइट पीले रंग में इंगित की गई है। डी-लूप व्यवधान की निगरानी करते समय भ्रामक प्रभावों को रोकने के लिए, एचओसी (74 बीपी) के बाईं ओर दाता में पेश किया जाएगा, जैसे कि दोनों के बीच पुनर्संयोजन 3 'फ्लैप की कमी वाला पूरी तरह से मेल खाने वाला डी-लूप बनाता है। (II) प्रणाली को मरम्मत योग्य बनाने के लिए और इस प्रकार, दाता के समरूप डीएनए (टील और बकाइन में इंगित) को एचओसी के दाईं ओर डाला जाएगा। (III) एचओसी के दाईं ओर स्ट्रैंड द्वारा आक्रमण और विस्तार की निगरानी ब्रेक के उस तरफ (नारंगी में इंगित) के लिए अद्वितीय अनुक्रमों का उपयोग करके की जाएगी। (iv) दाता के लिए विशिष्ट अतिरिक्त समान रूप से स्पेसकिए गए प्रतिबंध एंजाइम साइटें और अनुक्रम डी-लूप एक्सटेंशन (एचओसी के बाईं ओर से आक्रमण के माध्यम से) को अधिक दूर के स्थलों पर निगरानी करने की अनुमति देंगे। इस संशोधित प्रणाली में, संश्लेषण-निर्भर स्ट्रैंड एनीलिंग (एसडीएसए) या डबल-हॉलिडे जंक्शन (डीएचजे) गठन टील या बकाइन में दिखाए गए स्थलों पर हो सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा एस 1: डीएलसी और डीएलई परख में उपयोग किए जाने वाले क्यूपीसीआर प्राइमरों का नक्शा। डीएलसी और डीएलई परख, उनकी प्रासंगिक विशेषताओं और अनुमानित प्राइमर बाइंडिंग साइटों में विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले जीनोमिक लोकी का नक्शा (क्यूपीसीआर प्राइमरों की सूची के लिए तालिका 3 देखें)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: बड़े एम्प्लिकॉन पर क्रॉसलिंक रिवर्सल का गुणात्मक मूल्यांकन। जीनोमिक डीएनए क्रॉसलिंक्ड या गैर-क्रॉसलिंक नमूनों से तैयार किया गया था, जहां प्रोटोकॉल में वर्णित, अनुभाग 1-5 में बताया गया है। ब्रेक साइट और डोनर के बीच साझा किए गए होमोलॉजी के क्षेत्र में फैले 3 केबीपी सेगमेंट को बढ़ाने के लिए गैर-मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग किया गया था। ध्यान दें कि, क्रॉसलिंक्ड और गैर-क्रॉसलिंक्ड डीएनए और नमूने की सीमित मात्रा के बीच प्रवर्धन दक्षता में अंतर के कारण, इनपुट डीएनए को मानकीकृत करना संभव नहीं था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: डीएलसी और डीएलई परख विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एस सेरेविसिया स्ट्रेन। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अगुणित नवोदित खमीर तनाव का जीनोटाइप। अनुरोध पर तनाव उपलब्ध है। डीएलई परख विश्लेषण के लिए उपलब्ध अतिरिक्त उपभेदों को पियाज़ा एट अल.8 और पियाज़ा एट अल.9 में पाया जा सकता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: डीएलसी और डीएलई परख विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स को हाइब्रिड करना। डीएलसी और डीएलई परख में उपयोग किए जाने वाले लंबे, संकरण ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के अनुक्रम। कस्टम ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्रदाता द्वारा हाइब्रिडिंग ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के अतिरिक्त एसडीएस-पेज शुद्धिकरण की सिफारिश की जाती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: डीएलसी और डीएलई परख विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले क्यूपीसीआर प्राइमर। डीएलसी और डीएलई परख के लिए क्यूपीसीआर प्राइमर जोड़े और उनके उद्देश्यों का विवरण। ध्यान दें कि olWDH1764, olWDH2009, और olWDH2010 का उपयोग दो QPCR में किया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: डीएलसी परख क्यूपीसीआर सेटअप और विश्लेषण के लिए टेम्पलेट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: डीएलई परख क्यूपीसीआर सेटअप और विश्लेषण के लिए टेम्पलेट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक अनुक्रम फाइलें 1-5. प्रासंगिक जीनोमिक सुविधाओं और एम्प्लिकॉन के लिए पूरक अनुक्रम फाइलें। अनुक्रम फ़ाइलें APE फ़ाइल स्वरूप में हैं; एपीई डीएनए अनुक्रमों को देखने और संपादित करने के लिए एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर है। एपीई फाइलें सभी प्रमुख अनुक्रम संपादन सॉफ्टवेयर के साथ भी संगत हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रस्तुत परख निकटता बंधाव और क्यूपीसीआर का उपयोग करके नवजात और विस्तारित डी-लूप (डीएलसी परख), डी-लूप एक्सटेंशन (डीएलई परख), और बीआईआर उत्पाद गठन (बिना हाइब्रिडिंग ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के साथ डीएलई परख) का पता लगाने की अनुमति देते हैं। डीएसबी से दूर की साइटों के लिए Rad51 के CHIP-qPCR को पहले Rad51-मध्यस्थता होमोलॉजी खोज और D-लूप गठन के लिए प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, यह CHIP-qPCR सिग्नल ब्रेक साइट और संभावित दाता के बीच अनुक्रम होमोलॉजी के साथ-साथ Rad51-संबद्ध कारक Rad54 से स्वतंत्र है, और इस प्रकार, D-लूप मध्यवर्ती10,11 के बजाय Rad51-ssDNA फिलामेंट और dsDNA के बीच एक क्षणिक संबंध का प्रतिनिधित्व करने की अधिक संभावना है। इसके विपरीत, डीएलसी सिग्नल डीएसबी गठन, Rad51, Rad52, Rad54, और DSB और दाता साइट के बीच साझा अनुक्रम होमोलॉजी पर निर्भर करताहै। इसके अलावा, एमपीएच 1 और एसआरएस 2 हेलिकेस और एसजीएस 1-टॉप 3-आरएमआई 1 हेलिकेस-टोपोइसोमेरेस कॉम्प्लेक्स की अनुपस्थिति में बढ़े हुए डीएलसी संकेत देखे जाते हैं, जो पिछली रिपोर्टों के अनुरूप हैं कि ये तीन कारक विट्रो 8,25,26,27 में Rad51/ Rad54-निर्मित नवजात डी-लूप को अलग कर सकते हैं। डीएलई परख इसी तरह पुनर्संयोजन से जुड़े डीएनए संश्लेषण का पालन करने के लिए पिछले तरीकों पर सुधार का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि यह डी-लूप एक्सटेंशन और बीआईआर उत्पाद गठन 19 के बीच अंतर करसकता है।

जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, क्यूपीसीआर नियंत्रण, जिनमें जीनोमिक डीएनए, डीएसबी प्रेरण, सोरालेन क्रॉस-लिंकिंग, इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संकरण शामिल हैं, इन परखों की सफलता और प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं। कच्चे जीनोमिक डीएनए क्यूपीसीआर मान नमूनों में लगभग बराबर होना चाहिए। एआरजी 4 जीनोमिक डीएनए नियंत्रण के लिए कम सीपी मान अतिरिक्त डीएनए का संकेत देते हैं, और एकत्र की गई कोशिकाओं की संख्या को समायोजित किया जाना चाहिए। इस नियंत्रण के लिए उच्च सीपी मान अपर्याप्त डीएनए वसूली या अभिकर्मकों के साथ संदूषण का संकेत देते हैं जो क्यूपीसीआर में हस्तक्षेप करते हैं। स्फेरोप्लास्टिंग के बाद, सेल लाइसिस को एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप और नमूना और बाँझ पानी की समान मात्रा का उपयोग करके देखा जा सकता है। यदि पानी के अतिरिक्त अपर्याप्त लाइसिस देखा जाता है, तो ज़िमोलाइज़ समाधान को फिर से बनाया जाना चाहिए, या 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन को लंबा किया जाना चाहिए। पी /सी / आईए निष्कर्षण द्वारा डीएनए शुद्धिकरण के दौरान नमूना खोया जा सकता है या दूषित पदार्थ पेश किए जा सकते हैं। डीएनए की कुशल वसूली के लिए, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि पी / सी / आईए के पीएच को ~ 8.0 में समायोजित किया गया है और ऊपरी चरण को हटाते समय निचला चरण परेशान नहीं है। अंत में, 1x TE में डीएनए गोली के अक्षम पुन: निलंबन के परिणामस्वरूप कम सीपी मान हो सकते हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक लंबा इनक्यूबेशन और भंवर डीएनए गोली के पुन: निलंबन में सुधार करेगा।

