Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Detektion av homologa rekombinationsintermediärer via närhetsligering och kvantitativ PCR i Saccharomyces cerevisiae

Published: September 11, 2022 doi: 10.3791/64240
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,3
1Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, Davis, 2Laboratory of Biology & Modeling of the Cell, École Normale Supérieure de Lyon, 3Department of Molecular & Cellular Biology, University of California, Davis

Summary

D-loop capture (DLC) och D-loop extension (DLE) analyser använder principen om närhetsligering tillsammans med kvantitativ PCR för att kvantifiera D-loop-bildning, D-loop-förlängning och produktbildning på platsen för en inducerbar dubbelsträngad brytning i Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

DNA-skador, inklusive DNA-dubbelsträngade brott och tvärbindningar mellan strängar, som uppstår under S- och G2-faserna i cellcykeln kan repareras genom homolog rekombination (HR). Dessutom representerar HR en viktig mekanism för replikeringsgaffelräddning efter stopp eller kollaps. Regleringen av de många reversibla och irreversibla stegen i denna komplexa väg främjar dess trohet. Den fysiska analysen av rekombinationsintermediärerna som bildas under HR möjliggör karakterisering av dessa kontroller av olika nukleoproteinfaktorer och deras interagerare. Även om det finns väletablerade metoder för att analysera specifika händelser och intermediärer i rekombinationsvägen, har detektionen av D-loopbildning och förlängning, två kritiska steg i denna väg, visat sig vara utmanande tills nyligen. Här beskrivs effektiva metoder för att detektera viktiga händelser i HR-vägen, nämligen DNA-dubbelsträngad brytbildning, D-loopbildning, D-loopförlängning och bildandet av produkter via break-induced replication (BIR) i Saccharomyces cerevisiae . Dessa analyser detekterar deras relevanta rekombinationsintermediärer och produkter med hög känslighet och är oberoende av cellulär livskraft. Detekteringen av D-slingor, D-loopförlängning och BIR-produkten baseras på närhetsligering. Tillsammans möjliggör dessa analyser studier av kinetiken för HR på befolkningsnivå för att fint ta itu med funktionerna hos HR-proteiner och regulatorer vid betydande steg i vägen.

Introduction

Homolog rekombination (HR) är en högkvalitativ mekanism för reparation av DNA-dubbelsträngade brott (DSB), tvärbindningar mellan strängar och ssDNA-luckor, samt en väg för DNA-skadetolerans. HR skiljer sig från felbenägna vägar för reparation/tolerans av DNA-skador, såsom icke-homolog ändfogning (NHEJ) och translesionssyntes, genom att den använder ett intakt, homologt duplex-DNA som givare för att malla reparationshändelsen. Dessutom är många av de viktigaste intermediärerna i HR-vägen reversibla, vilket möjliggör utsökt reglering av de enskilda vägstegen. Under S-, G2- och M-faserna i cellcykeln konkurrerar HR med NHEJ om reparation av de tvåändade DSB: erna1. Dessutom är HR avgörande för DNA-replikation för reparation av replikationsassocierade DNA-skador, inklusive ssDNA-luckor och ensidiga DSB: er, och som en mekanism för DNA-lesionsbypass2.

En kritisk mellanprodukt i HR-vägen är förskjutningsslingan eller D-slingan (figur 1). Efter ändresektion laddas det centrala rekombinaset i reaktionen, Rad51, på den nyligen resekterade ssDNA av den trasiga molekylen och bildar ett spiralformat filament2. Rad51 utför sedan en homologisökning för att identifiera en lämplig homolog donator, vanligtvis systerkromatiden i somatiska celler. D-slingan bildas när Rad51-ssDNA-filamentet invaderar ett homologt duplex-DNA, vilket leder till Watson-Crick-basparningen av den trasiga strängen med givarens komplementära sträng och förskjuter den motsatta givarsträngen. Förlängning av 3'-änden av den trasiga strängen med ett DNA-polymeras ersätter baserna som förlorades under DNA-skadehändelsen och främjar upplösningen av den utökade D-loop-mellanprodukten till en dsDNA-produkt genom syntesberoende strängglödgning (SDSA), dubbel-Holliday-korsningen (dHJ) eller den brytinducerade replikationen (BIR) HR-undervägar.

Analyser som fysiskt övervakar intermediärerna i HR-vägen möjliggör analys av de genetiska kraven för varje steg (dvs. väganalys). DSB-bildning, ändresektion, dHJs, BIR-replikationsbubblor och HR-produkter observeras lätt av Southern blotting 3,4,5,6,7. Ändå misslyckas Southern blotting med att rapportera om begynnande och utökade D-slingor, och därför krävs en alternativ metod för att på ett tillförlitligt sätt mäta dessa ledmolekyler 4,8,9. En allmänt använd strategi för att analysera begynnande D-loopbildning är kromatin-immunoprecipitation (ChIP) av Rad51 i kombination med kvantitativ PCR (qPCR)10,11. Rad51-associationen med dsDNA mätt med ChIP-qPCR är dock oberoende av sekvenshomologi och Rad51-tillbehörsfaktorn Rad5410,11. Däremot beror en märkbar signal med hjälp av metoden för D-loop-analys som presenteras här, kallad D-loop capture (DLC) -analysen, på DSB-bildning, sekvenshomologi, Rad51 och Rad51-tillbehörsproteinerna Rad52 och Rad548. Slutsatsen att Saccharomyces cerevisiae Rad51-främjad D-loopbildning beror på Rad54 in vivo överensstämmer med många in vitro-rekonstitueringsexperiment som indikerar att Rad54 krävs för homologisökning och D-loopbildning av spirande jäst Rad518,12,13,14,15.

Nuvarande metoder för att mäta D-loop-förlängning, främst genom semikvantitativ PCR, är lika problematiska. En typisk PCR-baserad analys för att detektera D-loopförlängning förstärker en unik sekvens, som härrör från rekombination mellan ett brytställe och en ektopisk givare och den efterföljande rekombinationsassocierade DNA-syntesen, via en primer uppströms homologiområdet på den trasiga strängen och en annan primer nedströms homologiområdet på donatorsträngen. Med hjälp av denna metod kräver detektion av rekombinationsassocierad DNA-syntes den icke-väsentliga Pol δ processivitetsfaktorn Pol3216. Detta fynd strider mot observationen att POL32-radering endast har en mild effekt på genomvandling in vivo17. Dessutom misslyckas dessa PCR-baserade analyser med att tidsmässigt lösa D-loop-förlängning och BIR-produktbildning, vilket tyder på att signalen är resultatet av dsDNA-produkter snarare än ssDNA-mellanprodukter17,18,19. D-loop-tillägget (DLE) har nyligen utvecklats för att åtgärda dessa avvikelser. DLE-analysen kvantifierar rekombinationsassocierad DNA-syntes på en plats ~ 400 baspar (bp) nedströms den initiala 3 'invaderande änden9. Med denna metod är D-loopförlängning oberoende av Pol32 och kan detekteras inom 4 timmar efter DSB-induktion, medan BIR-produkter först observeras vid 6 timmar. Faktum är att en ny publikation från Haber- och Malkova-laboratorierna noterade att användning av denna metod för beredning av genomiskt DNA singulärt resulterar i ssDNA-bevarande 9,20.

Här beskrivs DLC- och DLE-analyserna i detalj. Dessa analyser förlitar sig på närhetsligering för att detektera begynnande och utökade D-slingor i S. cerevisiae (figur 2)8,9. BIR-produkter kan kvantifieras med samma analyssystem. För båda analyserna induceras DSB-bildning vid en HO-endonukleasskärningsplats belägen vid URA3-locus på kromosom (Chr.) V genom uttrycket av HO-endonukleas under kontroll av en galaktosinducerbar promotor. Rad51-medierad DNA-stränginvasion leder till begynnande D-loopbildning på platsen för en ektopisk givare belägen vid LYS2-locus på Chr. II. Eftersom den högra sidan av DSB saknar homologi till givaren är reparation via SDSA och dHJ-bildning inte möjlig. Initial reparation av DSB av BIR är möjlig, men bildandet av livskraftiga produkter hämmas av närvaron av centromeren21. Denna avsiktliga design förhindrar produktiv DSB-reparation och undviker därmed återupptagande av tillväxt av celler med reparerade DBS, som annars skulle kunna ta över kulturen under tidsförloppsanalysen.

