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Immunology and Infection

इन विट्रो नैनोइमल्शन वैक्सीन एडजुवेंट ओफिओपोगोनिन डी का सेलुलर गतिविधि मूल्यांकन

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64291
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, National Engineering Research Centre of Immunological Products, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA, 2Institute of Combined Injury of PLA, College of Military Preventive Medicine, Third Military Medical University of Chinese PLA

Summary

प्रोटोकॉल मूल्यांकन के लिए विस्तृत तरीके प्रस्तुत करता है कि क्या नैनोइमल्शन ओफिओपोगोनिन डी सहायक प्रभावी सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देता है।

Abstract

टीकों के एक प्रमुख घटक के रूप में, सहायक सीधे एंटीजन से जुड़े शक्तिशाली, व्यापक, जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित या बढ़ा सकते हैं। ओफिओपोगोन डी (ओपी-डी), पौधे ओफिओपोगोन जैपोनिकस से निकाला गया एक शुद्ध घटक, वैक्सीन सहायक के रूप में उपयोगी पाया गया है। ओपी-डी की कम घुलनशीलता और विषाक्तता की समस्याओं को नैनोइमल्शन ओफिओपोगोनिन डी (एनओडी) तैयार करने के लिए कम ऊर्जा वाले पायसीकरण विधि का उपयोग करके प्रभावी ढंग से दूर किया जा सकता है। इस लेख में, सेलुलर गतिविधि मूल्यांकन के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला की जांच की जाती है। एल 929 के साइटोटोक्सिक प्रभाव ों को सेल काउंटिंग किट -8 परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। फिर, प्रतिरक्षित चूहों से स्प्लेनोसाइट्स की उत्तेजना और संस्कृति के बाद स्रावित साइटोकिन स्तर और संबंधित प्रतिरक्षा कोशिका संख्या का पता एलिसा और ईएलआईस्पॉट विधियों द्वारा लगाया गया था। इसके अलावा, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं (बीएमडीसी) में एंटीजन अपटेक क्षमता, जो सी 57बीएल / 6 चूहों से अलग थी और जीएम-सीएसएफ प्लस आईएल -4 के साथ इनक्यूबेशन के बाद परिपक्व हुई थी, लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) द्वारा देखी गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, मैक्रोफेज सक्रियण की पुष्टि आईएल -1, आईएल -6, और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ -α) साइटोकिन्स के स्तर को एलिसा किट द्वारा 24 घंटे के लिए सहायक के साथ खाली चूहों से पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) को जोड़ने के बाद की गई थी। यह आशा की जाती है कि यह प्रोटोकॉल अन्य शोधकर्ताओं को नए वैक्सीन सहायक दवाओं की सेलुलर प्रतिक्रिया प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्यक्ष और प्रभावी प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करेगा।

Introduction

टीके संक्रामक और गैर-संचारी रोगों को रोकने और उनका इलाज करने का एक महत्वपूर्ण साधन हैं। वैक्सीन फॉर्मूलेशन में सहायक और वितरण वाहनों का उचित जोड़ एंटीजन की इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाने और लंबे समय तक चलने वालीप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न करने के लिए फायदेमंद है। शास्त्रीय सहायक फिटकरी (एल्यूमीनियम नमक) के अलावा, टीकों के लिए छह प्रकार के सहायक हैं जो वर्तमान में विपणन किए जाते हैं: एमएफ 59 2,3,एएस04 3,एएस03 3,एएस01 3, सीपीजी 10184, और मैट्रिक्स-एम5। आम तौर पर, जब मानव शरीर एक वायरल हमले का सामना करता है, तो रक्षा की पहली और दूसरी लाइनें (त्वचा, म्यूकोसा और मैक्रोफेज) वायरस को साफ करने में अग्रणी होती हैं, और अंत में, प्रतिरक्षा अंगों और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शामिल करने वाली रक्षा की तीसरी पंक्ति सक्रिय होती है। एल्यूमीनियम और एल्यूमीनियम लवण 1920 के दशक की शुरुआत से मानव टीकों के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले सहायक रहे हैं, जो एक प्रभावी जन्मजातप्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करते हैं। हालांकि, यह प्रस्तावित किया गया है कि शास्त्रीय सहायक द्वारा एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एपीसी) की सक्रियता, जो साइटोकिन्स और केमोकाइन के विशिष्ट सेट उत्पन्न करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं को उत्तेजित करती है, वह तंत्र है जिसके द्वारा सहायक काम करते हैं और यह एक कारण हो सकता है कि सहायक विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर केवल क्षणिक प्रभावडालते हैं। मानव उपयोग के लिए सीमित लाइसेंस प्राप्त सहायक दवाओं की उपस्थिति टीकों को विकसित करने के लिए एक प्रतिबंधात्मक कारक है जो प्रभावीप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करते हैं।

वर्तमान में, सहायक अध्ययनों की बढ़ती संख्या चूहों में एक मजबूत सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने की क्षमता का प्रदर्शन कर रही है। क्यूएस -21 को एक संतुलित टी-हेल्पर 1 (टीएच 1) और टी-हेल्पर 2 (टीएच 2) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करने, एंटीबॉडी टिटर्स के उच्च स्तर का उत्पादन करने और एक सहायक के रूप में सुरक्षा को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, लेकिन इसकी मजबूत विषाक्तता और हेमोलिटिक गुण एक स्टैंडअलोन नैदानिक सहायक 9,10 के रूप में इसके विकास को सीमित करते हैं। ओपी-डी (रुस्कोजेनिन-ओ-α-एल-रेहम्नोपाइरानोसी 1-(1→2)-β-डी-जाइलोपाइरानोसाइल-(1→3)-β-डी-फ्यूकोपायरानोसाइड) चीनी औषधीय पौधे ओफिओपोगोन जैपोनिकास4 की जड़ से पृथक स्टेरायडल सैपोनिन में से एक है। इसके अतिरिक्त, यह मूलांक ओफिओपोगोनिस में पाया जाने वाला मुख्य औषधीय रूप से सक्रिय घटक (शेन माई सैन) है औरइसमें कुछ औषधीय गुण हैं। इसके अलावा, यह लिलियासी परिवार का एक सदस्य है और सेलुलर सूजन और मायोकार्डियल चोट में इसके निरोधात्मक और सुरक्षात्मक प्रभावों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, ओपी-डी बीएएलबी /सी चूहों में डीएनएसीबी-प्रेरित एटोपिक जिल्द की सूजन जैसे घावों और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा (टीएनएफ -α) भड़काऊ एचसीएटी कोशिकाओं को सुधारता है। महत्वपूर्ण रूप से, ओपी-डी कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम के एंटीऑक्सिडेटिव संरक्षण को बढ़ावा देता है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी को कम करके और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षति को बाधित करके डॉक्सोर्यूबिसिन-प्रेरित ऑटोफैजिक चोट के खिलाफ दिल की रक्षा करता है। प्रयोगों से पता चला है कि मोनो-डेस्मोसाइड के साथ ओपी-डी लेने से प्रतिरक्षा स्वास्थ्य को बढ़ावा देने, सफेद रक्त कोशिका की गिनती और डीएनए संश्लेषण में वृद्धि करने और एंटीबॉडी को लंबे समय तक बनाने में मदद मिलतीहै। यह पहले पाया गया है कि ओपी-डी का एक सहायक प्रभाव14 है।

