Summary
이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.
Abstract
백신의 주성분으로서 보조제는 항원과 관련된 강력하고 광범위하며 선천적이며 적응적인 면역 반응을 직접 유도하거나 향상시킬 수 있습니다. 오피오포곤 자포 니쿠스 식물에서 추출한 정제 성분인 오피오포고닌 D(OP-D)는 백신 보조제로 유용한 것으로 밝혀졌습니다. OP-D의 낮은 용해도 및 독성 문제는 저에너지 유화 방법을 사용하여 나노 에멀젼 오피오포고닌 D(NOD)를 제조함으로써 효과적으로 극복할 수 있습니다. 이 기사에서는 세포 활동 평가를 위한 일련의 시험관 내 프로토콜을 검사합니다. L929의 세포독성 효과는 세포 계수 키트-8 분석을 사용하여 결정하였다. 이어서, 면역화된 마우스로부터 비장세포를 자극하고 배양한 후에 분비된 사이토카인 수치 및 상응하는 면역세포수를 ELISA 및 ELISpot 방법으로 검출하였다. 또한, C57BL/6 마우스로부터 분리되고 GM-CSF와 IL-4로 배양한 후 성숙된 골수 유래 수지상 세포(BMDC)의 항원 흡수능을 레이저 스캐닝 공초점 현미경(CLSM)으로 관찰하였다. 중요하게는, 대식세포 활성화는 24시간 동안 보조제와 함께 빈 마우스로부터의 복막 대식세포 (PMs)를 공동 배양한 후 ELISA 키트에 의해 IL-1β, IL-6, 및 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 사이토카인의 수준을 측정함으로써 확인되었다. 이 프로토콜이 다른 연구자들에게 새로운 백신 보조제의 세포 반응 효율성을 평가하기 위한 직접적이고 효과적인 실험적 접근 방식을 제공할 것으로 기대됩니다.
Introduction
백신은 전염성 및 비 전염성 질병을 예방하고 치료하는 중요한 수단입니다. 백신 제형에 보조제 및 전달 비히클의 적절한 첨가는 항원의 면역원성을 향상시키고 오래 지속되는면역 반응을 생성하는 데 유익합니다1. 고전적인 보조제 명반 (알루미늄 염) 외에도 현재 판매되는 백신 용 보조제에는 MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 및 Matrix-M5의 6 가지 보조제가 있습니다. 일반적으로 인체가 바이러스 공격을 받으면 1, 2차 방어선(피부, 점막, 대식세포)이 주도적으로 바이러스를 제거하고, 마지막으로 면역기관과 면역세포를 포함하는 3차 방어선이 활성화된다. 알루미늄 및 알루미늄 염은 1920년대 초부터 인간 백신에 가장 널리 사용되는 보조제였으며 효과적인 선천성면역 반응을 유도했습니다6. 그러나, 면역 세포가 특정 세트의 사이토카인 및 케모카인을 생성하도록 자극하는 고전적인 보조제에 의한 항원 제시 세포(APC)의 활성화는 보조제가 작동하는 메커니즘이며 보조제가 특정면역 반응에 일시적인 효과만 발휘하는 이유 중 하나일 수 있다고 제안되었습니다7. 인간 사용을 위한 제한된 허가된 보조제의 존재는 효과적인면역 반응을 유도하는 백신 개발을 위한 제한 요소입니다8.
현재, 점점 더 많은 보조 연구가 마우스에서 강력한 세포 면역 반응을 유도하는 능력을 입증하고 있습니다. QS-21은 균형 잡힌 T- 헬퍼 1 (Th1) 및 T- 헬퍼 2 (Th2) 면역 반응을 유도하고, 더 높은 수준의 항체 역가를 생성하고, 보조제로서의 보호를 연장시키는 것으로 나타 났지만, 강한 독성 및 용혈 특성으로 인해 독립형 임상 보조제 9,10. OP-D (루스코게닌-O-α-L-람노피라노시1-(1→2)-β-D-자일로피라노실-(1→3)-β-D-푸카피라노사이드)는 중국 약용 식물 오피오포곤 자포니카스4의 뿌리에서 분리된 스테로이드성 사포닌 중 하나입니다. 또한, 그것은 Radix Ophiopogonis에서 발견되는 주요 약리학 적 활성 성분 (Shen Mai San)이며 특정 약리학 적 특성을 갖는 것으로 알려져 있습니다11. 또한, 그것은 백합과에 속하며 세포 염증 및 심근 손상에 대한 억제 및 보호 효과로 널리 활용됩니다. 예를 들어, OP-D는 BALB/c 마우스12에서 DNCB 유발 아토피 피부염 유사 병변 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 염증성 HaCaT 세포를 개선합니다. 중요하게도, OP-D는 심혈 관계의 항산화 보호를 촉진하고 활성 산소 종 생성을 줄이고 미토콘드리아 막 손상을 방해하여 독소루비신 유발자가 포식 손상으로부터 심장을 보호합니다. 실험에 따르면 모노 데스모사이드와 함께 OP-D를 복용하면 면역 건강을 강화하고 백혈구 수와 DNA 합성을 증가시키며 항체를 더 오래 지속하는 데 도움이 됩니다13. OP-D는 보조 효과14를 갖는 것으로 이전에 밝혀졌다.