I DLC-analysen bevarar psoralen-tvärbindningen av de två strängarna i heteroduplex-DNA i D-slingan rekombinationsmellanprodukten. Efter restaurering av restriktionsenzymstället på den trasiga (resekterade) strängen och matsmältningen möjliggör tvärbindningen ligering av de unika sekvenserna uppströms de homologa trasiga och donator-DNA: erna. Med hjälp av qPCR kvantifieras nivån av chimär DNA-molekyl som finns i varje prov. I DLE-analysen krävs inte tvärbindning, och restriktionsenzymets återställande och matsmältning följt av intramolekylär ligering länkar istället 5'-änden av den trasiga molekylen till den nyligen utökade 3'-änden. Återigen används qPCR för att kvantifiera de relativa mängderna av denna chimära produkt i varje prov. I avsaknad av restaurering av restriktionsenzymstället rapporterar DLE-analysen om de relativa nivåerna av BIR-produkten (dsDNA) som bildas efter D-loopförlängning.

Representativa resultat för varje analys med en vild stam visas, och läsarna hänvisas till Piazza et al.8 och Piazza et al.9 för användning av dessa analyser för analys av rekombinationsmutanter 8,9. Avsikten med detta bidrag är att göra det möjligt för andra laboratorier att anta DLC- och DLE-analyserna, och stöd för dem är tillgängligt på begäran.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förtillväxt, DSB-induktion och provinsamling

OBS: Tillskott av alla medier med 0.01% adenin rekommenderas för Ade-stammar.

  1. Stryk ut lämpliga haploida stammar (se tabell 1) på jästpeptondextrosadenin (YPDA) ( 1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos, 2% agar, 0,001% adenin) och växa i 2 dagar vid 30 °C.
  2. Använd en enda koloni för att inokulera 5 ml YPDA i ett 15 ml glasodlingsrör. Odla kulturer till mättnad vid 30 °C med skakning eller rotation för luftning.
  3. DLC-analys: Bered 5x psoralenstamlösningen (0,5 mg/ml trioxsalen i 200-säker etanol) i en dragskåp genom att lösa upp psoralen i ett 50 ml koniskt rör insvept i aluminiumfolie över natten vid rumstemperatur med kontinuerlig skakning eller inversion. Täta skruvtoppen med en transparent film för att förhindra avdunstning. Bered inte mer än 7 ml 5x psoralen stamlösning per 50 ml koniskt rör för att säkerställa korrekt upplösning av psoralen.
  4. Nästa dag, använd 5 ml av YPDA odlad nattkultur för att inokulera 50-100 ml YEP-laktat (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% w / w laktat, 0,001% adenin) i en lämplig storlek kolv (spirande jäst växer optimalt i en kolv som är minst 5x volymen av kulturen) till en OD600 på ~ 0,03.
  5. Odla kulturen i ~ 16 timmar vid 30 ° C med skakning vid 220 rpm. Efter ~ 16 h, mät kulturens OD600 och det ska vara ~ 0,5-0,8. Använd inte under- eller övervuxna kulturer.
  6. För varje tidpunkt, samla lämplig volym celler i ett koniskt rör och placera på is. Vanligtvis är detta 1 x 108 celler (cirka 7,5 ml kultur vid OD 600 1,0 för en haploid vild typstam) för DLC-analysen och 5 x 107 celler (cirka 2,5 ml kultur vid OD600 1,0) för DLE-analysen.
  7. För att säkerställa noggrannheten i OD 600-värdena, förbered 1:5-utspädningar för kulturer med en OD600≥0,2 för att hålla OD-avläsningen på 0,2 eller lägre. För stammar av vild typ är optimala tidpunkter för DLC-analys mellan 2 h och 6 h, och optimala tidpunkter för DLE-analys är mellan 4 h och 8 h (se figur 3 och figur 4).
  8. DLC-analys
    1. Före varje tidpunkt, förbered tillräckligt med 1x psoralenlösning (0,1 mg / ml trioxsalen, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% etanol) i en dragskåp för alla prover i ett 50 ml koniskt rör insvept i folie. Lämna på RT.
    2. Centrifugera proverna vid 2 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Återsuspendera pelleten i 2,5 ml 1x psoralenlösning i en dragskåp och överför till en 60 mm x 15 mm petriskål. Alternativt kan du återsuspendera pelleten i 2,5 ml TE1-lösning (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) för en kontroll utan tvärbindning.
    3. Tvärlänka proverna. För en UV-tvärbindare som passar med långvågiga (365 nm) glödlampor, placera petriskålarna 1-2 cm under UV-ljuskällan med locket borttaget ovanpå en plast- eller plexiglasplatta som har förkylts vid −20 ° C. För en UV-ljuslåda, placera petriskålarna direkt ovanpå UV-ljuskällan. Exponera proverna i 10 minuter med försiktig skakning.
      OBS: Det rekommenderas att ställa UV-ljuskällan ovanpå en orbital shaker inställd på ~ 50 rpm.
    4. Överför provet i en dragskåp till ett nytt 15 ml rör. Skölj petriskålen med 2,5 ml TE1-lösning och tillsätt den i röret. Centrifugera proverna vid 2 500 x g i 5 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten ordentligt och förvara pelleten vid −20 °C. Proverna kan förvaras i upp till 1 vecka innan de går vidare till nästa steg.
  9. DLE-analys
    1. Centrifugera proverna vid 2 500 x g i 5 minuter vid 4 °C. Tvätta cellpelleten i 2,5 ml kall TE1-lösning innan du upprepar centrifugeringen och förvarar pelletsen vid −20 °C. Prover kan lagras i upp till 1 vecka innan de går vidare till nästa steg.
  10. För provtagning vid 0 h, samla proverna innan 20% galaktos tillsätts. För efterföljande tidpunkter, inducera DSB-bildning genom att tillsätta 20% galaktos till kulturerna till en slutlig koncentration av 2%. Samla de återstående proverna enligt beskrivningen ovan, pellet, och frys i förhållande till tiden efter DSB-induktionen (dvs. 4 h-provet samlas in 4 timmar efter tillsats av 20% galaktos).