नैनोइमल्शन तेल-इन-वाटर नैनोफॉर्मुलेशन हैं जो सर्फेक्टेंट, तेल, कोसर्फेक्टेंट्स और पानी12,15 के संयोजन से बने होते हैं। ये नैनोवैक्सीन डिज़ाइन एंटीजन और सहायक को प्रतिरक्षा उत्तेजना को बढ़ाने, एंटीजन की रक्षा करने और डेंड्राइटिक सेल (डीसी) परिपक्वता को बढ़ावा देने के लिए एक साथ समझाया जासकता है। स्क्रीनिंग से प्राप्त इन नवीन सहायक दवाओं के विकास के लिए, उनकी सेलुलर प्रतिक्रिया क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए उचित तरीके खोजना महत्वपूर्ण है।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य व्यवस्थित रूप से मूल्यांकन करना है कि क्या सहायक इन विट्रो सेल संस्कृति में फागोसाइटोसिस और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकते हैं और मुख्य प्रयोगात्मक तरीकों पर विस्तृत कर सकते हैं। प्रयोग को चार उपखंडों में विभाजित किया गया है: (1) एल 929 कोशिकाओं के लिए ओपी-डी और एनओडी की विषाक्तता सेल काउंटिंग किट -8 (सीसीके -8) परख द्वारा निर्धारित की जाती है; (2) अंतःस्रावी आईएफएन -γ और आईएल -17 ए के साइटोकिन स्तर और प्रतिरक्षित चूहों में संबंधित सेल संख्या स्प्लेनोसाइट उत्तेजना और ईएलआईस्पॉट परख द्वारा पता लगाया जाता है; (3) सहायक उत्तेजना के बाद डीसी की एंटीजन प्रस्तुति क्षमता को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जाता है; और (4) सामान्य चूहों में पेरिटोनियल मैक्रोफेज (पीएम) से प्राप्त सुपरनैटेंट में तीन प्रकार के साइटोकिन्स, आईएल -1, आईएल -6, और टीएनएफ -α का पता लगाया जाता है।

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Protocol

सभी सेल प्रयोगों को बुनियादी ऑपरेटिंग रूम, बफर रूम, बाँझ संस्कृति कक्ष और पहचान और विश्लेषण कक्षों से लैस सेल इंजीनियरिंग प्रयोगशाला में किया गया था। काम करने का माहौल और स्थितियां माइक्रोबियल संदूषण और अन्य हानिकारक कारकों से मुक्त थीं। पशु प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए दिशानिर्देशों के आधार पर आयोजित किए गए थे और तीसरे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला पशु कल्याण और नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

1. आटोक्लेविंग और सामग्री तैयारी

  1. 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेविंग करके नम गर्मी नसबंदी करके अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों, जैसे फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस), कैंची, फोर्सप्स और अपघर्षक जाल तैयार करें।
  2. आवश्यक अभिकर्मकों और उपकरणों के लिए, सामग्री की तालिका देखें। रिक्त नैनोइमल्शन (बीएनई) के सूत्र के लिए, तालिका 1 देखें।

2. एल 9 2 9 साइटोटॉक्सिसिटी परख

  1. पानी के स्नान को चालू करें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें। तरल नाइट्रोजन से जमे हुए एल 929 कोशिकाओं की एक ट्यूब एकत्र करें और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी से पिघल जाएं।
  2. पिघलने के तुरंत बाद कोशिकाओं को 15 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें, 2 एमएल डीएमईएम जोड़ें, और अच्छी तरह मिलाएं।
  3. नमूने को 5 मिनट के लिए 129 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। फिर, कोशिकाओं को पुन: निलंबित करने के लिए डीएमईएम के 2 एमएल जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 129 x g पर फिर से नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सुपरनैटेंट को छोड़ दें, पुन: निलंबन के लिए डीएमईएम पूर्ण माध्यम (10% एफबीएस युक्त) के 6 एमएल जोड़ें, और 48 घंटे के लिए कल्चर में 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में टी25 कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  5. कल्चर फ्लास्क में कल्चर माध्यम को त्याग दें और कोशिकाओं को 2 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धोएं। फिर, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिनट के लिए कोशिकाओं को पचाने के लिए 0.25% ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें।
  6. जब कोशिकाओं का गोलाई देखी जाती है, तो पाचन को तुरंत समाप्त करने के लिए डीएमईएम पूर्ण माध्यम के 4 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। फिर, कोशिकाओं को 15 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एस्पिरेट करें और 5 मिनट के लिए 129 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. सुपरनैटेंट को हटा दें और डीएमईएम पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल गिनती प्लेटों का उपयोग करके सेल गिनती के लिए 20 μL सेल निलंबन का उपयोग करें और शेष कोशिकाओं को DMEM पूर्ण माध्यम के साथ 1 x 105 कोशिकाओं / mL तक पतला करें।
  8. 96-वेल प्लेट की परिधि में 100 μL अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें और केवल आंतरिक कुओं में 100 μL सेल डिल्यूएंट जोड़ें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए अनुयायी संस्कृति के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
  9. कोशिकाओं के पालन करने के बाद, डीएमईएम पूर्ण माध्यम में ओपी-डी और एनओडी को अलग-अलग 200 μL / well की अंतिम मात्रा में जोड़ें (प्रत्येक दवा की अंतिम सांद्रता 480 μg / mL, 240 μg / mL, 120 μg / mL, 60 μg / mL, और 30 μg / mL है)। प्रत्येक एकाग्रता के लिए, प्रतिकृति के रूप में तीन कुओं का उपयोग करें। फिर, कोशिकाओं को इनक्यूबेटर और संस्कृति में 24 घंटे के लिए वापस रखें।
  10. डीसीके -8 को डीएमईएम पूर्ण माध्यम के साथ 10% तक पतला करें और 96-वेल प्लेट में सहायक और सेल समाधान युक्त 100 μL / अच्छी तरह से कमजोर पड़ने जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें और 2-3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. सेल वर्षा के कारण असमानता को रोकने के लिए सेल समाधान को चढ़ाते समय अक्सर मिलाएं। मध्यम और सीसीके -8 समाधान को अच्छी तरह से मिलाने के लिए सीसीके -8 जोड़ने से पहले और बाद में प्लेट को धीरे से कई बार हिलाएं।
  12. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 450 एनएम पर अवशोषण को मापें। बेसलाइन अवशोषण मान के लिए केवल मध्यम और सीसीके -8 के साथ एक शून्य कुआं सेट करें। प्लॉटिंग करते समय प्राप्त अवशोषण मान से शून्य अवशोषण मान को घटाकर सटीक अवशोषण मूल्यों की गणना करें।
  13. पुष्टि करें कि माइक्रोप्लेट रीडर के साथ परीक्षण करने से पहले किसी भी कुओं में कोई बुलबुले मौजूद नहीं हैं क्योंकि बुलबुले परख में हस्तक्षेप करेंगे।