जीनोमिक डीएनए जीनोमिक डीएनए नियंत्रण के अलावा, डीएसबी प्रेरण और प्रतिबंध एंजाइम दरार नियंत्रण प्रतिक्रियाएं भी नमूनों में समान होनी चाहिए। डीएसबी या प्रतिबंध एंजाइम मान्यता साइट की साइट पर एचओ एंडोन्यूक्लिज़ या प्रतिबंध एंजाइम काटने से इस क्षेत्र में प्रवर्धन को रोका जाता है; इसलिए, इन नियंत्रणों के लिए विशिष्ट सामान्यीकृत क्यूपीसीआर मान शून्य के पास हैं, और एक उच्च क्यूपीसीआर मान अपर्याप्त दरार को इंगित करता है। यदि डीएसबी की साइट पर एक उच्च संकेत देखा जाता है, तो गैलेक्टोज समाधान को फिर से बनाया जाना चाहिए। ज्ञात सेल चक्र दोष वाले उत्परिवर्ती के लिए, डीएसबी प्रेरण को गैलेक्टोज के साथ पूरक वाईपीडीए और वाईपीए मीडिया पर प्रोटोकॉल (अनुभाग 1 देखें) के अनुसार उगाए गए संस्कृति की समान मात्रा को चढ़ाकर निर्धारित किया जाना चाहिए। गैलेक्टोज युक्त मीडिया पर उगने वाली कॉलोनियां खमीर का प्रतिनिधित्व करती हैं जिसमें अंत-जुड़ने से एक अशुद्ध एचओसी बन जाता है। यदि जंगली प्रकार के सापेक्ष रुचि के उत्परिवर्ती में काफी अधिक अंत-जुड़ने वाली घटनाएं हैं, तो डीएसबी प्रेरण में इस अंतर की भरपाई के लिए एक सुधार लागू किया जाना चाहिए, जो डीएलसी / डीएलई सिग्नल को प्रभावित करेगा।

तीन प्राइमर जोड़े (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012, और olWDH2009/olWDH2011) हाइब्रिडिंग ऑलिगोस द्वारा प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली का आकलन करते हैं और EcoRI-HF और HindIII-HF प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा काटते हैं। इसके अलावा, इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन नियंत्रण भी पर्याप्त प्रतिबंध एंजाइम पाचन पर निर्भर करता है। इस प्रकार, कम इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन दक्षता और इन तीन प्राइमर जोड़े में से एक के लिए उच्च संकेत वाले नमूने में अपर्याप्त प्रतिबंध एंजाइम काटने होते हैं। बाद की तैयारी में अतिरिक्त प्रतिबंध एंजाइम प्रदान किया जाना चाहिए, और प्रतिबंध एंजाइम की प्रभावकारिता का मूल्यांकन जीनोमिक डीएनए पर किया जाना चाहिए। olWDH1769 / olWDH1763 प्राइमर जोड़ी डीएलसी परख के लिए एक अतिरिक्त नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करती है, जो डीएपी 2 पर इकोआरआई दरार को मापती है, जहां इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन दक्षता भी मापी जाती है। पर्याप्त इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन सिग्नल के साथ एक नमूना लेकिन इन तीन प्राइमर जोड़े में से एक के लिए एक उच्च संकेत में हाइब्रिडिंग ऑलिगोस द्वारा अपर्याप्त प्रतिबंध एंजाइम साइट बहाली है। इस समस्या को हल करने के लिए, डुप्लिकेट नमूने एकत्र किए जाने चाहिए और प्रभावित संकरण ऑलिगो (ओं) की एकाग्रता विविध होनी चाहिए। ऑलिगोस के साथ और बिना संकरण के इन प्रतिक्रियाओं के लिए प्राप्त विशिष्ट क्यूपीसीआर मान चित्रा 3 और चित्रा 4 में और पियाज़ा एट अल.8 और पियाज़ा एट अल.9 में पाए जा सकते हैं।