2. Cellförstöring, lys och restaurering av restriktionsstället

  1. Tina proverna på is. Förvärm ett torrt bad till 30 °C.
  2. Återsuspendera proverna i 1 ml sfäroplastbuffert (0,4 M sorbitol, 0,4 M KCl, 40 mM natriumfosfatbuffert pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) och överför till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  3. Tillsätt 3,5 μl zymolosslösning (2% glukos, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml zymolyas 100T; 17,5 μg/ml zymolyas slutlig koncentration). Blanda försiktigt genom att knacka eller inversion. Inkubera vid 30 °C i 15 minuter och lägg sedan på is. Under inkubationen på 15 minuter, få flytande kväve eller torris.
  4. Centrifugera i 3 minuter vid 2 500 x g vid 4 °C och placera proverna på is. Tvätta proverna 3x i 1 ml sfäroplasteringsbuffert. Centrifugera proverna i 3 minuter vid 2 500 x g vid 4 °C.
  5. Återsuspendera proverna i 1 ml kall 1x restriktionsenzymbuffert (50 mM kaliumacetat, 20 mM Trisacetat, 10 mM magnesiumacetat, 100 μg/ml BSA pH ~8,0 vid RT) och centrifugera i 3 minuter vid 16 000 x g vid 4 °C. Lägg proverna på is. Upprepa tvätten 1x.
  6. Återsuspendera proverna i 1 ml kall 1x restriktionsenzymbuffert. Dela provet (0,5 ml vardera) i två 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera proverna i 3 minuter vid 16 000 x g vid 4 °C.
  7. Återsuspendera ett rör från varje prov i 180 μl 1,4x restriktionsenzymbuffert med hybridiserande oligos (se tabell 2) och ett rör i 180 μl 1,4x restriktionsenzymbuffert utan hybridiserande oligos. Varje hybridiserande oligo återsuspenderas i 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) och används vid en slutlig koncentration av 7 nM. 1x TE ersätter de hybridiserande oligosna i 1,4x restriktionsenzymbufferten utan att hybridisera oligos.
    ANMÄRKNING: De hybridiserande oligoerna skall förvaras vid −20 °C i små alikvoter vid arbetsutspädningen. Koncentrationen av de hybridiserande oligoerna kan kräva optimering; se Diskussion.
  8. Snäppfrys proverna i flytande kväve eller torris/etanol och förvara vid −80 °C. Prover kan lagras i detta skede i flera månader.

3. Restriktionsenzymsmältning och intramolekylär ligering

  1. Tina proverna på is. Förvärm ett torrt bad till 65 °C och ett annat till 37 °C.
  2. Pipett 36 μL av provet i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör på is. Återför omedelbart det återstående provet till −80 °C för förvaring.
  3. Tillsätt 4 μL 1% SDS (0,1% slutlig koncentration) och blanda genom att försiktigt knacka på sidan av röret. Inkubera vid 65 °C i 15 min med försiktig knackning var 5:e minut. Lägg proverna på is omedelbart efter inkubationen.
    OBS: Denna SDS-behandling främjar denaturering av DNA-associerade proteiner, solubilisering av kärnhöljet och kromatintillgänglighet före restriktionsenzymsmältningen och intramolekylära ligeringssteg.
  4. Tillsätt 4,5 μl 10% Triton X-100 (1% slutlig koncentration) och blanda genom pipettering. Tillsätt 20–50 U restriktionsenzym (EcoRI-HF eller HindIII-HF) till varje prov och inkubera vid 37 °C i 1 timme med försiktig omrörning var 20–30:e minut. Under denna tid, förvärm ett torrt bad till 55 ° C och förinställ ett vattenbad till 16 ° C.
  5. Tillsätt 8,6 μl 10% SDS (1,5% slutlig koncentration) till varje prov och blanda genom pipettering och tappning. Inkubera vid 55 °C i 10 minuter. Tillsätt 80 μl 10 % Triton X-100 (6 % slutlig koncentration) till varje prov och blanda genom pipettering.
  6. Tillsätt 660 μL 1x ligeringsbuffert utan ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/ml BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA-ligas (8 U/prov) till varje prov och blanda genom mild inversion. Inkubera vid 16 °C i 1,5 timmar med inversion var 30:e minut. Lägg proverna på is omedelbart efter inkubationen.

4. DNA-rening

  1. Förvärm ett torrt bad till 65 °C och ett annat till 37 °C. Tillsätt 1 μl 10 mg/ml proteinas K (berett i 1x TE pH 8,0) till varje prov (12,5 μg/ml slutlig koncentration). Inkubera vid 65 °C i 30 minuter och lägg proverna på is omedelbart efter inkubationen tills de har svalnat.
  2. Överför proverna till 2 ml rör. Arbeta i en dragskåp, tillsätt en lika stor volym (~ 800 μL) fenol / kloroform / isoamylalkohol (P / C / IA; pH 8.0) till varje prov. Virvla proverna i ~30 s och centrifugera proverna i 5-10 min vid 16 000 x g i en mikrocentrifug.
  3. Ta försiktigt bort 600 μl av den övre fasen av varje prov i ett nytt 1,5 ml rör. Kassera ordentligt den nedre fasen och 2 ml rör.
  4. Fäll ut DNA genom att tillsätta en 1/10 volym av 3 M natriumacetat pH 5,2 (~ 60 μL) till varje prov, följt av 1 volym isopropanol (~ 660 μL). Invertera proverna 5x-10x och inkubera vid RT i 30 min.
  5. Lägg proverna på is i 2 minuter och centrifugera sedan proverna vid 16 500 x g i 15 minuter vid 4 °C i en mikrocentrifug. Sätt tillbaka proverna till is, häll av supernatanten och töm röret på en pappershandduk.
  6. Tvätta DNA-pelleten med 200 μl 70% etanol. Centrifugera vid 16 500 x g i 3 minuter vid 4 °C, lägg tillbaka proverna på is, häll av supernatanten och avlägsna restalkoholen med en pipett. Torka proverna med rörlocken öppna vid 37 °C i 15–20 minuter.
  7. Återsuspendera DNA-pelletsen i 50 μL 1x TE genom virvelbildning. Inkubera vid RT i 30 min, virvel, och inkubera sedan vid 37 °C i ett torrt bad i 30 min. Vortex proverna igen och lägg dem sedan på is. Prover kan lagras i detta skede vid −20 °C i flera månader, men det är lämpligt att fortsätta omedelbart för avlänkningsstegen (endast DLC) och qPCR.

5. Psoralen crosslink reversal (endast för DLC-analys)

  1. Pipett 9 μL renat DNA i ett PCR-rör på is. Tillsätt 1 μl 1 M KOH (0,1 M slutlig koncentration). Inkubera proverna vid 90 °C i 30 minuter i en termocykel.
  2. Tillsätt 19,73 μl natriumacetatlösning (0,1 M natriumacetat, 9,6 mM Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Prover kan förvaras i detta skede vid −20 °C i flera månader, men det är lämpligt att omedelbart gå vidare till qPCR-steget.