3. स्प्लेनोसाइट उत्तेजना

  1. 6-8 सप्ताह की आयु के चूहों को निम्नलिखित प्रयोगात्मक समूहों के अनुसार दिन 0, दिन 7 और दिन 14 पर इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन (200 μL) के माध्यम से 30 μg प्रोटीन एंटीजन और 30 μg सहायक के साथ प्रतिरक्षित करें: (1) पीबीएस समूह, (2) एंटीजन (एजी) समूह, (3) एंटीजन + ओपी-डी (एजी / (5) एंटीजन + एनओडी (एजी / एनओडी) समूह, और (6) एंटीजन + एएलपीओ4 (एजी / एएल) समूह।
  2. तैयारी कक्ष: प्राथमिक टीकाकरण के बाद 24 वें दिन, चूहों को पशु कक्ष से हटा दें और 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल के 100 मिलीग्राम / किग्रा के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा उन्हें इच्छामृत्यु दें। चूहों को एक ग्लास डिश में रखें और 5 मिनट के लिए 75% अल्कोहल में भिगोदें।
  3. सेंट्रीफ्यूज ट्यूब रैक पर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें, डिस्पोजेबल पेट्री व्यंजनों को नंबर दें, और 10 एमएल पिपेट के साथ प्रत्येक पेट्री डिश में 5 एमएल पीबीएस जोड़ें।
  4. माउस के बाईं उदर पक्ष के बीच में कैंची के साथ 6-8 सेमी चीरा लगाएं, त्वचा को फाड़ें, पेट की दीवार को उजागर करें, और प्लीहा की लंबी लाल पट्टी का पता लगाएं।
  5. पेरिटोनियम को बल के साथ तिल्ली के अवर पक्ष पर उठाएं, इसे खोलें, और प्लीहा को उजागर करने के लिए इसे ऊपर की ओर घुमाएं। बल के साथ प्लीहा को उठाएं, नेत्र कैंची के साथ प्लीहा के नीचे संयोजी ऊतक को अलग करें, और प्लीहा को हटा दें।
  6. तिल्ली को पेट्री डिश में रखें जिसमें 5 एमएल पीबीएस होता है और छलनी (200 जाल, 70 μm) और पीसने वाली पट्टी के साथ मिल जाता है। पीसने के बाद, नंबरिंग के अनुसार कोहनी ड्रॉपर के साथ तरल को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. 5 मिनट के लिए 453 x g पर तरल को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, प्रत्येक ट्यूब में 3 एमएल लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर जोड़ें, कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर लाइस करें।
  8. प्रत्येक ट्यूब में 10-12 एमएल पीबीएस जोड़ें, ट्यूब को उल्टा मिलाएं, और 5 मिनट के लिए 453 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, प्रत्येक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 10 एमएल पीबीएस जोड़ें, और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  9. सेल काउंटिंग प्लेट के एक कुएं में प्रत्येक नमूने का 20 μL लें और स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड करें।
  10. नमूने को 5 मिनट के लिए 453 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, आरएफ -10 माध्यम (तालिका 2 में सूत्रीकरण जानकारी) के साथ 2.5 x 106 कोशिकाओं / एमएल में पतला करें, और 100 μL / अच्छी तरह से 96-वेल प्लेट में जोड़ें।
  11. एंटीजन को आरएफ -10 माध्यम से 10 μg / mL तक पतला करें, प्रत्येक कुएं में 100 μL जोड़ें, और 5%CO2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में कोशिकाओं के प्रत्येक समूह से प्राप्त सेल निलंबन को एस्पिरेट करें, 20 मिनट के लिए 453 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को एक स्वच्छ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एस्पिरेट करें।
  13. एलिसा किट निर्देशों के अनुसार सख्ती से आईएफएन -γ और आईएल -17 ए सामग्री का पता लगाना। विधियाँ और प्रक्रियाएँ इस प्रकार हैं।
  14. 1x वाशिंग बफर वर्किंग सॉल्यूशन (किट के साथ प्रदान किया गया), मानक ग्रेडिएंट कंसंट्रेशन सॉल्यूशन (500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 62.5 pg/mL, 31.3 pg/mL, और 15.6 pg/mL को किट के साथ प्रदान किया गया कमजोरज़ोरफ़र R [1x] में तैयार करें), बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी वर्किंग सॉल्यूशन (1:100 तक पतला बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी समाधान)। और आवश्यकतानुसार स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी काम करने वाला समाधान।
  15. मानक कुएं में पतला साइटोकिन मानक घोल का 100 μL/वेल जोड़ें, नमूने के कुएं में 100 μL/वेल नमूना जोड़ें (किट के साथ प्रदान किया गया कमजोर पड़ने वाला बफर R [1x] नमूना कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किया जाता है), और 100 μL/वेल तनुकरण बफर R (1x) को रिक्त नियंत्रण कुएं में जोड़ें।
  16. 50 μL / अच्छी तरह से बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी वर्किंग समाधान जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं, सीलिंग झिल्ली के साथ कवर करें, और 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  17. कुओं से तरल निकालें और 300 μL / अच्छी तरह से 1x वाशिंग बफर वर्किंग घोल जोड़ें। 1 मिनट के बाद कुओं से तरल को फेंक दें। इस प्रक्रिया को 4x दोहराएं जिससे तरल को हर बार फ़िल्टर पेपर पर सूखने की अनुमति मिलती है।
  18. स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी वर्किंग सॉल्यूशन के 100 μL / वेल जोड़ें। नमूनों को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कवर करें और इनक्यूबेट करें। नमूने को 5 मिनट के लिए 453 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    नोट: धोने की प्रक्रिया के दौरान प्रतिक्रिया में अच्छी तरह से शेष धुलाई समाधान को अच्छी तरह से थपथपाया जाना चाहिए जब तक कि फ़िल्टर पेपर पर कोई वॉटरमार्क नहीं देखा जा सके।
  19. 100 μL / कुएं पर TMB जोड़ें, अंधेरे में 5-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें, और कुएं (गहरे नीले) में रंग की गहराई के अनुसार समाप्ति प्रतिक्रिया का न्याय करें। आमतौर पर, रंग विकास के लिए 10-20 मिनट अच्छे परिणाम प्राप्त कर सकते हैं।
  20. 100 μL / अच्छी तरह से स्टॉप समाधान जोड़कर प्रतिक्रिया को जल्दी से समाप्त करें। समाप्ति के बाद 10 मिनट के भीतर 450 एनएम पर अवशोषण मूल्य का पता लगाएं।
    नोट: उपयोग से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अभिकर्मक को बराबर करें।