나노 에멀젼은 계면 활성제, 오일, 보조 계면 활성제 및 물12,15의 조합으로 구성된 수 중유 나노 제형입니다. 이러한 나노백신 설계는 항원과 보조제를 함께 캡슐화하여 면역 자극을 강화하고 항원을 보호하며 수지상 세포(DC) 성숙을 촉진합니다16. 스크리닝으로부터 수득된 이들 신규한 보조제의 개발을 위해서는, 이들의 세포 반응 능력을 평가하기 위한 적절한 방법을 찾는 것이 중요하다.
이 프로토콜의 목적은 보조제가 시험관 내 세포 배양에서 식균 작용 및 면역 세포의 발현을 향상시킬 수 있는지 체계적으로 평가하고 주요 실험 방법을 자세히 설명하는 것입니다. 실험은 4 개의 하위 섹션으로 나뉩니다 : (1) L929 세포에 대한 OP-D 및 NOD의 독성은 세포 계수 키트 -8 (CCK-8) 분석에 의해 결정됩니다. (2) 면역화 된 마우스에서 내분비 IFN-γ 및 IL-17A의 사이토 카인 수준과 상응하는 세포 수는 비장 세포 자극 및 ELISpot 분석에 의해 검출되고; (3) 보조 자극 후 DCs의 항원 제시 능력은 공초점 현미경을 사용하여 관찰되고; 및 (4) 보조제와 함께 공동 배양된 정상 마우스의 복막 대식세포(PMs)로부터 수득된 상청액에서 3가지 사이토카인, IL-1β, IL-6, 및 TNF-α가 검출된다.
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Protocol
모든 세포 실험은 기본 수술실, 완충실, 멸균 배양실, 식별 및 분석실을 갖춘 세포 공학 실험실에서 수행되었습니다. 작업 환경과 조건에는 미생물 오염 및 기타 유해 요인이 없었습니다. 동물실험은 실험동물의 관리 및 사용에 관한 가이드라인에 의거하여 수행되었으며, 제3군의과대학 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았다.
1. 오토클레이브 및 재료 준비
- 인산완충식염수(PBS), 가위, 집게, 연마망 등의 시약 및 소모품을 121°C에서 20분간 오토클레이빙하여 습열 멸균하여 준비합니다.
- 필요한 시약 및 장비는 재료 표를 참조하십시오. 블랭크 나노에멀젼(BNE)의 화학식에 대해서는 표 1을 확인하였다.
2. L929 세포독성 분석
- 수조를 켜고 온도를 37 °C로 조절하십시오. 액체 질소로부터 동결된 L929 세포 튜브 하나를 수집하고 37°C 수조에서 빠르게 해동합니다.
- 해동 후 세포를 15mL 멸균 원심분리 튜브에 빠르게 피펫팅하고 DMEM 2mL를 추가하고 잘 혼합합니다.
- 샘플을 129 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다. 그런 다음 2mL의 DMEM을 추가하여 세포를 재현탁하고 샘플을 다시 129 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 버리고, 재현탁을 위해 6mL의 DMEM 완전 배지(10% FBS 함유)를 추가하고, 5%CO2 가 있는 37°C 배양기의 T25 배양 플라스크로 옮겨 48시간 동안 배양한다.
- 배양 플라스크에 배양액을 버리고 2 mL의 PBS로 세포를 2회 세척한다. 그런 다음 0.25% 트립신 1mL를 추가하여 37°C에서 1-2분 동안 세포를 소화합니다.
- 세포의 반올림이 관찰되면 DMEM 완전 배지 4mL를 추가하여 즉시 소화를 종료하고 잘 혼합합니다. 그런 다음 세포를 15mL 멸균 원심분리 튜브에 넣고 129 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 세포를 1 mL의 DMEM 완전 배지에 재현탁시킨다. 세포 계수 플레이트를 사용하여 세포 계수에 20μL 세포 현탁액을 사용하고 DMEM 완전 배지를 사용하여 나머지 세포를 1 x 105 cells/mL로 희석합니다.
- 96웰 플레이트 주변에 100μL의 초순수를 추가하고 내부 웰에만 100μL의 세포 희석액을 추가합니다. 부착 배양을 위해 플레이트를 배양기에 넣고 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
- 세포가 부착된 후 OP-D와 NOD를 DMEM 완전 배지에 별도로 추가하여 최종 부피 200μL/웰(각 약물의 최종 농도는 480μg/mL, 240μg/mL, 120μg/mL, 60μg/mL 및 30μg/mL). 각 농도에 대해 세 개의 웰을 반복실험으로 사용합니다. 그런 다음 세포를 인큐베이터에 다시 넣고 24시간 더 배양합니다.