6. Kvantitativ PCR, kontroller och analys

  1. Använd 2 μL renat DNA, med eller utan tvärbindning, ställ in en 20 μL qPCR-reaktion enligt tillverkarens instruktioner. Ställ in varje reaktion i dubblett. För både DLC- och DLE-analyserna finns det fem kontrollreaktioner och en DLC/DLE-kvantifieringsreaktion, eller totalt sex reaktioner per prov, som körs i två exemplar. Tilläggstabell S1 och tilläggstabell S2 utgör en mall för att ställa in dessa reaktioner och analyser, och sekvenserna för qPCR-primrarna listas i tabell 3.
  2. qPCR-cykelförhållanden måste optimeras för varje qPCR-kit.
    1. Använd följande DLC qPCR-förhållanden, beroende på vilka qPCR-kit som används: initial denaturering (95 °C i 3 minuter); 50 amplifieringsomgångar (95 °C för 15 s, 61 °C för 25 s, 72 °C för 15 s med ett enda förvärv); Analys av smältkurvan (95 °C för 5 s, 65 °C i 1 min, 97 °C med kontinuerlig anskaffning). och kylning (37 °C i 30 s).
    2. Använd följande qPCR-villkor för DLE-analysen: initial denaturering (95 °C i 5 minuter); 50 amplifieringsrundor (95 °C för 15 s, 60 °C för 30 s, 72 °C för 15 s med ett enda förvärv); Analys av smältkurvan (95 °C för 5 s, 65 °C i 1 min, 97 °C med kontinuerlig anskaffning). och kylning (37 °C i 30 s). Observera att optimering för olika qPCR-maskiner/kit kan krävas.
  3. DLC-analys
    1. Kontroller: Se listan över qPCR-primers i tabell 3. En karta över primerbindningsställena visas i figur S1. För kompletterande sekvensfiler för relevanta genomiska egenskaper och amplikoner, kontrollera A-plasmidredigeraren (ApE) -filerna; Kompletterande sekvensfiler 1-5.
      1. Genomiskt DNA vid ARG4: Använd olWDH1760/olWDH1761 för att förstärka dsDNA som finns vid ARG4. Använd denna reaktion som en belastningskontroll och normalisera alla andra reaktioner utom DLC-signalreaktionen på denna kontroll.
      2. Intramolekylär ligeringseffektivitet vid DAP2: Använd 1 904 bp-fragmentet som skapats av EcoRI-rötning för intramolekylär ligering parallellt med DLC-ligeringen. Förstärkning över denna ligeringskorsning rapporterar om den intramolekylära ligeringseffektiviteten och fungerar som en kontroll till vilken DLC-signalen normaliseras.
      3. DSB-induktion: Använd olWDH1766/olWDH1767 för att förstärka en region som sträcker sig över den inducerade DSB.
      4. Psoralen tvärbindning och resektion: Använd olWDH2019/olWDH2020 för att förstärka den unika PhiX-regionen nedströms EcoRI-igenkänningsplatsen. Utan tvärbindningsåterföring, använd förhållandet mellan ssDNA (ingen tvärbindning) över ARG4 (tvärbunden dsDNA) för att bestämma tvärbindningseffektiviteten. Med tvärbindningsomvandling kommer resektion att leda till en progressiv minskning från 1 till 0,5 av signalen i förhållande till ARG4.
      5. EcoR I igenkänning av restaurering och skärning av platsen: Använd olWDH1768 / olWDH1764 för att förstärka en region som sträcker sig över den återställda EcoRI-igenkänningsplatsen uppströms DSB på den resekterade strängen. olWDH1769/olWDH1763 förstärker en region som sträcker sig över EcoRI-restriktionsenzymstället vid DAP2. Utför EcoRI-klyvning på denna webbplats för att användas som intramolekylär ligeringskontroll.
    2. DLC-signal: Använd olWDH1764/olWDH1765 för att förstärka den chimära DNA-molekylen som skapas genom intramolekylär ligering av den resekterade (invaderande) strängen och givaren.
    3. Analys: Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för Cp-värdena för var och en av de dubbla reaktionerna. Använd ARG4 genomiska DNA qPCR Cp-värden som referens för att normalisera alla andra kontroll-qPCR. Normalisera DLC-signalen till den intramolekylära ligeringskontrollen vid DAP2. Se figur 3 för typiska DLC-signalvärden vid 2 timmar.
  4. DLE-analys
    1. Kontroller: Se listan över qPCR-primers i tabell 3. En karta över primerbindningsställena visas i figur S1. För kompletterande sekvensfiler för relevanta genomiska egenskaper och amplikoner, kontrollera A-plasmidredigerarens (ApE) filer (Supplementary Sequence Files 1-5).
      1. Genomiskt DNA vid ARG4: Se avsnitt 6.3.1.1.
      2. Intramolekylär ligeringseffektivitet vid YLR050C: Använd HindIII-matsmältningen för att skapa ett 765 bp-fragment som kommer att genomgå intramolekylär ligering parallellt med DLE-ligeringen. Förstärkning över denna ligeringskorsning rapporterar om den intramolekylära ligeringseffektiviteten och fungerar som en kontroll till vilken DLE-signalen normaliseras.
      3. DSB-induktion: Se avsnitt 6.3.1.3.
      4. Hind III igenkänningsplats restaurering och skärning: Använd olWDH2010 / olWDH2012 och olWDH2009 / 2011 för att förstärka en region som sträcker sig över HindIII-restriktionsenzymplatserna på den trasiga strängen där den har resekterats respektive förlängts.
    2. DLE-signal: Använd olWDH2009/olWDH2010 för att förstärka den chimära DNA-molekylen som skapas genom intramolekylär ligering av den resekterade änden av den invaderande strängen uppströms DSB till den nyligen förlängda änden nedströms DSB.
    3. Analys: Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för Cp-värdena för var och en av de dubbla reaktionerna. Använd ARG4 genomiska DNA qPCR Cp-värden som referens för att normalisera alla andra kontroll-qPCR. Normalisera DLE-signalen till den intramolekylära ligeringskontrollen vid YLR050C. Typiska DLE-signalvärden vid 6 timmar redovisas i figur 4 och tidigare publikationer9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DLC-analys
DLC-analysen upptäcker både begynnande och utökade D-slingor som bildas av invasionen av en platsspecifik DSB till en enda givare (figur 2). Psoralen tvärbindning länkar fysiskt den trasiga strängen och givaren via heteroduplex-DNA i D-slingan. Restaurering av restriktionsenzymstället med en lång, hybridiserande oligo på den resekterade strängen i pausen möjliggör klyvning av restriktionsenzym, följt av ligering av den trasiga strängen till den proximala givaren för att bilda en chimär produkt som kvantifieras av qPCR. I synnerhet beror DLC-signalen på psoralen-tvärbindningen, den hybridiserande oligo, den centrala rekombinasen, Rad51 och Rad51-tillbehörsfaktorerna Rad52 och Rad548. Radering av DNA-helikaserna/topoisomeraserna Sgs1-Top3-Rmi1, Mph1 och Srs2 leder till en ökad DLC-signal.

Figur 3 visar de representativa resultaten för standardstammen av vild typ vid 2 timmar efter DSB-induktion i tre exemplar med och utan hybridiserande oligo. Ett prov som saknar ett nyckelsteg, psoralen tvärbindning, visas också i två exemplar.

Som visas i figur 3 är psoralen-tvärbindning ett kritiskt steg. Det finns praktiskt taget ingen detekterbar signal utan den8. Tvärbindningseffektivitet mäts baserat på förhållandet mellan ssDNA och dsDNA-förstärkning. Till skillnad från dsDNA upplever ssDNA minimal psoralen-tvärbindning, och därmed indikerar en hög signal framgångsrik tvärbindning. Tvärbindningseffektiviteten varierar beroende på tiden mellan provtagning och förberedelse för qPCR (figur 3, nedre vänstra panelen). Ju mer tid mellan provtagning och beredning, desto mindre signal kommer att observeras för tvärbindningseffektiviteten qPCR-kontroll. Betydande variation mellan samplingar i signalen som observerats för tvärbindningseffektiviteten qPCR-kontroll är en anledning till oro, och tidsförloppet bör kasseras.

ARG4 Cp-värdena är likartade mellan de med- och utan-hybridiserande oligoproverna (figur 3, övre vänstra panelen). Ett lågt Cp-värde indikerar att mer amplifierbart DNA är närvarande. Detta förklarar varför ARG4 Cp-värdena för de utan-tvärbindande proverna är betydligt lägre: tvärbindning stör qPCR-förstärkning. Denna skillnad mellan med- och utan-tvärbindningsproverna gäller för alla qPCR utom EcoRI-klyvningen qPCR-kontroll, som kommer att förstärka ssDNA / icke-tvärbunden dsDNA. Alla qPCR-kontroller, men inte DLC-signalen, normaliseras till ARG4 qPCR-signalen.

För alla prover ligger den intramolekylära ligerings-qPCR-kontrollen inom lämpligt intervall (figur 3, övre mittpanelen), och det finns robust DSB-induktion, vilket framgår av den låga signalen för qPCR-kontrollen som förstärks över HO-endonukleasigenkänningsstället (figur 3, övre högra panelen). I de med-hybridiserande oligoproverna observeras effektiv EcoRI-skärning, och denna qPCR-kontroll ger en låg signal (figur 3, nedre mittpanelen). Omvänt ger de utan-hybridiserande oligo med-tvärbindningsproverna en hög signal, liknande vad som visas för tvärbindningseffektiviteten qPCR-kontroll, eftersom i detta fall oklippt ssDNA förstärks och normaliseras till ARG4 qPCR-signalen (dsDNA).