डीएलसी और डीएलई परख दोनों के लिए, जीनोमिक डीएनए नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत 0.15-0.35 की इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन दक्षता को सामान्य माना जाता है। चूंकि नवजात और विस्तारित डी-लूप और बीआईआर उत्पाद का पता लगाना कुशल बंधाव पर निर्भर है, इसलिए कम लिगेशन संकेतों वाले नमूनों को छोड़ दिया जाना चाहिए। एटीपी की कमी वाले 10x लिगेशन बफर को 6 महीने से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। बहुत अधिक कोशिकाओं को इकट्ठा करने से इंटरमॉलिक्युलर लिगेशन हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कम इंट्रामोलेक्यूलर लिगेशन दक्षता और डीएलसी / डीएलई सिग्नल होगा।

हालांकि डीएलसी और डीएलई परख के लिए ये नियंत्रण लगभग सभी संवेदनशील चरणों पर रिपोर्ट करते हैं, फिर भी डीएलसी या डीएलई सिग्नल के लिए गैर-शारीरिक मूल्यों को प्राप्त करना संभव है जब ये नियंत्रण उचित सीमा के भीतर होते हैं। एक कम डीएलसी या डीएलई सिग्नल सेल स्फेरोप्लास्टिंग चरण में त्रुटियों के परिणामस्वरूप हो सकता है, जो बेहद संवेदनशील है। किसी को समानांतर में केवल कुछ नमूनों को संसाधित करना चाहिए और उन्हें हर समय 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना चाहिए। एक उच्च / निम्न डीएलसी / डीएलई सिग्नल प्रत्येक समय बिंदु पर बहुत अधिक / कुछ कोशिकाओं को इकट्ठा करने के परिणामस्वरूप भी हो सकता है। प्रत्येक नमूने के लिए प्रत्येक समय बिंदु पर कई ओडी600एस कोशिकाओं को एकत्र करके इस समस्या को संबोधित किया जा सकता है।

उनके वर्तमान रूप में डीएलसी और डीएलई परख के लिए कई तकनीकी और वैचारिक सीमाएं हैं। सबसे पहले, सोरालेन-मध्यस्थता इंटर-स्ट्रैंड क्रॉसलिंक घनत्व ~ 1 में 500 बीपी8 है। इसलिए, एक बढ़ा हुआ डीएलसी सिग्नल या तो यह संकेत दे सकता है कि आबादी में अधिक डी-लूप हैं, कि आबादी में डी-लूप की औसत लंबाई बढ़ गई है (यह मानते हुए कि डी-लूप 500 बीपी से छोटा हो सकता है), या दोनों। इसके अलावा, डीएलसी परख द्वारा डी-लूप पर कब्जा करने की संभावना डी-लूप की लंबाई कम होने के साथ कम हो जाती है। यह देखते हुए कि बहुत कम डी-लूप कुछ उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में कुल डी-लूप आबादी का एक महत्वपूर्ण अंश हो सकता है, परिणामों की व्याख्या करते समय परख की इस सीमा पर विचार किया जाना चाहिए। दूसरा, डीएलसी परख को डीएनए क्रॉसलिंकिंग की आवश्यकता होती है, जबकि डीएलई परख नहीं करती है। पहले, किसी दिए गए प्रयोग के लिए, इसका मतलब था कि डीएलसी और डीएलई नमूनों को अलग से एकत्र और विश्लेषण किया जाना था। चित्रा 5 में दिखाई गई विधि मजबूत क्रॉसलिंक रिवर्सल प्राप्त करती है, जिससे एक ही संस्कृति से कई नमूने एकत्र करने की आवश्यकता कम हो जाती है। हिंदIII मान्यता साइट के डाउनस्ट्रीम में टूटे हुए स्ट्रैंड पर एक दूसरे इकोआरआई प्रतिबंध एंजाइम साइट की शुरूआत, अनुक्रमिक डीएलसी और डीएलई विश्लेषण को सक्षम करेगी।