4. ईएलआईस्पॉट परख

  1. चूहों का टीकाकरण और स्प्लेनोसाइट्स का संग्रह ठीक वैसा ही करें जैसा कि ऊपर दिए गए चरण 3.1-3.10 में वर्णित है। किट निर्देशों के अनुसार आईएफएन -γ और आईएल -17 ए के लिए परीक्षण करें। विधियाँ और प्रक्रियाएँ इस प्रकार हैं।
  2. सील किए गए पैकेज से प्लेट निकालें, बाँझ पीबीएस (200 μL / अच्छी तरह से) के साथ 4x धोएं, और इसे 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित करने के लिए 1640 पूर्ण संस्कृति माध्यम (200 μL /
  3. माध्यम को हटा दें और स्प्लेनोसाइट निलंबन को आरएफ -10 माध्यम से 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें, प्रति कुएं में 50 μL कोशिकाओं और एंटीजन को जोड़ें (अंतिम एकाग्रता: 10 μg / mL)।
  4. प्लेट को 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रखें। इस समय के दौरान प्लेट को स्थानांतरित न करें, और वाष्पीकरण से बचने के उपाय करें (उदाहरण के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट लपेटें)।
  5. फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (0.5 एमएल: 100 एमएल) में डिटेक्शन एंटीबॉडी (बीवीडी 6-24 जी 2-बायोटिन) को 1 μg / mL (1: 1,000) तक पतला करें जिसमें 0.5% भ्रूण गोजातीय सीरम (PBS-0.5% FBS) होता है। प्लेट में 100 μL / अच्छी तरह से जोड़ें, और इसे 0.22 μm झिल्ली के माध्यम से निस्पंदन के बाद 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  6. कुओं में तरल को डिकैंटिन करें, 1x वॉशिंग बफर को 200 μL/ कुएं पर जोड़ें, और 5x धो लें। हर बार 30-60 सेकंड के लिए छोड़ दें, और आखिरी बार, सोख्ता कागज पर सूखने दें।
  7. पीबीएस -0.5% एफबीएस में स्ट्रेप्टाविडिन-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (1: 1,000) को पतला करें और 100 μL / कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। चरण 4.6 में प्लेट को धो लें।
  8. उपयोग के लिए तैयार टीएमबी सब्सट्रेट समाधान के 100 μL / अच्छी तरह से जोड़ें और एक स्पष्ट स्थान दिखाई देने तक विकसित करें। विआयनीकृत पानी में बड़े पैमाने पर धोकर रंग विकास को रोकें (5x-6x बार-बार कुल्ला करें)। यदि आवश्यक हो, तो पुलिया (प्लेट के नीचे नरम प्लास्टिक) को हटा दें, और झिल्ली के निचले हिस्से को कुल्ला करें।
  9. प्लेट के सूखने के बाद ईएलआईस्पॉट रीडर या विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर धब्बे की जांच और गिनती करें।