Till skillnad från de andra qPCR: erna normaliseras qPCR-signalen för DLC-analysen till den intramolekylära ligeringen qPCR-kontroll, eftersom den chimära molekylen kvantifierad av DLC qPCR beror på ligering. Median DLC-signalen vid 2 timmar med hybridiserande oligo är 0,030 ± 0,0055 (figur 3, nedre högra panelen), i linje med tidigare publicerade resultat för denna analys8. Som förväntat beror denna signal på både hybridiserande oligo och psoralen tvärbindning.

DLE-analys
DLE-analysen möjliggör noggrann övervakning av D-loop-förlängning som svar på en platsspecifik DSB (figur 2). Det har tidigare visats att DLE-signalen beror på Rad51, det centrala rekombinaset i reaktionen, som förmedlar stränginvasion och därmed krävs för rekombinationsassocierad DNA-syntes9. Dessutom beror DLE-signalen på den katalytiska underenheten av Pol δ, Pol3 (DR, AP, WDH, opublicerade data) men inte den icke-väsentliga processivitetsfaktorn Pol32. I motsats till DLC-signalen, som först blir detekterbar vid 2 h efter DSB-induktion, ökar DLE-signalen först märkbart vid 4 h efter DSB-induktion, stiger dramatiskt mellan 4 h och 6 h och börjar platå därefter, med mycket av signalökningen mellan 6 h och 8 h hänförlig till BIR-produktbildning8, 9.

Eftersom den chimära ligeringsprodukten som kvantifieras i DLE-analysen är enkelsträngad är cellförstörings- och lyssteget kritiskt. Minskad DLE-signal kan bero på problem med detta steg, vilket kan frigöra nukleaser och leda till nedbrytning av mål-ssDNA.

Figur 4 visar representativa resultat för standardstammen av vild typ vid 6 timmar efter DSB-induktion i tre exemplar med och utan hybridiserande oligo. Det vilda typprovet utan hybridiserande oligos representerar dsDNA BIR-produkten ensam, medan med-oligo-signalen härrör från både ssDNA för den utökade D-loopen och dsDNA BIR-produkten. Ett tredje prov ingår som ett exempel på ett misslyckat experiment.

ARG4 Cp-värdena var likartade mellan de med- och utan-hybridiserande oligosproverna (figur 4, övre vänstra panelen). ARG4 Cp-värdena var märkbart lägre för det misslyckade provet, vilket indikerar att detta prov har mer genomiskt DNA än de framgångsrika proverna. qPCR-signalerna för qPCR-kontrollerna, men inte DLE-signalen, normaliserades till ARG4 qPCR-signalen. Den intramolekylära ligerings-qPCR-kontrollen avslöjade en acceptabel signal för de med- och utan-hybridiserande oligosproverna (mellan ~ 0,15-0,35) men en väsentligt lägre signal för det misslyckade provet (figur 4, övre mittpanelen). I detta misslyckade prov orsakade den höga mängden genomiskt DNA som indikerades av ARG4 qPCR-kontrollen sannolikt att den intramolekylära ligeringen misslyckades, eftersom en hög koncentration av genomiskt DNA kommer att leda till intermolekylär ligering.

I alla tre proverna fanns det robust DSB-induktion (figur 4, övre högra panelen). Hind III-klyvning på både de resekterade och förlängda strängarna beror på närvaron av de hybridiserande oligosna. På den förlängda strängen beror det dessutom på D-loop-förlängning. Således fanns det en signifikant skillnad i förstärkning över Hind III-klyvningsstället på den resekterade strängen mellan med- och utan-oligo-proverna (figur 4, nedre vänstra panelen) och en mindre skillnad i förstärkning över HindIII-igenkänningsstället på den förlängda strängen mellan dessa prover (figur 4, nedre mittpanelen).

Eftersom DLE-signalen beror på intramolekylär ligering normaliseras den till den intramolekylära ligeringen qPCR-kontroll. Mediansignalen för DLE vid 6 timmar med hybridiserande oligos var 0,53 ± 0,17 (figur 4, nedre högra panelen), vilket överensstämmer med tidigare publicerade resultat för denna analys9. DLE-signalen för det vilda typprovet utan hybridiserande oligos var på samma sätt kompatibel med denna tidigare publikation. DLE-signalen var lägre än förväntat för det misslyckade provet, vilket sannolikt återspeglar problemen med det provet som nämns ovan.

Omvänd länkning
Psoralen interkalerad mellan ApT / TpA-baspar i dsDNA kan bli kovalent kopplad genom sina furan- och pyronringar till en eller båda motsatta tyminbaser vid UV-bestrålning, vilket resulterar i (övervägande furan) monoaddukter eller intersträngade di-addukter (dvs. tvärbindningar) respektive22. Dessa modifieringar förväntas blockera DNA-polymerasets progression och därmed hämma DNA-syntesreaktionsintegralen till kvantitativ PCR. Följaktligen kan de flesta dsDNA-mallar inte förstärkas (figur 5A,B). Däremot gör frånvaron av baspar i ssDNA det mindre benäget för psoralen-tvärbindning. Det förstärks således lättare än dsDNA, vilket snedvrider den relativa kvantifieringen av ssDNA kontra dsDNA och av dsDNA-amplikoner av olika längd och ApT / TpA-innehåll (figur 5A, B). För att övervinna dessa begränsningar tillämpades en bas- och värmekatalyserad reversering av psoralen-tvärbindningssteget23 före den kvantitativa PCR. Denna metod lämnar endast de mindre arterna av monoaddukter på pyronsidan23,24. Det ledde till en 80-faldig återhämtning av genomiska dsDNA- och intramolekylära ligeringskontrollamplikoner, vilket indikerar att den stora majoriteten av mallmolekyler hade minst en furan-sida monoaddukt eller inter-sträng tvärbindning (figur 5B, C). Jämförelsen av Cp-värdena för dsDNA-genomisk DNA-kontroll före och efter tvärbindningsomvandling ger en uppskattning av tvärbindningseffektiviteten, som bör ligga inom det intervall som visas här. Utöver korta amplikoner kan den här proceduren återställa mallar som är upp till 3 kb långa (bild S2). Ingen förändring observerades för ssDNA-amplicon, vilket överensstämmer med en brist på psoralen-tvärbindning till ssDNA (figur 5B-D). Det visar också att tvärbindningsförfarandet inte detekterbart skadar DNA23. Återvinningen av DLC-chimäramplicon, som innehåller ett tvärbundet dsDNA-segment ligerat till ett icke-tvärbundet ds-ssDNA-segment (50 bp och 118 bp/nt; Figur 5A) var mellanliggande jämfört med dsDNA- och ssDNA-amplikoner, med en 8-faldig förbättring av återhämtningen (figur 5B,C). Tvärbindningsomvandling påverkade inte de relativa nivåerna av de två dsDNA-amplikonerna, med den intramolekylära ligeringskontrollen kvar i intervallet 0,2-0,25 i förhållande till den genomiska DNA-kontrollen (figur 5E). Det ändrade emellertid den relativa mängden ssDNA-amplicon i förhållande till dsDNA-genomisk DNA-kontroll från ett 40-faldigt överskott till det 0,5-faldiga förväntade för ett ssDNA i förhållande till en dsDNA-mall (Figur 5D). På samma sätt minskade den delvis ssDNA DLC-signalen från 6,6 x 10−2 till 6,6 x 10−3 i förhållande till dsDNA intramolekylära ligeringskontroller (figur 5F). Detta får oss att uppskatta antalet D-loop-ledmolekyler vid en interkromosomal givare som detekteras med detta tillvägagångssätt 4 h efter DSB-induktion till i genomsnitt 1.3% av de totala trasiga molekylerna i cellpopulationen. Sådana absoluta uppskattningar kunde inte göras med psoralenbaserad distorsion av dsDNA och ssDNA-förstärkning, vilket belyser värdet av detta ytterligare tvärbindningssteg.