इन तकनीकी सीमाओं के अलावा, डीएलसी और डीएलई परख प्रणाली वर्तमान में व्यवहार्य मानव संसाधन उत्पादों की वसूली की अनुमति नहीं देती है क्योंकि इंड्यूसेबल डीएसबी के दाईं ओर दाता के लिए होमोलॉजी का अभाव है। कैनेटीक्स और दूसरे अंत जुड़ाव और संश्लेषण के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, सिस्टम को इस तरह से संशोधित किया जा सकता है कि ब्रेक के दूसरे छोर और दाता के बीच साझा किए गए होमोलॉजी के समीपस्थ या डिस्टल क्षेत्र का उपयोग करके मरम्मत संभव है (चित्रा 6)। आगे देखते हुए, डीएलसी और डीएलई परख को अन्य तकनीकों के साथ जोड़ना व्यावहारिक साबित हो सकता है, जैसे कि सीएचआईपी-क्यूपीसीआर, उच्च-थ्रूपुट क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर (हाई-सी), और विवो डी-लूप मैपिंग में , कैनेटीक्स का व्यापक विश्लेषण और एचआर मार्ग में चरणों के विनियमन को प्राप्त करने के लिए, जिसमें ब्रेक फॉर्मेशन, एंड रिसेक्शन, रेड 51 फिलामेंट फॉर्मेशन, नवजात डी-लूप गठन शामिल हैं। डी-लूप एक्सटेंशन, डी-लूप रिवर्सल, सेकंड एंड एंगेजमेंट, सेकंड एंड सिंथेसिस और रिज़ॉल्यूशन28।

सारांश में, डीएलसी और डीएलई परख निकटता बंधाव के सिद्धांत का उपयोग करके नवजात और विस्तारित डी-लूप, डी-लूप विस्तार और बीआईआर उत्पाद गठन की मात्रा का परिमाणीकरण करने की अनुमति देते हैं। ये परख क्षेत्र में प्रमुख प्रगति का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि वे डी-लूप गठन के अर्ध-मात्रात्मक माप और सेलुलर व्यवहार्यता से स्वतंत्र विस्तार की अनुमति देने वाले पहले व्यक्ति हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हेयर प्रयोगशाला में काम को डब्ल्यू-डीएच को जीएम 58015 और जीएम 137751 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है। पियाज़ा प्रयोगशाला में अनुसंधान यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी-एसटीजी 3 डी-लूप, ग्रैंड एग्रीमेंट 851006) द्वारा समर्थित है। डी.आर. को T32CA108459 और A.P. Gianni फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया है। हम शिह-सुन हंग (हेयर लैब) को अपने डीएलसी / डीएलई परख परिणामों को साझा करने और इस प्रोटोकॉल में विस्तृत परख में परिवर्तनों को भी मान्य करने के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup Sigma-Aldrich L1375 For media preparation
Agar Fisher BP1423500 For media preparation
Bacto peptone BD Difco 211840 For media preparation
Bacto yeast extract BD Difco 212750 For media preparation
D-(+)-glucose BD Difco 0155-17-4 For media preparation
Trioxsalen Sigma-Aldrich T6137 For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T US Biological Z1004 For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF New England Biolabs R3101 Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF New England Biolabs R3104 Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480 Roche 5015278001 qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white Roche 4729692001 96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix BioRad 1725271 qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001 qPCR kit used by the authors

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References

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जेनेटिक्स अंक 187 डी-लूप जीनोम स्थिरता संयुक्त अणु Rad51 ब्रेक-प्रेरित प्रतिकृति
<em>सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया</em> में प्रॉक्सिमिटी लिगेशन और क्वांटिटेटिव पीसीआर के <em>माध्यम से</em> होमोलोगस रिकॉम्बिनेशन इंटरमीडिएट्स का पता लगाना
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Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A., Heyer, W. D. Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (187), e64240, doi:10.3791/64240 (2022).

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