- DMEM 완전 배지로 CCK-8을 10%로 희석하고 보조제 및 세포 용액이 포함된 100μL/웰 희석액을 96웰 플레이트에 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 2-3 시간 더 배양하십시오.
- 세포 침전으로 인한 비균질성을 방지하기 위해 세포 용액을 도금하는 동안 자주 혼합하십시오. CCK-8을 첨가하기 전후에 플레이트를 여러 번 부드럽게 흔들어 배지와 CCK-8 용액을 잘 혼합합니다.
- 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 기준 흡광도 값에 대해 매체와 CCK-8만으로 영점 조정 웰을 설정합니다. 플로팅할 때 얻은 흡광도 값에서 0으로 지정된 흡광도 값을 빼서 정확한 흡광도 값을 계산합니다.
- 기포가 분석을 방해하기 때문에 마이크로플레이트 리더로 테스트하기 전에 웰에 기포가 없는지 확인하십시오.
3. 비장 세포 자극
- 다음 실험군에 따라 0일, 7일, 14일에 근육 주사(200μL)를 통해 6-8주령의 BALB/c 마우스에 단백질 항원 30μg과 보조제 30μg을 면역화했습니다: (1) PBS 그룹, (2) 항원(Ag)군, (3) 항원 + OP-D(Ag/OP-D)군, (4) 항원 + BNE(Ag/BNE) 군, (5) 항원 + NOD (Ag / NOD) 그룹 및 (6) 항원 + AlPO4 (Ag / Al) 그룹.
- 준비실: 1차 예방 접종 후 24일째에 동물실에서 마우스를 제거하고 1% 펜토바르비탈 나트륨 100mg/kg을 복강주사하여 안락사시킵니다. 쥐를 유리 접시에 넣고 75 분 동안 5 % 알코올에 담그십시오.
- 원심분리 튜브를 원심분리 튜브 랙에 놓고 일회용 페트리 접시에 번호를 매기고 10mL 피펫으로 각 페트리 접시에 5mL의 PBS를 추가합니다.
- 마우스의 왼쪽 복부 중앙에서 가위로 6-8cm 절개를하고 피부를 찢고 복벽을 노출시키고 비장의 긴 빨간색 스트립을 찾습니다.
- 집게로 비장의 아래쪽에 있는 복막을 들어 올리고 잘라 열고 위쪽으로 돌려 비장을 노출시킵니다. 집게로 비장을 들어 올리고 안과 가위로 비장 아래의 결합 조직을 분리하고 비장을 제거하십시오.
- 비장을 5mL의 PBS가 들어있는 페트리 접시에 넣고 체 (200 메쉬, 70 μm)와 분쇄 막대로 분쇄합니다. 분쇄 후, 번호에 따라 팔꿈치 점 적기가있는 15mL 원심 분리 튜브에 액체를 옮깁니다.
- 액체를 453 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 각 튜브에 적혈구 용해 완충액 3mL를 추가하고 세포를 재현탁하고 실온에서 10분 동안 용해합니다.
- 각 튜브에 10-12mL의 PBS를 넣고 튜브를 거꾸로 섞은 다음 453 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 각 원심분리 튜브에 PBS 10mL를 추가하고 세포를 재현탁합니다.
- 세포 계수 플레이트의 웰에서 각 샘플 20μL를 취하고 자동 세포 카운터를 사용하여 살아있는 세포 수를 기록합니다.
- 샘플을 453 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다. 세포를 재현탁시키고 RF-10 배지(표 2의 제형 정보)로 2.5 x 106 cells/mL로 희석한 다음 100μL/웰의 96웰 플레이트에 추가합니다.
- RF-10 배지로 항원을 10μg/mL로 희석하고 각 웰에 100μL를 첨가한 다음 5%CO2에서 37°C에서 3일 동안 배양합니다.
- 각 세포 그룹으로부터 얻은 세포 현탁액을 1.5mL 원심분리 튜브에서 흡인하고, 453 x g 에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 깨끗한 원심분리 튜브로 흡인한다.
- ELISA 키트 지침에 따라 IFN-γ 및 IL-17A 함량 검출을 엄격하게 수행하십시오. 방법 및 절차는 다음과 같습니다.
- 1x 세척 완충액 작업 용액(키트와 함께 제공됨), 표준 구배 농도 용액(키트와 함께 제공된 희석 완충액 R[1x]에 500pg/mL, 250pg/mL, 125pg/mL, 62.5pg/mL, 31.3pg/mL 및 15.6pg/mL로 희석한 사이토카인 표준 용액을 준비함), 비오틴화 항체 작업 용액(작업 용액을 형성하기 위해 키트와 함께 제공된 희석 완충액 R[1x]를 사용하여 1:100으로 비오틴화 항체 용액을 희석함), 필요에 따라 스트렙타비딘-HRP 작업 솔루션.
- 희석된 사이토카인 표준용액 100μL/웰을 표준 웰에, 샘플 웰에 샘플 웰에 샘플 100μL/웰(키트와 함께 제공된 희석 버퍼 R[1x]가 샘플 희석에 사용됨), 희석 버퍼 R(1x)의 웰 100μL/웰을 블랭크 대조군 웰에 추가합니다.
- 비오티닐화 항체 작업 용액을 50μL/웰로 추가합니다. 잘 섞고 밀봉 막으로 덮고 37 ° C에서 90 분 동안 배양합니다.
- 웰에서 액체를 제거하고 300μL/웰에서 1x 세척 완충액 작업 용액을 추가합니다. 1 분 후에 우물에서 액체를 버립니다. 이 과정을 4회 반복하여 매번 여과지에서 액체를 건조시킵니다.
- 100 μL/웰의 스트렙타비딘-HRP 작업 용액을 추가합니다. 샘플을 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 샘플을 453 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다.
알림: 세척 과정에서 반응 웰에 남아있는 세척액은 여과지에 워터마크가 보이지 않을 때까지 완전히 두드려야 합니다. - TMB를 100μL/웰에 첨가하고 플레이트를 37°C에서 어둠 속에서 5-30분 동안 배양하고 웰의 색상 깊이(진한 파란색)에 따라 종결 반응을 판단합니다. 일반적으로 발색을위한 10-20 분은 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.
- 100 μL/웰의 정지 용액을 추가하여 반응을 신속하게 종료합니다. 종료 후 10분 이내에 450nm에서 흡광도 값을 검출합니다.
알림: 사용하기 전에 시약을 실온에서 30분 동안 평형을 유지하십시오.
4. 엘리스팟 분석
- 위의 3.1-3.10 단계에서 설명한 대로 마우스와 비장 세포 수집의 면역화를 정확하게 수행합니다. 키트 지침에 따라 IFN-γ 및 IL-17A에 대한 분석을 수행합니다. 방법 및 절차는 다음과 같습니다.
- 밀봉된 패키지에서 플레이트를 꺼내고 멸균 PBS(200μL/웰)로 4x 세척한 다음 1640개의 완전 배양 배지(200μL/웰)를 추가하여 실온에서 2시간 동안 균형을 맞춥니다.
- 배지를 제거하고 RF-10 배지로 비장 세포 현탁액을 2 x 105 cells/mL로 희석하여 웰당 50μL의 세포와 항원을 추가합니다(최종 농도: 10μg/mL).
- 플레이트를 37 ° C의 가습 인큐베이터에 넣고 5 % CO2 로 48 시간 동안 두십시오. 이 시간 동안 플레이트를 움직이지 말고 증발을 방지하기 위한 조치를 취하십시오(예: 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸십시오).
- 검출 항체(BVD6-24G2-비오틴)를 0.5% 태아 소 혈청(PBS-0.5% FBS)을 함유한 인산염 완충 식염수(0.5mL:100mL)에 1μg/mL(1:1,000)로 희석합니다. 플레이트에 100μL/웰을 추가하고 0.22μm 멤브레인을 통해 여과한 후 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
- 웰에서 액체를 따라 내고 200 μL / 웰에서 1x 세척 버퍼를 추가하고 5x 세척합니다. 매번 30-60 초 동안 그대로두고 마지막으로 블로 팅 페이퍼에서 말리십시오.
- 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다아제(1:1,000)를 PBS-0.5% FBS로 희석하고 100μL/웰을 추가합니다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 4.6 단계에서와 같이 플레이트를 씻으십시오.
- 즉시 사용 가능한 TMB 기판 용액 100μL/웰을 추가하고 명확한 지점이 나타날 때까지 현상합니다. 탈 이온수로 광범위하게 세척하여 발색을 중지하십시오 (5x-6x 반복적으로 헹구십시오). 필요한 경우 암거 (판 아래의 부드러운 플라스틱)를 제거하고 멤브레인의 아래쪽을 헹굽니다.
- 플레이트가 건조된 후 ELISpot 리더 또는 해부 현미경의 반점을 검사하고 계수합니다.
5. DC에 의한 활용
- BALB/c 정상 마우스를 1% 펜토바르비탈 나트륨 100mg/kg을 복강주사하여 안락사시킨다. 마우스를 75 % 알코올에 5 분 동안 담그십시오.
- 가위로 마우스 복부 아래 6-8cm 절개를 자르고 개구부의 두 끝을 고정하여 다른 방향으로 분리하고 마우스 다리를 노출시킵니다. 마우스 대퇴골을 마우스 몸에서, 경골을 관절에서 분리하고 양쪽 끝에서 뼈를 그대로 유지하십시오.
- 가위와 집게로 대퇴골 양쪽 끝의 관절 관절에서 잔여 조직과 연골을 제거하십시오. 대퇴골을 75% 알코올에 5분 동안 담근 다음 멸균 PBS 용액에 담가 표면 알코올을 씻어냅니다.
- 가위로 대퇴골의 끝을 잘라 내고 멸균 PBS 용액으로 멸균 된 페트리 접시에서 골수를 헹구고 1mL 주사기로 흡인합니다. 세척을 3x-5x 반복하십시오.
- 세포 체(200 메쉬, 70 μm)로 여과하고 BMDC를 15mL 원심분리 튜브에 수집합니다. 샘플을 290 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 적혈구 용해 완충액 4mL를 추가하고 재현탁하고 실온에서 5분 동안 용해합니다.
- 용해물을 중화하기 위해 멸균 PBS 용액 10mL를 추가하고 290 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상청액을 버립니다.
- 세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액과 10% FBS를 함유하는 1mL의 DMEM에 재현탁시키고 계수한다. 그런 다음 GM-CSF(20ng/mL)와 IL-4(10ng/mL)를 배지에 넣고 세포 농도를 5 x 105/mL로 조정한 다음 커버 슬립에 세포를 접종합니다.
- 세포 현탁액을 2mL/웰의 6웰 플레이트에 추가하고 플레이트를 5%CO2 가 있는 37°C의 가습 인큐베이터에 48시간 동안 놓습니다. 2 일 후에 배지를 완전히 교체하고 4 일 후에 배지의 절반을 교체하십시오.
- 배양 7일째 되는 날 실험을 위해 100배 배율의 도립 현미경을 사용하여 양호한 상태의 세포(세포 표면에 수지상 돌출부가 있는 크고 방사선 투과성 세포)가 있는 5개의 웰을 선택합니다. 상청액을 버리고 DMEM 완전 배지(GFP 최종 농도: 20μg/mL, 보조제 최종 농도: 10μg/mL)로 희석한 GFP, OP-D + GFP 및 NOD + GFP 용액 2mL를 각 웰에 추가하고 플레이트를 37°C에서 30분 동안 암실에서 배양합니다.
- 플레이트를 PBS로 3x 세척하고 각 웰에 1mL의 4% 파라포름알데히드를 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 고정 후 파라포름알데히드를 제거하고 세포를 팔로이딘 및 DAPI와 함께 염색을 위해 10분 동안 10μg/mL의 최종 농도로 배양한 다음 PBS로 3x 세척합니다.
- 각 웰에 1mL의 PBS를 추가하고 아래 설명된 대로 CLSM을 사용하여 항원 흡수를 관찰합니다.
- CLSM 소프트웨어를 열고 ZEN 시스템을 클릭 한 다음 하드웨어 초기화가 완료 될 때까지 기다립니다.
- 찾기 탭에서 GFP 및 DAPI 바로 가기를 클릭하여 관찰할 수 있는 영역을 찾습니다. 형광등과 투과광을 끕니다.
- 획득 메뉴에서 스마트 설정을 클릭하여 염료 라이브러리를 열고 세 가지 형광 염료(EGFP, 팔로이딘 및 DAPI)를 추가합니다. 최상의 신호 > 확인을 클릭합니다. 채널 탭에서 EGFP 채널을 클릭하고 라이브 를 클릭하여 오른쪽 인터페이스에서 올바른 시야를 선택합니다.
- 핀홀에 대해 1AU 를 선택하고 미세 초점 나사를 돌려 초점 거리를 조정한 다음 적절한 초점면을 선택합니다. 범위 표시기를 클릭하고 레이저 출력과 마스터 게인의 조합을 조정하여 이미지에 산발적인 빨간색 점만 나타나도록 합니다.
- 레이저 출력을 변경하지 않고 동일한 매개 변수로 팔로이딘 및 DAPI 채널을 조정합니다.
- 라이브 중지를 선택하고 촬영 모드를 클릭하여 촬영 매개 변수를 변경합니다. 프레임 크기 : 1024 픽셀 x 1024 픽셀; 스캔 속도: 7; 평균: 2배. 스냅을 클릭하고 분할을 선택하여 촬영한 모든 이미지를 봅니다. 이미지를 저장합니다.
6. 대식세포 활성화
- 안락사 후 C57BL/6 마우스를 75% 알코올에 담그고 번호가 매겨진 순서대로 유리 페트리 접시에 앞면이 위로 향하게 놓습니다.
- 마우스를 이송 창을 통해 멸균 수술실로 통과시키고 5 분 동안 수술대에 놓습니다.
- 주사기를 사용하여 10mL의 식염수를 흡인하고 마우스를 약 45°에서 아래쪽으로 기울인 다음 복강 중앙에 주사합니다. 각 10mL에 대해 약 5mL의 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에 넣고 주입을 3회 반복합니다.
- 세포 현탁액을 129 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 마우스 복막 1차 대식세포를 얻었다. 세포를 재현탁시키고, RPMI 1640 완전 배지(10% FBS 함유)로 세포 농도를 2 x 106 cells/mL로 조정하고, 세포 현탁액을 24웰 플레이트에 접종하여 웰당 일관된 세포 수(1mL/웰)를 보장합니다.
- 37°C에서 5%CO2 에서 하룻밤(약 16-20시간) 배양한 후 PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD 및 Ag/Al(Ag 최종 농도: 5μg/mL, 보조제 최종 농도: 10μg/mL, 총 부피: 2mL)을 24시간 동안 배양했습니다. 단계 3.12-3.19에 기재된 방법 및 절차를 사용하여 ELISA 키트로 배양 상청액에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 수준을 검출한다.
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Representative Results
보조제 OP-D 및 NOD의 세포 활성 평가는 프로토콜 에 따라 시험관내에서 완료되었다. L929 섬유아세포는 NOD 의 시험관내 독성 시험을 위한 유용한 스크리닝 모델이다(도 1). 비장의 염증성 사이토카인 수치의 정량화는 연구자들이 면역 반응을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다(그림 2). ELISpot을 사용한 CTL 모니터링은 임상 시험에서 항원 특이적 T 세포 면역을 평가하고 백신 후보를 선별하기 위한 황금 표준입니다(그림 3). DC에 의한 항원 흡수 증가는 향상된 적응 면역 반응을 유도할 수 있습니다(그림 4). 대식세포는 T 세포에 항원을 제시하고 다른 항원 제시 세포가 공동자극 분자를 발현하도록 유도하여 적응성 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을 합니다(그림 5). 상기 실험 결과는 Tong et al.에 의해 발표되었으며, 생체내 항체 반응 및 마우스에 대한 보호 효율은 원본 기사14에서 확인할 수 있습니다.
그림 1: L929 세포의 시험관내 세포독성 시험. L929 세포와 함께 배양했을 때 OP-D 및 NOD (30 μg / mL, 60 μg / mL, 120 μg / mL, 240 μg / mL 및 480 μg / mL)의 다양한 구배 농도의 세포 독성 효과가 표시됩니다. CCK-8 키트가 탐지에 사용되었습니다. 통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 두 그룹 간의 차이는 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 분석되었습니다. 모든 값은 평균 ± SD(n = 3)로 표현되며, 유의한 차이는 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001로 표현됩니다. 이 수치는 Tong et al.14에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 비장세포의 IFN-γ 및 IL-17A 수준. 백신을 접종한 마우스로부터의 비장세포를 항원으로 3일 동안 자극하고, 상청액 중의 사이토카인 (A) IFN-γ 및 (B) IL-17A의 수준을 ELISA로 측정하였다. 결과는 IFN-γ 및 IL-17A 생산이 Ag / OP-D, Ag / BNE 및 Ag / Al 그룹에 비해 Ag / NOD 그룹에서 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다 (p < 0.01). 통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 여러 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 분석되었습니다. 모든 값은 평균 ± SD(n = 8)로 표현되며, 유의한 차이는 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001로 표현된다. 이 수치는 Tong et al.14에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 비장세포 집단에서 IFN-γ- 및 IL-17A-분비 세포의 수. (A) 비장 세포 중 IFN-γ 스팟 형성 항원 특이 적 T 세포의 ELISpot 분석. (b) 비장세포 중 IL-17A 스팟 형성 항원 특이적 T 세포의 ELISpot 분석. 사이토카인 결과와 유사하게, Ag/OP-D 및 Ag/NOD 그룹은 비장 림프구 T 세포 집단에서 IFN-γ- 및 IL-17A-형성 세포의 비율 및 수가 유의하게 증가한 것으로 나타났다. Ag / NOD 그룹은 다른 그룹보다 더 강한 Th1 (p < 0.001) 및 Th17 (p < 0.01) 면역 반응을 유도했습니다. 통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 여러 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 분석되었습니다. 모든 값은 평균± SD(n=8)로 표현되며, 유의한 차이는 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001로 표현된다. 이 수치는 Tong et al.14에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: BMDC에 의한 항원 흡수의 CLSM 이미지. 팔로이딘은 세포 골격을 빨간색으로 염색하고, DAPI는 핵을 파란색으로 염색하며, GFP는 녹색 형광을 나타냅니다. 그림에 나타낸 바와 같이, GFP+OP-D 및 GFP+ NOD 그룹과 BMDC의 공동 배양 30분 후에 CLSM에서 녹색 형광이 관찰되지만, GFP+ NOD 입자는 포식형 소포 구조로 둘러싸여 있는 반면, GFP+ OP-D 입자는 그렇지 않다. 이 수치는 Tong et al.14에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 보조제 제형 항원이 PM 활성화에 미치는 영향. PBS, Ag / OP-D, Ag / NOD 및 Ag / Al과 함께 배양 된 PM의 상청액에서 사이토 카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 농도를 검출하기위한 ELISA는 항원 자극과 비교하여 Ag / NOD, Ag / OP-D 및 Ag / Al 자극은 모두 PM에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 분비를 유의하게 증가 시켰습니다 (p < 0.05). 대식세포의 활성화는 OP-D 및 AlPO4 군에 비해 NOD 군에서 유의하게 개선되었다(p < 0.05). 통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 여러 그룹 간의 차이는 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 분석되었습니다. 모든 값은 평균± SD(n=8)로 표현되며, 유의한 차이는 *p < 0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001로 표현된다. 이 수치는 Tong et al.14에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 밀도 | 질량(10g당) |
| 크레모퍼 EL-35 | 부피 | 1.92 |
| 글리세롤 | 부피 | 0.48 |
| 증권 시세 표시기 | 부피 | 0.6 |
| 초순수 | 부피 | 잔여 금액 |
표 1: BNE의 공식.
| 시약 | 밀도 | 음량 |
| β- 메르캅토에탄올 | 50μM | 0.366μL |
| 태아 소 혈청 | 1배 | 10 밀리람베르트 |
| 글루타맥스 | 2미디엄 | 1mL |
| 글루타맥스 RPMI 1640 | 1배 | 85mL |
| 헤페스 | 10mM | 1mL |
| 비필수 아미노산(x100) | 1배 | 1mL |
| 페니실린-스트렙토 마이신 용액 | 100U / 밀리리터 | 1mL |
| 나트륨 피루 베이트 (100 mM) | 1 미디엄 | 1mL |
표 2: RF-10 완전 배지에 대한 준비 정보.
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Discussion
서브유닛 백신은 안전성은 우수하지만 면역원성은 좋지 않습니다. 면역원성을 향상시키기 위한 주요 전략은 항원을 보조제와 물리적으로 흡착하거나 결합하고 이를 약물 전달 시스템에 통합하여 DC의 흡수 및 제시를 촉진하는 것입니다. 퀼라이아 사포닌 및 그 유도체와 같은 천연 식물 사포닌은 독성이 강하며 인간 백신 개발에 적합하지 않습니다17. 따라서 백신이나 보조제가 세포에 미치는 독성 영향에 대한 연구는 새로운 백신 평가에서 필요한 첫 번째 단계입니다.
이 연구에서 제시된 프로토콜은 ISO 10993-5:200918에 따라 수행되어 샘플 제작에 약간의 유연성을 허용합니다. 표준 독성 세포주, L929 섬유아세포 및 치은 섬유아세포는 유사한 수준의 세포독성을 갖는다. 그러나, L929 섬유아세포는 이들의 우수한 재현성 때문에 나노물질의 시험관내 독성 시험을 위한 유용한 스크리닝 모델이 되었다19. MTT 및 CCK-8은 일반적으로 세포 생존율 및 세포 독성 분석에 사용됩니다. MTT 및 CCK-8 분석의 결과는 서로 모순되고 유의한 상관관계가 없지만, CCK-8 분석의 세포 생존율은 MTT 분석(20)의 세포 생존율과 상당히 상이하다. 이전 연구에서 MTT 결과에 대한 가능한 설명은 가속화된 세포 사멸이 더 높은 MTT 농도에서 유도될 수 있다는 것이다(21). CCK-8 방법의 실험 결과는 일반적으로 동물 독성 시험22의 결과와 일치한다. 따라서 새로운 세포 독성 평가 방법을 사용할 수있을 때까지 CCK-8 분석을 사용하여 L929 세포에 대한 OP-D 및 NOD의 독성을 검출하는 것이 현재 최선의 선택 일 것입니다. 이 방법은 백신 재료 및 보조제 평가 분야에도 계속 적용될 것입니다.
비장은 인체에서 가장 큰 이차 림프 기관이며 비장의 염증성 사이토 카인 수치를 정량화하면 면역 반응을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다23. 마우스와 인간의 비장 사이에 구조와 세포 유형에 몇 가지 근본적인 차이가 있다고 믿어집니다24, 그러나 특정 면역 세포 유형의 기본 유사성과 비장 영역의 기능은 마우스 비장 T 세포를 사용한 연구를 관련24로 만듭니다. 이 프로토콜에서, 우리는 ELISA 키트를 사용하여 비장에서 Th1 사이토카인 IFN-γ 및 Th17 사이토카인 IL-17A의 분비 수준을 측정하였다. 이 분석은 일반적으로 정량적 측정에 사용되며 비특이적 물질을 씻어내기 위해 고친화성 항체를 사용하기 때문에 민감도가 높습니다. 이 연구의 주요 한계는 긴 측정 시간과 시약의 높은 소비입니다. 사이토카인은 유세포분석 및 Luminex 방법으로도 검출할 수 있지만 이러한 방법에는 복잡한 기기와 값비싼 원료 및 전문 교육이 필요합니다. 따라서 이 간단하고 경제적인 ELISA 키트는 특정 면역 반응을 측정하는 데 유용한 도구입니다. ELISpot은 특정 사이토카인 스팟 형성 세포의 면역 반응을 결정하는 데 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나가 되었습니다. 백신 후보에 의해 유도된 CD8+ T 세포 반응을 검출하는 것뿐만 아니라 면역화 후 특정 항원의 인식에도 사용할 수 있습니다25. 고처리량 스크리닝과 민감한 검출 한계(1/100,000 세포)를 갖춘 ELISpot은 세포의 직접 관찰과 신속한 분석의 이점도 제공하므로 널리 사용됩니다. 각 반점의 형성은 개별 T 세포 또는 B 세포의 활성화 빈도를 나타냅니다백신 및 보조제에 대한 세포 반응의 평가는 현재 ELISpot을 대체 할 수 없게 만드는 매우 중요합니다.
DC에 의한 항원의 제시는 면역 반응을 유도하기 위한 전제 조건이다14. 항원 흡수, 림프절로의 이동 및 나이브 T 세포의 활성화에 사용되는 DC는 T 세포 매개 면역 반응의 발달에 필수적인 세포 유형 중 하나입니다14. 나노에멀젼 입자와 세포막의 상호작용이 입자 흡수의 핵심 결정 요인이라는 점을 고려할 때, DC 내의 GFP 식균작용은 이 실험 프로토콜에서 CLSM을 사용하여 결정되었습니다. DC는 항원을 배수 림프절로 효율적으로 운반할 수 있는 것으로 나타났으며, 이것이 보조제가 생체 내에서 항원 면역원성을 향상시키는 이유일 수 있습니다. 또한 CLSM은 이 기술의 가장 일반적인 상업적 구현이며 이미징 실험실에서 널리 사용됩니다. CLSM의 3D 이미징26 의 광학 절단 기능, 명확한 해상도 및 다양성은 정량적 데이터 수집에 사용할 수 없는 경우에도 DC의 항원 흡수를 분석하는 데 가장 적합한 도구입니다.
주요 조직적합성 복합체(MHC I 및 II)는 항원의 특이적 인식에 중요합니다. MHC II 기능성 분자는 APC에서 고도로 발현되며 CD4+ T 세포 활성화를 유도하는 기능을 합니다. APC는 적응 면역을 강력하게 조절하는 대식세포, DC 및 B 림프구(27)를 포함한다. 대식세포는 숙주 면역계에 널리 분포되어 있으며 방어 및 항상성에서 핵심적인 역할을 합니다28. 대 식세포의 활성화는 적응 면역 반응을 시작하는 데 필수적입니다29. 한편, 병원체와 동일한 크기의 나노 에멀젼 보조제는 항원 인식 및 식균 작용을 촉진하고, NALP3 인플라마좀 및 대 식세포를 활성화하고, 항원 제시를 조절할 수있다28. 이 프로토콜에서, PMs는 주로 전염증성 사이토카인 IL-1β 및 Th2, 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 분비를 ELISA에 의해 결정하기 위한 모델로 사용되었으며, 이는 백신 및 보조제의 대식세포 활성화 능력을 정성적으로 평가하는 데 사용될 수 있다. 그러나 활성화의 정도와 메커니즘은 더 많은 실험에 의해 결정되어야합니다. 예를 들어, EGF, IL-6 및 면역 세포의 활성화에 필요한 기타 인자가 분비되는지 여부와 관련 신호 전달 경로 (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt 등)를 연구해야합니다.
요약하면, 세포 독성, 사이토카인 분비, DC 흡수 및 대식세포 활성화를 포함하는 신규한 보조제에 대한 시험 관내 세포 반응을 확인하기 위한 일련의 프로토콜이 확립되었습니다. 이러한 프로토콜은 낮은 독성 및 높은 세포 전달을 입증할 뿐만 아니라 CCK-8, ELISA 및 ELISpot에 대한 자세한 절차도 제공합니다. 식물 유래 면역 강화제 OP-D 및 변형 된 강력한 나노 에멀젼 백신 보조제 NOD의 세포 반응 평가가 시험관 내에서 완료되었으며 프로토콜이 효과적이었습니다. ELISA, ELISpot 및 컨포칼 레이저 스캐닝 기술은 세포에 대한 보조제의 체외 면역능력을 평가하기 위해 고전적으로 사용되었지만 이러한 방법에는 긴 측정 시간, 과중한 작업량, 값비싼 재료 및 전문 기술자의 필요성과 같은 많은 단점이 있습니다. 유전자 칩, 단일 세포 시퀀싱 및 전사체 기술과 같은 많은 정확한 방법과 고급 기술을 향후 연구에서 사용하여 기술의 범위를 더욱 확장해야 합니다.
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Disclosures
저자는이 논문에보고 된 작업에 영향을 미칠 수있는 경쟁적인 재정적 또는 개인적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램의 보조금 번호 2021YFC2302603, 중국 국립 자연 과학 재단 프로그램의 보조금 번호 31670938, 32070924, 82041045 및 32000651, 충칭 자연 과학 재단 프로젝트 프로그램의 보조금 번호 2014jcyjA0107 및 2019jcyjA-msxmx0159, 보조금 번호. 충칭의 대학원 연구 및 혁신 프로젝트의 CYS21519, 육군 의과 대학 특별 프로젝트의 보조금 번호 2020XBK24 및 대학생을위한 국가 혁신 및 기업가 정신 프로그램 202090031021 번 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