Figure 1
Figur 1: Subvägar för homolog rekombination och upplösning. Efter DNA-skador som resulterar i en en- eller tvåändad DSB (visas) eller ett ssDNA-gap, avslöjar 5 'till 3' resektion av DNA-ändarna 3' ssDNA-överhäng på vilka Rad51-filamentet bildas, med hjälp av dess tillbehörsfaktorer. Rad51 söker sedan i genomet efter ett intakt duplex-DNA (dvs. givaren) som reparationshändelsen kan malla på. Denna process kulminerar i DNA-stränginvasion, där den trasiga strängen Watson-Crick-basen parar sig med den komplementära strängen hos den dubbelsträngade DNA-givaren, förskjuter den motsatta strängen och bildar den framväxande D-slingan. Denna D-loop kan antingen vändas för att tillåta Rad51-homologisökning att välja en annan givare eller förlängas med ett DNA-polymeras för att ersätta baserna som förlorats under DNA-skadehändelsen. Tre HR-undervägar finns tillgängliga för att lösa denna utökade D-loop-mellanprodukt till en produkt. För det första kan den förlängda D-slingan störas av ett helicase, vilket gör att den nyligen förlängda änden av pausen kan glödgas till den andra änden i en process som kallas syntesberoende strängglödgning (SDSA). Fyll i DNA-syntes och ligering leder sedan till produktbildning. Alternativt kan den andra änden av pausen glödgas till den förskjutna givarsträngen och bilda en dubbel-Holliday-korsning (dHJ). Nukleolytisk upplösning av dHJ resulterar i antingen en crossover (CO) eller icke-crossover (NCO), medan dHJ-upplösning (visas inte) resulterar i endast NCO-produkter. Slutligen resulterar underlåtenhet att engagera den andra änden av DSB i break-induced replication (BIR), en mutagen process där tusentals baspar kopieras från givaren till den trasiga strängen. Denna process kan sträcka sig så långt som till den konvergerande replikationsgaffeln eller slutet av kromosomen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Förutsättningen för produktbildningsanalyserna D-loop capture (DLC), D-loop extension (DLE) och bir-produktbildning (Break-induced replication). DSB-bildning drivs av ett platsspecifikt endonukleas under kontroll av GAL1-promotorn . DSB-induktion leder till bildandet av en framväxande D-slinga. I DLC-analysen bevarar tvärsträngstvärbindningen av DNA denna struktur, som sedan extraheras. Restriktionsenzymets platsåterställning uppnås via hybridisering med en lång oligonukleotid, och sedan smälts DNA och ligeras för att bilda en produkt som kan kvantifieras med kvantitativ PCR (qPCR). DLE-analysen skiljer sig åt genom att DNA inte är tvärbundet, och istället bildas den intramolekylära ligeringsprodukten mellan de två ändarna av ssDNA på ena sidan av brottet, 3'-änden har förlängts av ett DNA-polymeras. qPCR används igen för att kvantifiera bildandet av den chimära ligeringsprodukten. Detektionen av D-loop-förlängning via DLE-analysen kräver också restaurering av restriktionsenzymer. Däremot detekteras den dubbelsträngade BIR-produkten med hjälp av DLE-analysprimrarna utan de hybridiserande oligonukleotiderna. R indikerar att ett restriktionsenzymställe är kompetent för enzymklyvning; (R) indikerar ett restriktionsenzymställe som inte kan skäras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa resultat från DLC-analysanalys av D-slingor vid 2 timmar efter DSB-induktion. Prover samlades in, bereddes och analyserades av qPCR enligt beskrivningen i detta protokoll. Blå symboler representerar resultat för den vanliga wild-typstammen med hybridiserande oligos för n = 3. Gröna symboler representerar resultat för den vilda stammen utan att hybridisera oligos för n = 3. Den tjocka röda linjen visar medianen. De lila symbolerna representerar prover utan psoralen tvärbindning men med hybridiserande oligos för n = 2. Symboler indikerar att proverna härrör från samma kultur. Interexperimentella skillnader i tvärbindningseffektivitet kan införa variabilitet i vissa qPCR-kontroller men är inte problematiska så länge det inte finns någon variation mellan proverna i dessa qPCR-kontroller inom ett experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa resultat från DLE-analysanalys 6 timmar efter DSB-induktion. Prover samlades in, bereddes och analyserades av qPCR enligt beskrivningen i detta protokoll. Blå symboler representerar resultat för den vanliga wild-typstammen med hybridiserande oligos för n = 3. Gröna symboler representerar resultat för den vilda stammen utan att hybridisera oligos för n = 3. Den tjocka röda linjen visar medianen. Observera att de med- och utan-hybridiserande oligoproverna härrör från samma kulturer. Den lila diamanten representerar ett misslyckat prov utan att hybridisera oligos för n = 1. Symboler indikerar att proverna härrör från samma kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Representativa resultat från psoralen-tvärbindningsomvandling. (A) Psoralen-DNA monoaddukter (*) och interstränga tvärbindningar (X) förekommer specifikt på dsDNA och förhindrar dess förstärkning med DNA-polymeraser, till skillnad från ssDNA-mallar. Denna skillnad introducerar en bias i kvantifieringen av dsDNA- och ssDNA-innehållande mallar med qPCR. Denna bias kan övervinnas vid vändning av psoralen-tvärbindningen. (B) Representativa Cp-värden för dsDNA (genomisk, ligering), ssDNA och blandade ds-ssDNA (DLC) amplikoner erhållna 4 h efter DSB-induktion. Data representerar individuella värden och medianen för fyra biologiska replikat. C) Förstärkningsåtervinning vid återföring av tvärbindning, beräknad utifrån Cp-värdena i (B). (D) ssDNA-amplifieringen i förhållande till den genomiska dsDNA-kontrollen med och utan psoralen-tvärbindningsåterföring. Vid vändning förstärks ssDNA-amplikonen vid de förväntade 0,5 av den genomiska dsDNA-kontrollen. (E) Den intramolekylära ligeringskontrollen dsDNA i förhållande till den genomiska dsDNA-kontrollen med och utan psoralen-tvärbindningsomvandling. (F) DLC-signalen i förhållande till dsDNA-ligeringskontrollen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Bild 6: Nuvarande DLC/DLE-analyssystem och de föreslagna ändringarna. Ovan: Aktuell DLC/DLE-analysbrytningsplats och givare visas. Nedan: Planerade ändringar av DLC/DLE-analysens brytplats och givare. (I) Skärplatsen för endonukleas på 117 bp anges med gult. För att förhindra förvirrande effekter vid övervakning av D-loop-störningar kommer den vänstra sidan av HOcs (74 bp) att införas i givaren, så att rekombination mellan de två skapar en perfekt matchad D-loop som saknar en 3'-flik. (II) För att göra systemet reparerbart och därmed mer fysiologiskt kommer DNA som är homologt för givaren (indikerat i kricka och lila) att införas i höger sida av HOcs. (III) Invasion och förlängning av strängen till höger om HOcs kommer att övervakas med hjälp av sekvenser som är unika för den sidan av pausen (anges med orange). (IV) Ytterligare jämnt fördelade restriktionsenzymställen och sekvenser som är unika för givaren gör det möjligt att övervaka D-loopförlängningen (via invasion från vänster sida av HOcs) på mer avlägsna platser. I detta modifierade system kan syntesberoende strängglödgning (SDSA) eller dubbel-Holliday-korsning (dHJ) bildning förekomma på de platser som visas i kricka eller lila. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur S1: Karta över qPCR-primers som används i DLC- och DLE-analyserna. Karta över de genomiska loci som används för analys i DLC- och DLE-analyserna, deras relevanta egenskaper och de ungefärliga primerbindningsställena (se tabell 3 för en lista över qPCR-primers). Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: Kvalitativ bedömning av tvärbindningsåterföring på stora amplikoner. Genomiskt DNA framställdes från tvärbundna eller icke-tvärbundna prover, där det indikerades, enligt beskrivningen i protokollet, avsnitt 1-5. Icke-kvantitativ PCR användes för att förstärka segmentet 3 kbp som spänner över homologiområdet som delas mellan brytplatsen och givaren. Observera att på grund av skillnaderna i förstärkningseffektivitet mellan tvärbundet och icke-tvärbundet DNA och den begränsade mängden prov var det inte möjligt att standardisera det ingående DNA: t. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tabell 1: S. cerevisiae-stam som används för analys av DLC- och DLE-analys. Genotyp av den haploida spirande jäststammen som används i denna studie. Stammen är tillgänglig på begäran. Ytterligare stammar tillgängliga för DLC/DLE-analysanalys finns på Piazza et al.8 och Piazza et al.9. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 2: Hybridiserande oligonukleotider som används för analys av DLC- och DLE-analys. Sekvenserna av de långa, hybridiserande oligonukleotiderna som används i DLC- och DLE-analyserna. Ytterligare SDS-PAGE-rening av de hybridiserande oligonukleotiderna av den anpassade oligonukleotidleverantören rekommenderas. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 3: qPCR-primers som används för analys av DLC- och DLE-analys. qPCR-primerparen för DLC- och DLE-analyserna och beskrivningarna av deras syften. Observera att olWDH1764, olWDH2009 och olWDH2010 används i två qPCR. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell S1: Mall för installation och analys av DLC-analys qPCR. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell S2: Mall för installation och analys av DLE-analys qPCR. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande sekvensfiler 1-5. Kompletterande sekvensfiler för relevanta genomiska egenskaper och amplikoner. Sekvensfilerna är i ApE-filformatet; ApE är en fritt tillgänglig programvara för visning och redigering av DNA-sekvenser. ApE-filer är också kompatibla med alla större sekvensredigeringsprogram. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De presenterade analyserna möjliggör detektion av begynnande och utökade D-slingor (DLC-analys), D-loopförlängning (DLE-analys) och BIR-produktbildning (DLE-analys utan hybridiserande oligonukleotider) med hjälp av närhetsligering och qPCR. ChIP-qPCR av Rad51 till platser långt från DSB har tidigare använts som proxy för Rad51-medierad homologisökning och D-loop-bildning. Denna ChIP-qPCR-signal är emellertid oberoende av sekvenshomologin mellan brytplatsen och en potentiell givare, liksom den Rad51-associerade faktorn Rad54, och är således mer benägna att representera en övergående koppling mellan Rad51-ssDNA-filamentet och dsDNA snarare än en D-loop mellanliggande10,11. Däremot beror DLC-signalen på DSB-bildning, Rad51, Rad52, Rad54 och delad sekvenshomologi mellan DSB och givarplatsen analyserad8. Dessutom observeras ökade DLC-signaler i frånvaro av Mph1- och Srs2-helikaserna och Sgs1-Top3-Rmi1 helicase-topoisomeraskomplexet, i överensstämmelse med tidigare rapporter om att dessa tre faktorer kan demontera Rad51 / Rad54-tillverkade framväxande D-slingor in vitro 8,25,26,27. DLE-analysen representerar på samma sätt en förbättring jämfört med tidigare metoder för att följa rekombinationsassocierad DNA-syntes, eftersom den kan skilja mellan D-loop-förlängning och BIR-produktbildning19.