5. डीसी द्वारा उत्थान

  1. सामान्य चूहों को 1% सोडियम पेंटोबार्बिटल के 100 मिलीग्राम / किग्रा के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा यूथेनाइज़ करें। चूहों को 5 मिनट के लिए 75% अल्कोहल में भिगोएं।
  2. कैंची से माउस के पेट के नीचे 6-8 सेमी चीरा काटें, और इसे अलग-अलग दिशाओं में अलग करने और माउस के पैरों को उजागर करने के लिए उद्घाटन के दो सिरों को दबाएं। माउस फीमर को माउस बॉडी से और टिबिया को जोड़ से अलग करें, और दोनों सिरों पर हड्डियों को बरकरार रखें।
  3. कैंची और बल के साथ फीमर के दोनों सिरों पर आर्टिकुलर जोड़ों से अवशिष्ट ऊतक और उपास्थि को हटा दें। फीमर को 5 मिनट के लिए 75% अल्कोहल में भिगोएं, और फिर सतह शराब को धोने के लिए बाँझ पीबीएस समाधान में भिगोदें।
  4. कैंची से फीमर के सिरों को काट लें, और बाँझ पीबीएस घोल के साथ बाँझ पेट्री डिश में अस्थि मज्जा को कुल्ला करें, इसके बाद 1 एमएल सिरिंज के साथ आकांक्षा करें। धोने को 3x-5x दोहराएं।
  5. सेल छलनी (200 जाल, 70 μm) द्वारा फ़िल्टर करें और BMDCs को 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र करें। 5 मिनट के लिए 290 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर के 4 एमएल जोड़ें, पुन: निलंबित करें, और लाइस करें।
  6. लाइसेट को बेअसर करने के लिए बाँझ पीबीएस समाधान का 10 एमएल जोड़ें, सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 290 x g पर, और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
  7. डीएमईएम के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें जिसमें 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान और 10% एफबीएस और गिनती होती है। फिर, माध्यम में जीएम-सीएसएफ (20 एनजी / एमएल) प्लस आईएल -4 (10 एनजी / एमएल) जोड़ें, सेल एकाग्रता को 5 x 105 / एमएल में समायोजित करें, और कवरलिप्स पर कोशिकाओं को टीका लगाएं।
  8. सेल सस्पेंशन को 2 एमएल / वेल पर 6-वेल प्लेट में जोड़ें, और प्लेट को 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रखें। 2 दिनों के बाद माध्यम को पूरी तरह से बदलें, और 4 दिनों के बाद माध्यम का आधा हिस्सा बदलें।
  9. संस्कृति के सातवें दिन प्रयोग के लिए 100x आवर्धन पर उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अच्छी स्थिति में कोशिकाओं (सेल की सतह पर डेंड्राइटिक प्रोट्रूशियंस के साथ बड़ी और रेडियोलुसेंट कोशिकाएं) के साथ पांच कुओं का चयन करें। सतह पर तैरने वाला तत्व छोड़ दें, प्रत्येक कुएं में 2 एमएल जीएफपी, ओपी-डी + जीएफपी, और एनओडी + जीएफपी समाधान जोड़ें, जिन्हें डीएमईएम पूर्ण माध्यम (जीएफपी अंतिम एकाग्रता: 20 μg / mL; सहायक अंतिम एकाग्रता: 10 μg / mL) के साथ पतला किया गया है, और अंधेरे में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  10. प्लेटों को पीबीएस के साथ 3x धोएं, प्रत्येक कुएं में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 1 एमएल जोड़ें, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। निर्धारण के बाद पैराफॉर्मलडिहाइड को हटा दें, फैलोइडिन और डीएपीआई के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए 10 मिनट के लिए 10 μg / mL की अंतिम सांद्रता तक इनक्यूबेट करें, और फिर पीबीएस के साथ 3x धो लें।
  11. प्रत्येक कुएं में 1 एमएल पीबीएस जोड़ें, और सीएलएसएम का उपयोग करके एंटीजन अपटेक का निरीक्षण करें, जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. CLSM सॉफ़्टवेयर खोलें, ZEN सिस्टम पर क्लिक करें, और हार्डवेयर प्रारंभ पूरा होने की प्रतीक्षा करें।
    2. देखे जा सकने वाले क्षेत्र को खोजने के लिए लोकाउट टैब में जीएफपी और डीएपीआई शॉर्टकट पर क्लिक करें। फ्लोरोसेंट लाइट को बंद करें और प्रकाश संचारित करें।
    3. डाई लाइब्रेरी खोलने के लिए अधिग्रहण मेनू में स्मार्ट सेटअप पर क्लिक करें, और तीन फ्लोरोसेंट रंग जोड़ें: ईजीएफपी, फैलोइडिन और डीएपीआई। सर्वश्रेष्ठ सिग्नल पर क्लिक करें > ठीक है। चैनल टैब में ईजीएफपी चैनल पर क्लिक करें और सही इंटरफ़ेस पर सही क्षेत्र का चयन करने के लिए लाइव पर क्लिक करें।
    4. पिनहोल के लिए 1 एयू का चयन करें, फोकल लंबाई को समायोजित करने के लिए ठीक फोकसिंग स्क्रू को घुमाएं, और उपयुक्त फोकल प्लेन का चयन करें। रेंज इंडिकेटर पर क्लिक करें और लेजर पावर और मास्टर गेन के संयोजन को समायोजित करें ताकि छवि पर केवल छिटपुट लाल बिंदु दिखाई दें।
    5. लेजर पावर को बदलने के बिना समान मापदंडों के साथ फैलोइडिन और डीएपीआई चैनलों को समायोजित करें।
    6. शूटिंग पैरामीटर बदलने के लिए स्टॉप लाइव का चयन करें और अधिग्रहण मोड पर क्लिक करें: फ्रेम आकार: 1024 पिक्सेल x 1024 पिक्सेल; स्कैन गति: 7; औसत: 2x. स्नैप पर क्लिक करें और ली गई सभी छवियों को देखने के लिए स्प्लिट का चयन करें। छवियों को सहेजें।

6. मैक्रोफेज सक्रियण

  1. इच्छामृत्यु के बाद सी 57बीएल /6 चूहों को 75% अल्कोहल में डुबोएं और उन्हें क्रमांकित क्रम में ग्लास पेट्री डिश में रखें।
  2. चूहों को बाँझ ऑपरेशन रूम में स्थानांतरण खिड़की के माध्यम से पास करें और 5 मिनट के लिए ऑपरेशन टेबल पर रखें।
  3. एक सिरिंज का उपयोग करके, 10 एमएल खारा एस्पिरेट, चूहों को लगभग 45 ° पर नीचे की ओर झुकाएं, और पेट की गुहा के बीच में इंजेक्ट करें। प्रत्येक 10 एमएल के लिए 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लगभग 5 एमएल सेल सस्पेंशन खींचें और इंजेक्शन 3 एक्स दोहराएं।
  4. माउस पेरिटोनियल प्राथमिक मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 129 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, आरपीएमआई1640 पूर्ण माध्यम (10% एफबीएस युक्त) के साथ सेल एकाग्रता को 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें, और प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की एक सुसंगत संख्या (1 एमएल / वेल) सुनिश्चित करने के लिए 24-वेल प्लेट में सेल निलंबन को टीका लगाएं।
  5. रात भर (लगभग16-20 घंटे) 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति, इसके बाद पीबीएस, एजी, एजी / ओपी-डी, एजी / एनओडी, और एजी / एएल (एजी अंतिम एकाग्रता: 5 μg / mL; सहायक अंतिम एकाग्रता: 10 `g / mL; कुल मात्रा: 2 mL) के साथ इनक्यूबेशन। चरण 3.12-3.19 में वर्णित विधियों और प्रक्रियाओं का उपयोग करके एलिसा किट के साथ कल्चर सुपरनैटेंट में आईएल -1, आईएल -6 और टीएनएफ -α के स्तर का पता लगाएं।

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Representative Results

प्रोटोकॉल के अनुसार इन विट्रो में सहायक ओपी-डी और एनओडी के सेलुलर गतिविधि मूल्यांकन को पूरा किया गया था। एल 929 फाइब्रोब्लास्ट एनओडी के इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण के लिए एक उपयोगी स्क्रीनिंग मॉडल हैं (चित्रा 1)। तिल्ली में भड़काऊ साइटोकिन के स्तर का परिमाणीकरण शोधकर्ताओं को प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकता है (चित्रा 2)। नैदानिक परीक्षणों में एंटीजन-विशिष्ट टी-सेल प्रतिरक्षा का आकलन करने और वैक्सीन उम्मीदवारों की स्क्रीनिंग के लिए ईएलआईस्पॉट के साथ सीटीएल की निगरानी स्वर्ण मानक है (चित्रा 3)। डीसी द्वारा एक एंटीजन के बढ़े हुए उत्थान से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में वृद्धि हो सकती है (चित्रा 4)। मैक्रोफेज टी कोशिकाओं को एंटीजन पेश करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, साथ ही अन्य एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं को कोस्टिमुलेटरी अणुओं को व्यक्त करने के लिए प्रेरित करते हैं, जिससे अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं शुरू होती हैं (चित्रा 5)। उपरोक्त प्रयोगात्मक परिणाम टोंग एट अल द्वारा प्रकाशित किए गए थे, और विवो में विभिन्न एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएं और चूहों के खिलाफ सुरक्षा दक्षता मूल लेख14 में पाई जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: एल 929 कोशिकाओं का इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण। एल 929 कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट किए जाने पर ओपी-डी और एनओडी (30 μg/mL, 60 μg/mL, 120 μg/mL, 240 μg/mL, और 480 μg/mL) की विभिन्न ढाल सांद्रता के साइटोटोक्सिक प्रभाव दिखाए गए हैं। पता लगाने के लिए एक सीसीके -8 किट का उपयोग किया गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण एक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। दो समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण एक अप्रकाशित, दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था। सभी मानों को एसडी (एन = 3) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है, और महत्वपूर्ण अंतर निम्नानुसार व्यक्त किए जाते हैं: *p < 0.05, **p < 0.01, और ***p < 0.001। इस आंकड़े को टोंग एट अल.14 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: स्प्लेनोसाइट्स में आईएफएन -γ और आईएल -17 ए के स्तर। टीकाकरण किए गए चूहों से स्प्लेनोसाइट्स को 3 दिनों के लिए एंटीजन के साथ उत्तेजित किया गया था, और सुपरनैटेंट में साइटोकिन्स (ए) आईएफएन -γ और (बी) आईएल -17 ए के स्तर को एलिसा द्वारा मापा गया था। परिणामों से पता चला है कि एजी /ओपी-डी, एजी / बीएनई और एजी / एएल समूहों (पी < 0.01) की तुलना में एजी / एनओडी समूह में आईएफएन -γ और आईएल -17 ए उत्पादन में काफी वृद्धि हुई थी। सांख्यिकीय विश्लेषण एक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। कई समूहों के बीच मतभेदों का विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किया गया था, जिसके बाद टुकी के कई तुलना परीक्षण थे। सभी मानों को एसडी (एन = 8) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है, और महत्वपूर्ण अंतर निम्नानुसार व्यक्त किए जाते हैं: *पी < 0.05, ** पी < 0.01, और *** पी < 0.001। इस आंकड़े को टोंग एट अल.14 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: स्प्लेनोसाइट आबादी में आईएफएन-γ- और आईएल -17 ए-स्रावित कोशिकाओं की संख्या। (ए) स्प्लेनोसाइट्स के बीच आईएफएन-γ स्पॉट-फॉर्मिंग एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का ईएलआईस्पॉट विश्लेषण। (बी) स्प्लेनोसाइट्स के बीच आईएल -17 ए स्पॉट-फॉर्मिंग एंटीजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं का ईएलआईस्पॉट विश्लेषण। साइटोकिन परिणामों के समान, एजी / ओपी-डी और एजी / एनओडी समूहों ने स्प्लेनिक लिम्फोइड टी सेल आबादी में आईएफएन -γ- और आईएल -17 ए बनाने वाली कोशिकाओं के अनुपात और संख्या में काफी वृद्धि देखी। एजी / एनओडी समूह ने अन्य समूहों की तुलना में मजबूत टीएच 1 (पी < 0.001) और टीएच 17 (पी < 0.01) प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित किया। सांख्यिकीय विश्लेषण एक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। कई समूहों के बीच मतभेदों का विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किया गया था, जिसके बाद टुकी के कई तुलना परीक्षण थे। सभी मानों को एसडी (एन = 8) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है, और महत्वपूर्ण अंतर निम्नानुसार व्यक्त किए जाते हैं: *p < 0.05, **p < 0.01, और ***p < 0.001। इस आंकड़े को टोंग एट अल.14 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: बीएमडीसी द्वारा एंटीजन अपटेक की सीएलएसएम छवियां। फेलोइडिन साइटोस्केलेटन को लाल रंग में दाग देता है, डीएपीआई नाभिक को नीले रंग में दाग देता है, और जीएफपी हरे रंग की प्रतिदीप्ति प्रस्तुत करता है। जैसा कि आंकड़े में दिखाया गया है, बीएमडीसी के साथ जीएफपी + ओपी-डी और जीएफपी + एनओडी समूहों के 30 मिनट के सह-ऊष्मायन के बाद सीएलएसएम में हरे रंग की प्रतिदीप्ति देखी जाती है, लेकिन जीएफपी + एनओडी कण फागोसोम जैसी वेसिकुलर संरचनाओं से घिरे होते हैं, जबकि जीएफपी + ओपी-डी कण नहीं होते हैं। इस आंकड़े को टोंग एट अल.14 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पीएम के सक्रियण पर सहायक-तैयार एंटीजन का प्रभाव। पीबीएस, एजी, एजी/ओपी-डी, एजी/एनओडी, और एजी/अल उत्तेजना के साथ सहनिर्मित पीएम के सुपरनैटेंट में साइटोकिन्स आईएल-1, आईएल-6 और टीएनएफ-α की सांद्रता का पता लगाने के लिए एलिसा। एंटीजन उत्तेजना की तुलना में, एजी/एनओडी, एजी/ओपी-डी, और एजी/अल उत्तेजना सभी ने पीएम (पी < 0.05) से आईएल-1, आईएल-6 और टीएनएफ-α स्राव में काफी वृद्धि की है। ओपी-डी और एएलपीओ4 समूहों (पी < 0.05) की तुलना में एनओडी समूह में मैक्रोफेज की सक्रियता में काफी सुधार हुआ था। सांख्यिकीय विश्लेषण एक सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। कई समूहों के बीच मतभेदों का विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किया गया था, जिसके बाद टुकी के कई तुलना परीक्षण थे। सभी मानों को एसडी (एन = 8) ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है, और महत्वपूर्ण अंतर निम्नानुसार व्यक्त किए जाते हैं: *पी < 0.05, ** पी < 0.01, और ***पी < 0.001। इस आंकड़े को टोंग एट अल.14 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) घनत्व द्रव्यमान (प्रति 10 ग्राम)
क्रेमोफोर ईएल -35 थोक 1.92
ग्लिसरॉल थोक 0.48
जीटीसीसी थोक 0.6
अल्ट्राप्योर पानी थोक अवशिष्ट राशि

तालिका 1: बीएनई का सूत्र।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) घनत्व आयतन
β- मर्काप्टोएथेनॉल 50μM 0.366μL
भ्रूण बोवाइन सीरम 1X 10 mL
ग्लूटामैक्स 2mM 1 mL
ग्लूटामैक्स आरपीएमआई 1640 1X 85 mL
HEPES 10mM 1 mL
गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (100x) 1X 1 mL
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन सॉल्यूशन 100U / 1 mL
सोडियम पाइरूवेट (100 mM) 1mM 1 mL

तालिका 2: आरएफ -10 पूर्ण माध्यम के लिए तैयारी की जानकारी।

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Discussion

सबयूनिट टीके उत्कृष्ट सुरक्षा प्रदान करते हैं लेकिन खराब इम्युनोजेनेसिटी प्रदान करते हैं। इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाने की मुख्य रणनीति सहायक दवाओं के साथ एंटीजन को शारीरिक रूप से सोखना या जोड़ना है और डीसी द्वारा उत्थान और प्रस्तुति को बढ़ावा देने के लिए उन्हें दवा वितरण प्रणालियों में शामिलकरना है। इसलिए, कोशिकाओं पर टीकों या सहायक दवाओं के विषाक्त प्रभावों का अध्ययन नए टीकों के मूल्यांकन में एक आवश्यक पहला कदम है।

इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल आईएसओ 10993-5: 200918 के अनुसार किया जाता है, जो नमूना निर्माण में कुछ लचीलेपन की अनुमति देता है। मानक विषाक्त सेल लाइन, एल 9 2 9 फाइब्रोब्लास्ट, और मसूड़े के फाइब्रोब्लास्ट में साइटोटॉक्सिसिटी के समान स्तर होते हैं। हालांकि, एल 9 2 9 फाइब्रोब्लास्ट उनकीउत्कृष्ट प्रजनन क्षमता के कारण नैनोमैटेरियल्स के इन विट्रो विषाक्तता परीक्षणों के लिए एक उपयोगी स्क्रीनिंग मॉडल बन गए हैं। एमटीटी और सीसीके -8 आमतौर पर सेल व्यवहार्यता और साइटोटॉक्सिसिटी परख के लिए उपयोग किए जाते हैं। एमटीटी और सीसीके -8 परख के परिणाम एक-दूसरे के विपरीत हैं और महत्वपूर्ण रूप से सहसंबद्ध नहीं हैं, लेकिन सीसीके -8 परख की सेल व्यवहार्यता एमटीटी परख20 से काफी अलग है। पिछले अध्ययन में एमटीटी परिणामों के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि कोशिका मृत्यु में तेजी लाने को उच्च एमटीटी सांद्रता21 पर प्रेरित किया जा सकता है। सीसीके -8 विधि के प्रयोगात्मक परिणाम आम तौर पर पशु विषाक्तता परीक्षण22 के परिणामों के अनुरूप हैं। इसलिए, जब तक नए साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन विधियां उपलब्ध नहीं होती हैं, तब तक एल 929 कोशिकाओं के लिए ओपी-डी और एनओडी की विषाक्तता का पता लगाने के लिए सीसीके -8 परख का उपयोग शायद वर्तमान में सबसे अच्छा विकल्प है। यह विधि वैक्सीन सामग्री और सहायक मूल्यांकन के क्षेत्र में भी लागू की जाती रहेगी।

प्लीहा मानव शरीर में सबसे बड़ा द्वितीयक लिम्फोइड अंग है, और तिल्ली में भड़काऊ साइटोकिन के स्तर की मात्रा हमें प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया23 को समझने में मदद कर सकती है। यह माना जाता है कि चूहों और मनुष्यों कीतिल्ली के बीच संरचना और सेल प्रकारों में कुछ मूलभूत अंतर हैं, लेकिन विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की बुनियादी समानता और प्लीहा क्षेत्र का कार्य चूहों की तिल्ली टी कोशिकाओं का उपयोग करके अध्ययन को प्रासंगिक बनाताहै। इस प्रोटोकॉल में, हमने एलिसा किट का उपयोग करके तिल्ली में टीएच 1 साइटोकिन आईएफएन -γ और टीएच 17 साइटोकिन आईएल -17 ए के स्रावी स्तर को मापा। इस परख का उपयोग आमतौर पर मात्रात्मक निर्धारण के लिए किया जाता है और इसमें उच्च संवेदनशीलता होती है क्योंकि यह गैर-विशिष्ट पदार्थों को धोने के लिए उच्च-आत्मीयता एंटीबॉडी का उपयोग करता है। इस अध्ययन की मुख्य सीमाएं लंबे समय तक मापने का समय और अभिकर्मकों की उच्च खपत हैं। साइटोकिन्स को फ्लो साइटोमेट्री और ल्यूमिनेक्स विधियों के साथ भी पता लगाया जा सकता है, लेकिन इन विधियों को जटिल उपकरणों के साथ-साथ महंगे कच्चे माल और विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इसलिए, यह सरल और किफायती एलिसा किट विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। ईएलआईस्पॉट विशिष्ट साइटोकिन स्पॉट बनाने वाली कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को निर्धारित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों में से एक बन गया है। इसका उपयोग न केवल वैक्सीन उम्मीदवारों द्वारा प्राप्त सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, बल्कि टीकाकरण के बाद विशिष्ट एंटीजन की पहचान के लिए भी किया जासकता है। उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और एक संवेदनशील पहचान सीमा (1/ 100,000 कोशिकाओं) के साथ, ईएलआईस्पॉट का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि यह कोशिकाओं के प्रत्यक्ष अवलोकन और तेजी से विश्लेषण के फायदे भी प्रदान करता है। प्रत्येक स्थान का गठन व्यक्तिगत टी कोशिकाओं या बी कोशिकाओं के सक्रियण की आवृत्ति को इंगित करता है टीकों और सहायक दवाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का मूल्यांकन बहुत महत्वपूर्ण है जो वर्तमान में ईएलआईस्पॉट को अपूरणीय बनाता है।

डीसी द्वारा एंटीजन की प्रस्तुतिप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने के लिए एक शर्त है। डीसी, जो एंटीजन अपटेक, लिम्फ नोड्स में प्रवास और भोले टी कोशिकाओं के सक्रियण के लिए उपयोग किए जाते हैं, टी सेल-मध्यस्थताप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विकास के लिए आवश्यक सेल प्रकारों में से एक हैं। यह देखते हुए कि कोशिका झिल्ली के साथ नैनोइमल्शन कणों की बातचीत कण अपटेक का एक प्रमुख निर्धारक है, डीसी के भीतर जीएफपी फागोसाइटोसिस इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में सीएलएसएम का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। यह दिखाया गया है कि डीसी लिम्फ नोड्स को निकालने के लिए एंटीजन को कुशलतापूर्वक परिवहन कर सकते हैं, यही कारण है कि सहायक विवो में एंटीजन इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाते हैं। इसके अलावा, सीएलएसएम तकनीक का सबसे आम वाणिज्यिक कार्यान्वयन है और इमेजिंग प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। सीएलएसएम के 3 डी इमेजिंग26 की ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता, स्पष्ट रिज़ॉल्यूशन और बहुमुखी प्रतिभा इसे डीसी द्वारा एंटीजन अपटेक का विश्लेषण करने के लिए सबसे अच्छा उपकरण बनाती है, भले ही इसका उपयोग मात्रात्मक डेटा के संग्रह के लिए नहीं किया जा सके।

एंटीजन की विशिष्ट पहचान के लिए प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी I और II) महत्वपूर्ण है। एमएचसी II कार्यात्मक अणु ओं को एपीआई में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है और सीडी 4 + टी सेल सक्रियण को प्रेरित करने के लिए कार्य करता है। एपीसी में मैक्रोफेज, डीसी और बी लिम्फोसाइट्स27 शामिल हैं, जो अनुकूली प्रतिरक्षा को दृढ़ता से संशोधित करते हैं। मैक्रोफेज व्यापक रूप से मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली में वितरित किए जाते हैं और रक्षा और होमियोस्टेसिस28 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। अनुकूलीप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को शुरू करने के लिए मैक्रोफेज की सक्रियता आवश्यक है। इस बीच, नैनोइमल्शन सहायक जो रोगजनकों के समान आकार के होते हैं, एंटीजन पहचान और फागोसाइटोसिस को बढ़ावा दे सकते हैं, एनएएलपी 3 ज्वलनशीलता और मैक्रोफेज को सक्रिय कर सकते हैं, और एंटीजन प्रस्तुति28 को संशोधित कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, पीएम को मुख्य रूप से एलिसा द्वारा प्रोइंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स आईएल -1 और टीएच 2, साइटोकिन्स आईएल -6 और टीएनएफ -α के स्राव को निर्धारित करने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया गया था, जिसका उपयोग टीकों और सहायक दवाओं की मैक्रोफेज सक्रियण क्षमता का गुणात्मक मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, सक्रियण की डिग्री और तंत्र को अधिक प्रयोगों द्वारा निर्धारित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, क्या ईजीएफ, आईएल -6, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियण के लिए आवश्यक अन्य कारक स्रावित होते हैं और संबंधित सिग्नलिंग मार्ग (जेएके-एसटीएटी, जेएनके, पीआई 3 के-एकेटी, आदि) का अध्ययन करने की आवश्यकता है।

सारांश में, साइटोटॉक्सिसिटी, साइटोकिन स्राव, डीसी अपटेक और मैक्रोफेज सक्रियण सहित नवीन सहायक दवाओं के लिए इन विट्रो सेलुलर प्रतिक्रियाओं की पुष्टि करने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला स्थापित की गई है। ये प्रोटोकॉल न केवल कम विषाक्तता और उच्च सेलुलर वितरण का प्रदर्शन करते हैं, बल्कि सीसीके -8, एलिसा और ईएलआईस्पॉट के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं भी प्रदान करते हैं। प्लांट-व्युत्पन्न इम्यूनोपोटेंटिएटर ओपी-डी और इसके संशोधित शक्तिशाली नैनोइमल्शन वैक्सीन एडजुवेंट एनओडी के सेलुलर प्रतिक्रिया आकलन विट्रो में पूरे किए गए थे, और प्रोटोकॉल प्रभावी था। यद्यपि एलिसा, एलीस्पॉट और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग तकनीकों का उपयोग शास्त्रीय रूप से कोशिकाओं के लिए सहायक दवाओं की इन विट्रो इम्यूनोकॉम्पिटेंसी का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है, इन विधियों के कई नुकसान हैं, जैसे कि लंबे माप का समय, भारी कार्यभार, महंगी सामग्री और पेशेवर तकनीशियनों की आवश्यकता। कई सटीक तरीकों और उन्नत तकनीकों, जैसे जीन चिप्स, एकल-सेल अनुक्रमण, और ट्रांसस्क्रिप्टम तकनीक, का उपयोग तकनीक के दायरे को और विस्तारित करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय या व्यक्तिगत हित नहीं हैं जो इस पेपर में रिपोर्ट किए गए काम को प्रभावित कर सकते थे।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम के अनुदान संख्या 2021वाईएफसी 2302603, अनुदान संख्या 31670938, 32070924, 82041045 और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन कार्यक्रम के 32000651 द्वारा समर्थित किया गया था। आर्मी मेडिकल यूनिवर्सिटी की विशेष परियोजनाओं के अनुदान संख्या 2020एक्सबीके 24, और कॉलेज के छात्रों के लिए राष्ट्रीय नवाचार और उद्यमिता कार्यक्रम के अनुदान संख्या 202090031021।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x) GIBCO, USA 25200056
96-well filter plates Millipore. Billerica, MA CLS3922
AlPO4 General Chemical Company, USA null
Automated Cell Counter Countstar, China IC1000
BALB/c mice and C57BL/6 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd null
caprylic/capric triglyceride (GTCC) Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China null
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Cell Counting Plate Costar, Corning, USA CO010101
Cell Sieve biosharp, China BS-70-CS
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
DMEM basic(1x) medium GIBCO, USA C11885500BT
DSZ5000X Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
EL-35 (Cremophor-35) Mumbai, India null
ELISpot classic AID, Germany ELR06
Fetal Bovine Serum GIBCO, USA 10099141C
Full-function Microplate Reader Thermo Fisher Scientific, USA VL0000D2
GFP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P42212
Glutamax Invitrogen, USA 35050061
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor GM-CSF, R&D Systems, USA 315-03
HEPES Invitrogen, USA 15630106
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland null
IL-4 PeproTech, USA 042149
L929 cell line FENGHUISHENGWU, China  NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462)
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss, Germany LSM 980
MONTANE 85 PPI SEPPIC, France L12910
MONTANOX 80 PPI SEPPIC, France 36372K
Mouse IFN-γ ELISA kit Dakewe, China 1210002
Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit Dakewe, China DKW22-2000-096
Mouse IL-17A ELISA kit Dakewe, China 1211702
Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit ebiosciences, USA 3521-4HPW-2
Mouse IL-1β ELISA kit Dakewe, China 1210122
Mouse IL-6 ELISA kit Dakewe, China 1210602
Mouse TNF-α ELISA kit Dakewe, China 1217202
Non-essential amino acids(100x) Invitrogen, USA 11140050
Ophiopogonin-D Chengdu Purui Technology Co. Ltd 945619-74-9
Penicillin-Streptomycin Solution Invitrogen, USA 15070063
Phalloidin Solarbio, China CA1620
Phosphate Buffered Saline ZSGB-BIO, China ZLI-9062
Red Blood Cell Lysis Buffer Solarbio, China R1010
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology), USA SH30809.01
Sodium pyruvate(100 mM) Invitrogen, USA 11360070
Squalene Sigma, USA S3626
β- Mercaptoethanol Invitrogen, USA 21985023

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 190
<em>इन विट्रो</em> नैनोइमल्शन वैक्सीन एडजुवेंट ओफिओपोगोनिन डी का सेलुलर गतिविधि मूल्यांकन
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