Som diskuterats ovan är qPCR-kontrollerna, inklusive de för genomiskt DNA, DSB-induktion, psoralen-tvärbindning, intramolekylär ligering och oligonukleotidhybridisering, avgörande för framgången och reproducerbarheten av dessa analyser. Rågenomiska DNA qPCR-värden bör vara ungefär ekvivalenta över prover. Låga Cp-värden för ARG4-genomisk DNA-kontroll indikerar överskott av DNA, och antalet celler som samlas in bör justeras. Höga Cp-värden för denna kontroll indikerar otillräcklig DNA-återhämtning eller kontaminering med reagens som stör qPCR. Efter spheroplasting kan celllys observeras med hjälp av ett standardljusmikroskop och lika stora volymer prov och sterilt vatten. Om otillräcklig lys observeras vid tillsats av vatten måste zymolosslösningen göras om eller inkubationen vid 30 °C förlängas. Provet kan också gå förlorat eller föroreningar införas under DNA-rening genom P/C/IA-extraktion. För effektiv återvinning av DNA bör man se till att pH i P/C/IA har justerats till ~8,0 och att bottenfasen inte störs när den övre fasen tas bort. Slutligen kan ineffektiv resuspension av DNA-pelleten i 1x TE resultera i låga Cp-värden. En längre inkubation vid 37 °C och virvel kommer att förbättra återsuspensionen av DNA-pelleten.

Förutom den genomiska DNA-genomiska DNA-kontrollen bör DSB-induktions- och restriktionsenzymklyvningskontrollreaktionerna också vara likartade över prover. HO-endonukleas eller restriktionsenzymskärning på platsen för DSB eller restriktionsenzymigenkänningsstället förhindrar förstärkning över hela denna region; Därför är typiska normaliserade qPCR-värden för dessa kontroller nära noll, och ett högt qPCR-värde indikerar otillräcklig klyvning. Om en hög signal på DSB-platsen observeras, bör galaktoslösningen göras om. För mutanter med en känd cellcykeldefekt bör DSB-induktion kvantifieras genom plätering av lika stora mängder odling som odlas enligt protokollet (se avsnitt 1) på YPDA- och YPA-medier kompletterat med galaktos. Kolonier som växer på media som innehåller galaktos representerar jäst där ändfogning skapade en ofarlig HOcs. Om det finns betydligt fler slutkopplingshändelser i en mutant av intresse i förhållande till den vilda typen, måste en korrigering tillämpas för att kompensera för denna skillnad i DSB-induktion, vilket kommer att påverka DLC/DLE-signalen.

Tre primerpar (olWDH1764/olWDH1768, olWDH2010/olWDH2012 och olWDH2009/olWDH2011) bedömer restriktionsenzymets återställande genom hybridiserande oligos och skärning av restriktionsenzymerna EcoRI-HF och HindIII-HF. Dessutom är de intramolekylära ligeringskontrollerna också beroende av adekvat restriktionsenzymförtunning. Således har ett prov med låg intramolekylär ligeringseffektivitet och en hög signal för ett av dessa tre primerpar otillräcklig restriktionsenzymskärning. Ytterligare restriktionsenzym bör tillhandahållas i efterföljande preparat, och restriktionsenzymets effekt bör bedömas på genomiskt DNA. Primerparet olWDH1769/olWDH1763 representerar en ytterligare kontroll för DLC-analysen, som mäter EcoRI-klyvning vid DAP2, där intramolekylär ligeringseffektivitet också mäts. Ett prov med en adekvat intramolekylär ligeringssignal men en hög signal för ett av dessa tre primerpar har otillräcklig restaurering av restriktionsenzymstället genom de hybridiserande oligosna. För att lösa detta problem bör dubbla prover samlas in och koncentrationen av de drabbade hybridiserande oligoerna varieras. Typiska qPCR-värden erhållna för dessa reaktioner med och utan hybridiserande oligos finns i figur 3 och figur 4 och på Piazza et al.8 och Piazza et al.9.

För både DLC- och DLE-analysen anses en intramolekylär ligeringseffektivitet på 0,15-0,35 som normaliserad till den genomiska DNA-kontrollen vara normal. Eftersom detekteringen av begynnande och utökade D-slingor och BIR-produkten är beroende av effektiv ligering måste prover med låga ligeringssignaler kasseras. 10x ligeringsbufferten som saknar ATP bör förvaras vid 4 °C i högst 6 månader. Att samla för många celler kan leda till intermolekylär ligering, vilket kommer att resultera i låg intramolekylär ligeringseffektivitet och DLC / DLE-signal.

Även om dessa kontroller för DLC- och DLE-analyserna rapporterar om nästan alla känsliga steg, är det fortfarande möjligt att få icke-fysiologiska värden för DLC- eller DLE-signalen när dessa kontroller ligger inom lämpligt intervall. En låg DLC- eller DLE-signal kan bero på fel i cellförstöringssteget, vilket är extremt känsligt. Man bör bara bearbeta ett fåtal prover parallellt och hålla dem vid 4 °C hela tiden. En hög/låg DLC/DLE-signal kan också bli resultatet av att samla in för många/få celler vid varje tidpunkt. Detta problem kan åtgärdas genom att samla in flera OD600s celler vid varje tidpunkt för varje prov.

Det finns flera tekniska och konceptuella begränsningar för DLC- och DLE-analyserna i sin nuvarande form. För det första är den psoralenmedierade tvärbindningstätheten mellan strängarna ~ 1 i 500 bp8. Därför kan en ökad DLC-signal antingen indikera att det finns fler D-loopar i befolkningen, att den genomsnittliga längden på D-slingorna i populationen har ökat (förutsatt att D-loopar kan vara mindre än 500 bp), eller båda. Dessutom minskar sannolikheten för att en D-loop kommer att fångas upp av DLC-analysen med minskande D-looplängd. Med tanke på att mycket korta D-slingor kan stå för en betydande del av den totala D-looppopulationen i vissa mutantbakgrunder, måste denna begränsning av analysen beaktas vid tolkning av resultat. För det andra kräver DLC-analysen DNA-tvärbindning, medan DLE-analysen inte gör det. Tidigare, för ett givet experiment, innebar detta att DLC- och DLE-prover måste samlas in och analyseras separat. Metoden som visas i figur 5 uppnår robust tvärbindningsvändning, vilket lindrar behovet av att samla in flera prover från samma kultur. Införandet av ett andra EcoRI-restriktionsenzymställe på den trasiga strängen, nedströms hindIII-igenkänningsstället, kommer att möjliggöra sekventiell DLC- och DLE-analys.

Utöver dessa tekniska begränsningar tillåter DLC- och DLE-analyssystemet för närvarande inte återvinning av livskraftiga HR-produkter eftersom den högra sidan av den inducerbara DSB saknar homologi till givaren. För att bättre förstå kinetiken och mekanismen för andra ändens engagemang och syntes kan systemet modifieras så att reparation med hjälp av en proximal eller distal homologiregion som delas mellan den andra änden av pausen och givaren är möjlig (figur 6). Framöver kan det visa sig insiktsfullt att kombinera DLC- och DLE-analyserna med andra tekniker, såsom ChIP-qPCR, kromosomkonformationsfångst med hög genomströmning (Hi-C) och in vivo D-loop-kartläggning, för att uppnå en omfattande analys av kinetiken och regleringen av stegen i HR-vägen, inklusive brytbildning, ändresektion, Rad51-filamentbildning, begynnande D-loopbildning, D-loop-förlängning, D-loop-vändning, andra ändens engagemang, andra ändsyntes och upplösning28.

Sammanfattningsvis tillåter DLC- och DLE-analyserna kvantifiering av begynnande och utökade D-slingor, D-loopförlängning och BIR-produktbildning med hjälp av principen om närhetsligering. Dessa analyser representerar stora framsteg inom området, eftersom de är de första som tillåter semikvantitativ mätning av D-loopbildning och förlängning oberoende av cellulär livskraft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Arbetet i Heyer-laboratoriet stöds av bidrag GM58015 och GM137751 till W.-D.H. Forskningen i Piazza-laboratoriet stöds av Europeiska forskningsrådet (ERC-StG 3D-loop, grand agreement 851006). D.R. stöds av T32CA108459 och A.P. Giannini Foundation. Vi tackar Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) för att ha delat sina DLC/DLE-analysresultat och för att han dessutom validerade ändringarna i analyserna som beskrivs i detta protokoll.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Pre-growth, DSB induction, and sample collection
Equipment
15 and 50 mL conical tubes
15 mL glass culture tubes
250 mL, 500 mL, or 1 L flasks
60 mm x 15 mm optically clear petri dishes with flat bottom Suggested: Corning, Catalog Number 430166; or Genesee Scientific, Catalog Number 32-150G
Benchtop centrifuge with 15 and 50 mL conical tube adapters
Benchtop orbital shaker or tube rotator/revolver
Rotator
UV crosslinker or light box with 365 nm UV bulbs set atop an orbital shaker Suggested: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) or Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, Catalog Number 611110831
Materials
60% w/w sodium DL-lactate syrup Sigma-Aldrich L1375 For media preparation
Agar Fisher BP1423500 For media preparation
Bacto peptone BD Difco 211840 For media preparation
Bacto yeast extract BD Difco 212750 For media preparation
D-(+)-glucose BD Difco 0155-17-4 For media preparation
Trioxsalen Sigma-Aldrich T6137 For psoralen cross-linking
2. Spheroplasting, lysis, and restriction enzyme site restoration
Supplies
1.5 mL microcentrifuge tubes
Dry bath
Liquid nitrogen or dry ice/ethanol
Refrigerated microcentrifuge or microcentrifuge
Materials
10X restriction enzyme (CutSmart) buffer (500 mM potassium acetate, 200 mM Tris-acetate, 100 mM magnesium acetate, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)
Zymolyase 100T US Biological Z1004 For spheroplasting
3. Restriction enzyme digest and intramolecular ligation
Supplies
Water bath
Materials
EcoRI-HF New England Biolabs R3101 Restriction enzyme digest for DLC assay
HindIII-HF New England Biolabs R3104 Restriction enzyme digest for DLE assay
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202 Intramolecular ligation
4. DNA purification
Supplies
1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes
Materials
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (P/C/IA) at 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 DNA purification
5. Psoralen cross-link reversal
Supplies
Thermocycler/PCR machine
6. qPCR
Supplies
Lightcycler 480 Roche 5015278001 qPCR machine used by the authors
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR machine used by the authors
Materials
LightCycler 480 96-Well Plate, white Roche 4729692001 96-well plates for qPCR
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix BioRad 1725271 qPCR kit used by the authors
SYBR Green I Master Mix Roche 4707516001 qPCR kit used by the authors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).
  2. Heyer, W. -D. Regulation of recombination and genomic maintenance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501 (2015).
  3. Mimitou, E. P., Symington, L. S. Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing. Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).
  4. Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair. Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).
  5. Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins. Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).
  6. Mazón, G., Symington, L. S. Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates. Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).
  7. Saini, N., et al. Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis. Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).
  8. Piazza, A., et al. Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair. Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).
  9. Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae. Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).
  10. Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).
  11. Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo. Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).
  12. Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).
  13. Wright, W. D., Heyer, W. -D. Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation. Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).
  14. Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation. Nature Communications. 10 (1), 4058 (2019).
  15. Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination. Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).
  16. Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32. Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).
  17. Jain, S., et al. A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair. Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).
  18. Donnianni, R. A., Symington, L. S. Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).
  19. Liu, L., et al. Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks. Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).
  20. Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER). Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).
  21. Pham, N., et al. Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks. The EMBO Journal. 40 (10), 104847 (2021).
  22. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  23. Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion. Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).
  24. Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link. Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).
  25. Prakash, R., et al. Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination. Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).
  26. Liu, J., et al. Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops. eLife. 6, 22195 (2017).
  27. Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism. Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).
  28. Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution. eLife. 9, 59111 (2020).

Tags

Genetik utgåva 187 D-loop genomstabilitet ledmolekyl Rad51 brytinducerad replikation
Detektion av homologa rekombinationsintermediärer <em>via</em> närhetsligering och kvantitativ PCR i <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A.,… More

Reitz, D., Savocco, J., Piazza, A., Heyer, W. D. Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (187), e64240, doi:10.3791/64240 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter