Summary
Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und effiziente Methoden zur Entnahme von Spermien aus dem kleinen Modellfisch Medaka (Oryzias latipes) sowie ein Protokoll zur zuverlässigen Beurteilung der Spermienqualität mittels computergestützter Spermienanalyse (CASA).
Abstract
Der Japanische Medaka (Oryzias latipes) ist ein Teleostfisch und ein aufstrebendes Wirbeltiermodell für Ökotoxikologie, Entwicklungs-, Genetik- und Physiologieforschung. Medaka wird auch ausgiebig verwendet, um die Fortpflanzung von Wirbeltieren zu untersuchen, was eine wesentliche biologische Funktion ist, da sie es einer Art ermöglicht, sich zu verewigen. Die Spermienqualität ist ein wichtiger Indikator für die männliche Fruchtbarkeit und damit für den Fortpflanzungserfolg. Techniken zur Extraktion von Spermien und Spermienanalysen sind für viele Arten, einschließlich Teleostfische, gut dokumentiert. Das Sammeln von Spermien ist bei größeren Fischen relativ einfach, kann aber bei kleinen Modellfischen komplizierter sein, da sie weniger Spermien produzieren und empfindlicher sind. Dieser Artikel beschreibt daher zwei Methoden der Spermienentnahme beim kleinen Modellfisch, der japanischen Medaka: Hodendissektion und Bauchmassage. Diese Arbeit zeigt, dass beide Ansätze für Medaka machbar sind und zeigt, dass die Bauchmassage mehrmals durchgeführt werden kann, da sich die Fische schnell von dem Eingriff erholen. Dieser Artikel beschreibt auch ein Protokoll für die computergestützte Spermienanalyse in Medaka, um mehrere wichtige Indikatoren der Medaka-Spermienqualität objektiv zu bewerten (Motilität, Progressivität, Dauer der Motilität, relative Konzentration). Diese Verfahren, die für dieses nützliche kleine Teleostmodell spezifiziert wurden, werden das Verständnis der umweltbedingten, physiologischen und genetischen Faktoren, die die Fruchtbarkeit bei männlichen Wirbeltieren beeinflussen, erheblich verbessern.
Introduction
Japanischer Medaka ist ein kleiner, eierlegender Süßwasser-Teleostfisch, der in Ostasien beheimatet ist. Medaka hat sich zu einem ausgezeichneten Wirbeltiermodellsystem für Ökotoxikologie, Entwicklungsgenetik, Genomik und evolutionäre Biologie und Physiologie entwickelt 1,2. Ähnlich wie der beliebte Zebrafisch sind sie relativ einfach zu züchten und sehr resistent gegen viele häufige Fischkrankheiten 1,2. Die Verwendung von Medaka als Modell bietet mehrere Vorteile, darunter eine kurze Generationszeit, transparente Embryonen 1,2 und ein sequenziertes Genom3. Im Gegensatz zu Zebrafischen hat Medaka ein geschlechtsbestimmendes Gen 4 sowie eine hohe Temperatur- (von4-40 °C) und Salzgehaltstoleranz (Euryhaline-Arten)5. Auch viele genetische und anatomische Werkzeuge sowie die Protokolle 6,7,8,9,10,11,12 wurden in Medaka entwickelt, um das Studium seiner Biologie zu erleichtern.
Fortpflanzung ist eine wesentliche physiologische Funktion, da sie es einer Spezies ermöglicht, sich zu verewigen. Die Fortpflanzung von Wirbeltieren erfordert eine Vielzahl von genau orchestrierten Ereignissen, einschließlich der Produktion von Eizellen bei Frauen und der Produktion von Spermien bei Männern. Spermien sind einzigartige Zellen, die durch den komplexen Prozess der Spermatogenese hergestellt werden, in denen es eine Reihe von Kontrollpunkten gibt, um die Lieferung eines hochwertigen Produkts zu gewährleisten13. Die Gametenqualität ist aufgrund ihrer Auswirkungen auf den Befruchtungserfolg und das Überleben der Larven zu einem Schwerpunkt in Aquakultur- und Fischpopulationsstudien geworden. Die Spermienqualität ist daher ein wichtiger Indikator für die männliche Fruchtbarkeit bei Wirbeltieren.
Drei nützliche Faktoren zur Beurteilung der Qualität von Fischspermien sind Motilität, Progressivität und Langlebigkeit. Prozentuale Motilität und progressive Motilität sind häufige Indikatoren für die Spermienqualität, da progressive Bewegung notwendig ist und stark mit dem Befruchtungserfolg korreliert14,15. Die Dauer der Bewegung ist auch ein wichtiger Indikator bei Fischen, da die Spermien bei den meisten Teleostarten weniger als 2 Minuten lang voll beweglich bleiben und die Flugbahn der Spermien im Allgemeinen weniger linear ist als bei Säugetieren15. Viele Studien, die die Spermienmotilität in der Vergangenheit bewerteten, stützten sich jedoch auf subjektive oder semiquantitative Methoden zur Analyse von Spermien15,16. Zum Beispiel wurde die Spermienmotilität in Medaka in der Vergangenheit visuell unter einem Mikroskop geschätzt17. Es wurde auch geschätzt, indem die Bewegung der Spermien aufgezeichnet und Bildgebungssoftware verwendet wurde, um Rahmen zusammenzuführen und den Schwimmweg und die Geschwindigkeit zu messen18,19,20. Solchen Ansätzen mangelt es oft an Robustheit und liefert je nach Person, die die Analyse durchführt, unterschiedliche Ergebnisse15,21.
Die computergestützte Spermienanalyse (CASA) wurde ursprünglich für Säugetiere entwickelt. CASA ist eine schnelle quantitative Methode zur Beurteilung der Spermienqualität durch automatisierte Aufzeichnung und Messung von Geschwindigkeit und Flugbahn15. Bei Fischen wurde es bei verschiedenen Arten eingesetzt, um die Auswirkungen mehrerer Wasserschadstoffe auf die Spermienqualität zu überwachen, interessante Vorläufer zur Verbesserung des Brutbestands zu identifizieren, die Effizienz der Kryokonservierung und -lagerung zu verbessern und die Bedingungen für die Befruchtung zu optimieren15. Daher ist es ein leistungsfähiges Werkzeug zur zuverlässigen Beurteilung der Spermienqualität bei verschiedenen Wirbeltierarten. Aufgrund der großen Vielfalt der Fortpflanzungsstrategien zwischen den Fischen unterscheidet sich das Sperma von Teleostfischen jedoch von dem von Säugetieren und von einer Fischart zur anderen. Teleostfische, die Eier hauptsächlich äußerlich befruchten, indem sie Gameten ins Wasser abgeben, haben hochkonzentrierte Spermien, die relativ einfach in der Struktur ohne Akrosom sind, im Gegensatz zu Säugetieren, die intern düngen und daher die Verdünnung in Wasser nicht kompensieren müssen, sondern viskoseren Flüssigkeiten standhaltenmüssen 14. Darüber hinaus bewegen sich die Spermien der meisten Fische schnell, sind aber für weniger als 2 Minuten nach der Aktivierung vollständig beweglich, obwohl es mehrere Ausnahmengibt 15,22. Da die Motilität bei den meisten Fischen schnell abnehmen kann, sollte bei der Festlegung eines Spermienanalyseprotokolls für Fische äußerste Vorsicht beim Zeitpunkt der Analyse nach der Aktivierung geboten sein.
Die Fortpflanzung ist eines der Gebiete in der Biologie, in denen Teleosts und Medaka ausgiebig als Modellorganismen eingesetzt wurden. In der Tat zeigen Medaka-Männchen interessante reproduktive und soziale Verhaltensweisen, wie z.B. Mate Guarding23,24. Darüber hinaus existieren mehrere transgene Linien, um die neuroendokrine Kontrolle der Fortpflanzung bei dieser Spezieszu untersuchen 25,26,27. Die Spermienprobenahme, ein Verfahren, das bei größeren Fischen relativ einfach ist, kann bei kleinen Modellfischen komplizierter sein, da sie weniger Spermien produzieren und empfindlicher sind. Aus diesem Grund extrahieren die meisten Studien mit Spermienentnahme in Medaka Milz (Fischsamen) durch Zerkleinern von sezierten Hoden 17,28,29,30. Einige Studien verwenden auch eine modifizierte Bauchmassage, um die Milz direkt in das aktivierende Medium18,19,20 auszudrücken; Mit dieser Methode ist es jedoch schwierig, die Menge und Farbe der extrahierten Milz zu visualisieren. Bei Zebrafischen wird die Bauchmassage häufig verwendet, um Milz auszudrücken, die sofort in einem Kapillarrohr31,32,33 gesammelt wird. Diese Methode ermöglicht die Abschätzung des Milzvolumens sowie die Beobachtung der Ejakulatfarbe, die ein schneller und einfacher Indikator für die Spermienqualitätist 32,33. Daher fehlt für Medaka ein klares und gut beschriebenes Protokoll für die Spermienentnahme und -analyse.
Dieser Artikel beschreibt daher zwei Methoden der Spermiengewinnung im kleinen Modellfisch Japanese Medaka: Hodendissektion und Bauchmassage mit Kapillarschläuchen. Es zeigt, dass beide Ansätze für Medaka machbar sind und zeigt, dass die Bauchmassage mehrmals durchgeführt werden kann, da sich der Fisch schnell von dem Eingriff erholt. Es beschreibt auch ein Protokoll für die computergestützte Spermienanalyse in Medaka, um mehrere wichtige Indikatoren der Medaka-Spermienqualität (Motilität, Progressivität, Langlebigkeit und relative Spermienkonzentration) zuverlässig zu messen. Diese Verfahren, die für dieses nützliche kleine Teleostmodell spezifiziert wurden, werden das Verständnis der umweltbedingten, physiologischen und genetischen Faktoren, die die Fruchtbarkeit bei männlichen Wirbeltieren beeinflussen, erheblich verbessern.
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Protocol
Alle Experimente und der Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen zum experimentellen Tierschutz an der Norwegischen Universität für Biowissenschaften (NMBU) durchgeführt. Die Experimente wurden mit erwachsenen (6-9 Monate alten) männlichen japanischen Medaka (Hd-rR-Stamm) durchgeführt, die am NMBU (Ås, Norwegen) aufgezogen wurden. Die Methoden wurden auch kurz an 9 Monate alten männlichen japanischen Medaka (CAB-Stamm) getestet, die am Nationalen Forschungsinstitut für Landwirtschaft, Ernährung und Umwelt (INRAE, Rennes, Frankreich) aufgezogen wurden.
1. Geräte- und Lösungsvorbereitung
- Anästhesie-Stammlösung (0,6% Tricain) vorbereiten.
- Verdünnen Sie 0,6 g Tricain (MS-222) in 100 ml 10x Phosphatpuffersalzlösung (PBS).
- Aliquot 2 mL der Anästhesie-Stammlösung in 50 2 mL Kunststoffröhrchen und bei -20 °C bis zur Verwendung zur Anästhesie oder Euthanasie lagern.
- Bereiten Sie Rückgewinnungswasser (0,9% Natriumchlorid [NaCl] -Lösung) vor.
- 27 g NaCl in 3 L Aquarienwasser geben.
- Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei Raumtemperatur (RT).
- Stellen Sie ggf. das Aktivierungsmedium ein (Hanks ausgewogene Salzlösung [HBSS]).
HINWEIS: HBSS kann kommerziell erworben oder im Labor hergestellt werden (Materialtabelle).- Messen Sie den pH-Wert des HBSS mit einem pH-Meter. Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit Salzsäure oder Natriumhydroxid ein, so dass der endgültige pH-Wert 7,1-7,3 beträgt.
- Messen Sie die Osmolalität des HBSS mit einem Osmometer für zukünftige Berichte.
HINWEIS: Der Bereich des kommerziellen Produkts beträgt 266-294 mOsmol / kg; in der aktuellen Studie betrug die Osmolalität 287 mOsmol/kg. Es kann mit destilliertem Wasser verdünnt werden, um die Osmolalität zu reduzieren, falls gewünscht, aber dies ist nicht notwendig, da es keinen großen Unterschied in der Aktivierung von Medaka-Spermien in 150-300 mOsmol / kg HBSS gibt. - Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung bei RT.
- Bereiten Sie den Halteschwamm vor.
- Schneiden Sie einen weichen Schwamm so ab, dass er eng in eine Petrischale passt.
- Schneiden Sie eine gerade Linie in die Mitte des Schwamms, die lang genug ist, um den Fisch aufzunehmen (3-4 cm) und etwa 1 cm tief ist (Abbildung 1A). Dieser Schlitz im Schwamm hält die Fischseite ventral nach oben, um die Kloake freizulegen.
2. Samenentnahme
HINWEIS: Die Spermienentnahme kann durch zwei verschiedene Methoden erreicht werden: Bauchmassage oder Hodendissektion.
- Samenentnahme durch Bauchmassage
- Bereiten Sie eine 0,03% ige Anästhesielösung vor, indem Sie ein Röhrchen Tricainbrühe (0,6%) in 38 ml Aquarienwasser in einem 100-ml-Glasbehälter verdünnen.
- Bereiten Sie die Instrumente vor, einschließlich einer glatten stumpfen Pinzette und einer kalibrierten 10-μL-Einweg-Glasmikropipette und einer Ansaugröhre (Abbildung 1A). Befeuchten Sie den in Schritt 1.4 vorbereiteten Halteschwamm mit der Narkoselösung.
- Röhrchen mit 36 μL der aktivierenden Lösung für die sofortige Analyse vorbereiten. Die aktivierende Lösung in einem auf 27 °C eingestellten Wasserbad oder Inkubator für mindestens 5 min vorheizen.
HINWEIS: Obwohl Proben von einzelnen Fischen analysiert werden können, kann die individuelle Variation reduziert werden, indem Proben von mehreren männlichen Tieren in derselben aktivierenden Lösung zusammengefasst werden. Wenn Sie Proben von mehreren Fischen poolen, verwenden Sie 36 μL Aktivierungslösung pro Fisch. Diese Verdünnung muss möglicherweise abhängig von der Belastung oder den Aufzuchtbedingungen des verwendeten Medaka angepasst werden, da diese Faktoren die Spermienkonzentration und das Volumen beeinflussen können. Das CASA-Programm zeigt an, ob die Konzentration zu hoch ist, um Spermien zu identifizieren. - Betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn für 30-90 s in eine Betäubungslösung geben.
HINWEIS: Die Anästhesiedauer muss angepasst werden, da sie je nach Größe des Fisches variiert. Um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig betäubt ist, kneifen Sie den Schwanzstiel vorsichtig mit einer Pinzette. Wenn der Fisch nicht reagiert, kann die Massage gestartet werden. - Nehmen Sie den Fisch aus der Anästhesielösung und verwenden Sie ein Papiertuch oder wischen Sie vorsichtig ab, um den Bauch des Fisches zu trocknen. Legen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben in den Trog des feuchten Schwamms, so dass seine Kiemen der Anästhesielösung im Schwamm ausgesetzt sind (Abbildung 1B).
- Wenn der Bereich um die Kloake nass ist, trocknen Sie die Unterseite des Fisches vorsichtig mit einem Einwegtuchtuch.
- Legen Sie den Fisch in den Halteschwamm unter ein Seziermikroskop und legen Sie die Mikropipette mit einem Ansaugrohr gegen die Kloake des Fisches (Abbildung 1C).
- Massieren Sie den Bauch des Fisches, indem Sie ihn sanft mit einer stumpfen glatten Pinzette in einer rostralen bis kaudalen Bewegung zusammendrücken und gleichzeitig saugen, um die ausgestoßene Milz in die Pipette zu sammeln (Abbildung 1D).
- Lassen Sie die Fische vom Schwamm in das Erholungswasser fallen. Lassen Sie sie mindestens 15 Minuten in der Lösung erholen, bevor Sie sie in das Aquariensystem zurückbringen.
- Die Milz in ein vorbereitetes Röhrchen mit vorgewärmter Aktivierungslösung geben und mehrmals durch Saugen und Blasen am Absaugrohr auf und ab pipettieren.
- Homogenisieren Sie das verdünnte Sperma vorsichtig, indem Sie die Röhrchen vor der Analyse schnippen.
HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, analysieren Sie die Proben sofort (z. B. 5 s) nach der Aktivierung. Bei Medaka kann sich die Analyse gegebenenfalls verzögern, da die Spermien mehrere Stunden beweglich bleiben, aber die Zeit zwischen den Proben sollte konsistent bleiben, da die Motilität mit der Zeit abnimmt.
- Spermienentnahme durch Hodendissektion
- Bereiten Sie 0,08% ige Euthanasielösung vor, indem Sie zwei Röhrchen Tricainbrühe (0,6%) in 26 ml Aquarienwasser in einem 100 ml Glasbehälter verdünnen.
- Bereiten Sie Dissektionswerkzeuge vor, einschließlich stumpfer und feiner Pinzetten und kleiner Sezierscheren (Abbildung 1E).
- Bereiten Sie für jede Probe ein Röhrchen mit 120 μL Aktivierungslösung für die sofortige Analyse vor. Die aktivierende Lösung in einem auf 27 °C eingestellten Wasserbad oder Inkubator für mindestens 5 min vorheizen.
HINWEIS: Obwohl Proben von einzelnen Fischen analysiert werden können, kann die individuelle Variation reduziert werden, indem Proben von mehreren männlichen Tieren in derselben aktivierenden Lösung zusammengefasst werden. Verwenden Sie für die Pooling-Proben von mehreren Fischen 120 μL Aktivierungslösung pro Fisch. Diese Verdünnung muss möglicherweise abhängig von der Belastung oder den Aufzuchtbedingungen des verwendeten Medaka angepasst werden, da diese Faktoren die Spermienkonzentration und das Volumen beeinflussen können. Das CASA-Programm zeigt an, ob die Konzentration zu hoch ist, um Spermien zu identifizieren. - Euthanasieren Sie den Fisch, indem Sie ihn für 30-90 s in die 0,08% ige Anästhesielösung geben.
HINWEIS: Die Dauer hängt von der Größe des Fisches ab. Um sicherzustellen, dass der Fisch eingeschläfert wird, warten Sie, bis die Bewegungen des Operculums aufhören. Der Fisch sollte nicht auf die Berührung einer Pinzette reagieren. - Entfernen Sie den Fisch aus der Euthanasielösung und trocknen Sie den Fisch vorsichtig mit einem Papiertuch oder wischen Sie ihn vorsichtig ab.
HINWEIS: In diesem Schritt können die Fische gewogen werden, um später den gonadosomatischen Index (GSI, Gonadengewicht / Körpergewicht) zu berechnen. - Legen Sie den Fisch mit der linken seitlichen Seite nach oben unter ein Seziermikroskop (Abbildung 1F).
- Schneiden Sie mit einer kleinen Sezierschere einen Lappen dorsal von der Kloake ab und dann über die Rippen zu den Kiemen, um die inneren Organe freizulegen (Abbildung 1G).
- Suchen Sie die Hoden, schneiden Sie den Aufsatz an beiden Enden mit einer feinen Pinzette ab, und entfernen Sie die Hoden (Abbildung 1H).
HINWEIS: Zur Berechnung des GSI können die Hoden in diesem Schritt gewogen werden. Arbeiten Sie schnell, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden. - Die Hoden mit der vorgewärmten Aktivierungslösung in ein vorbereitetes Röhrchen geben.
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Hoden mehrmals gegen die Seite der Röhre zu drücken, um das Sperma freizusetzen. Die Spermienfreisetzung kann normalerweise visualisiert werden und macht die Lösung leicht trüb.
- Homogenisieren Sie das verdünnte Sperma vorsichtig, indem Sie die Röhrchen vor der Analyse schnippen.
HINWEIS: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, analysieren Sie die Proben sofort (z. B. 5 s) nach der Aktivierung. Bei Medaka kann sich die Analyse gegebenenfalls verzögern, da die Spermien mehrere Stunden beweglich bleiben, aber die Zeit zwischen den Proben sollte konsistent bleiben, da die Motilität mit der Zeit abnimmt.
Abbildung 1: Milzentnahme durch Bauchmassage (A-D) und Hodendissektion (E-H). (A) Instrumente für die Bauchmassage: Halteschwamm, stumpfe glatte Pinzette und 10 μL Einweg-kalibrierte Glasmikropipette mit Absaugrohranordnung; (B) Position der Fische im Haltungsschwamm, wobei die Betäubungskiemen im Schwamm und in der Kloake nach oben zeigen; (C) Position der stumpfen glatten Pinzette auf dem Bauch und Mikropipette gegen Kloake; (D) Milzen in Mikropipette nach sanfter Massage und Saugen. (E) Instrumente zur Hodendissektion: stumpfe Pinzetten, feine Pinzetten und kleine Sezierscheren; (F) Position der Fische für die Hodendissektion; (G) Seitenansicht der inneren Organe; (H) Entfernen Sie die Hoden, indem Sie den Aufsatz an beiden Enden mit einer feinen Pinzette schneiden. Maßstabsleiste: 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Spermienanalyse mit CASA-System
- Das CASA-System (SCA Evolution) sollte gemäß Handbuch mit einem Mikroskop mit grünem Filter und 10x-Objektiv mit Phasenkontrast eingerichtet werden.
- Bereiten Sie Einweg-20 μm Zählkammerobjektträger durch Vorwärmen auf einer Wärmeplatte oder in einem auf 27 °C eingestellten Inkubator für mindestens 5 min vor.
- Öffnen Sie die Spermienanalyse-Software und wählen Sie das Motilitätsmodul.
- Legen Sie die Konfiguration für die Medaka fest, wie in Abbildung 2B dargestellt.
- Legen Sie einen vorgewärmten Einweg-20 μm Zählkammerobjektträger unter das Mikroskop auf einen auf 27 °C eingestellten Heiztisch.
- Pipettieren Sie die Probe in die Kammer auf dem Objektträger, bis sie die Kammer ohne Überfüllung füllt. Wischen Sie überschüssige Proben vorsichtig mit einer Baumwollspitze vom Eingang der Kammer ab oder wischen Sie vorsichtig ab, um schwimmende Zellen zu vermeiden.
- Wählen Sie Analysieren , um die Probe unter dem Mikroskop zu betrachten.
HINWEIS: Wenn das Mikroskopsymbol rot ist, muss die Mikroskopbeleuchtung angepasst werden, damit das Programm Spermien genau verfolgt. Stellen Sie die Helligkeit des Mikroskops so ein, dass die Schwanzbewegung der Spermien deutlich zu sehen ist. Das Symbol sollte blau sein. - Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop fokussiert ist, und wählen Sie erneut Analysieren , um die Spermien im Feld aufzuzeichnen. Verschieben Sie die Folie so, dass sich ein neuer Bereich der Probe im Rahmen befindet, und wiederholen Sie den Vorgang für 3-5 verschiedene Sichtfelder. Vermeiden Sie Felder mit Luftblasen, Zellmassen oder Artefakten.
- Wählen Sie Ergebnisse aus, um die Ergebnisse anzuzeigen.
HINWEIS: Wenn die Felder auf der Ergebnisseite rot umrandet sind, folgen Sie den Anweisungen des Systems, um die Felder zu löschen, die sich zu sehr in Konzentration oder Motilität unterscheiden. - Doppelklicken Sie auf ein Feld, um die Ergebnisse für das einzelne Feld anzuzeigen oder manuell nach falsch beschrifteten oder nicht verfolgten Spermatozoen zu suchen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf einzelne Spermatozoen, um die Motilität bei Bedarf neu zu kennzeichnen (Abbildung 2A).
Abbildung 2: Screenshot der SCA Evolution-Software . (A) Ergebnisse der Spermienverfolgung für ein Feld. Zeigen Sie Felddaten auf der rechten Seite an und doppelklicken Sie auf Spermatozoen, um einzelne Daten anzuzeigen. (B) Ergebnisübersicht für alle Felder mit geöffnetem Konfigurationsmenü. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
Art der erhaltenen Daten
Die Spermienmotilitätsanalyse der SCA Evolution-Software liefert Daten zur Motilität (Prozentsatz der beweglichen und unbeweglichen Spermien) sowie zur Progressivität (Prozentsatz der progressiven und nicht progressiven Spermien) und zur Geschwindigkeit (Prozentsatz der schnellen, mittleren und langsam beweglichen Spermien). Es kombiniert auch Progressivität und Geschwindigkeit (schnell progressiv, mittel progressiv, nicht progressiv). Diese Bezeichnungen basieren auf Messungen (Abbildung 3A) und Berechnungen (Abb. 3B) der Spermatozoenbewegung, die vom Programm bereitgestellt werden (Zusatztabelle 1). Für Medaka wurden die folgenden Schwellenwerte aus den empfohlenen Zebrafischparametern basierend auf der vorherigen Literatur 19,34,35 und der Verteilung von Medaka-Daten von18 Individuen angepasst. Die Motilität basiert auf der Kurvengeschwindigkeit (VCL) mit unbeweglichen < 10 μm/s ≤ langsamen < 20 μm/s ≤ mittleren ≤ 40 μm/s < schnell. Spermien gelten als progressiv, wenn der Geradheitsindex (STR) > 68% beträgt.
SCA Evolution berechnet auch die Konzentration der Spermien, wenn das Volumen der Probe und die Verdünnung zur Verfügung gestellt werden. Während die Bauchmassagemethode hilfreich ist, um die Färbung zu visualisieren und das Vorhandensein der Milz zu bestätigen, ist das gesammelte Volumen zu klein, um genau gemessen zu werden. Wenn das Milzvolumen durch Aufzuchtbedingungen oder die Verwendung eines anderen Stammes verbessert wird und gemessen werden kann, kann das Programm zur Berechnung der Konzentration verwendet werden. Die relative Konzentration kann jedoch auch berechnet werden, um Fische oder Behandlungsgruppen für Proben zu vergleichen, die durch Hodendissektion entnommen wurden, solange der gesamte Hoden seziert und im gleichen Flüssigkeitsvolumen verdünnt wird.
Abbildung 3: Analyse der Bewegung der Spermatozoen. (A) Die vom CASA-System aufgezeichneten Daten umfassen die krummlinige Geschwindigkeit (VCL, die anhand der Entfernung entlang der tatsächlichen Wegstrecke berechnete Geschwindigkeit), die durchschnittliche Weggeschwindigkeit (VAP, die Geschwindigkeit berechnet anhand der Entfernung des durchschnittlichen Pfades), die geradlinige Geschwindigkeit (VSL, die anhand der Entfernung zwischen Beginn und Ende der Samenspur berechnet wird), Amplitude der lateralen Kopfverschiebung (ALH, Größe der lateralen Verschiebung eines Spermienkopfes um seinen durchschnittlichen Weg), Beat-Kreuzfrequenz (BCF, Rate, mit der der krummlinige Weg den durchschnittlichen Weg kreuzt); (B) Berechnete Werte aus dem CASA-System umfassen Geradheitsindex (STR, Linearität des durchschnittlichen Pfades), Linearitätsindex (LIN, Linearität des krummlinigen Pfades) und Wobble (WOB, Oszillation des tatsächlichen Weges um den Durchschnittspfad). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Bewertung der Spermienmotilität: Verschiedene aktivierende Lösungen
Überraschenderweise waren die Spermien, die sowohl durch Bauchmassage als auch durch Hodendissektion entnommen wurden, im Aquarienwasser (16 mOsmol/kg) (Abbildung 4A) und im mit NaCl-Lösung auf 34 mOsmol/kg eingestellten Aquarienwasser unbeweglich. Es gab auch keine Motilität in deionisiertem Wasser (-1 mOsmol / kg) oder deionisiertem Wasser, das auf 23 mOsmol / kg eingestellt wurde. Die Spermien waren beweglich in HBSS (287 mOsmol/kg) (Abbildung 4B) sowie in HBSS, verdünnt mit deionisiertem Wasser auf 36 mOsmol/kg und 113 mOsmol/kg, obwohl die prozentuale Motilität bei 36 mOsmol/kg signifikant reduziert war (Abbildung 4C).
Abbildung 4: Motilität durch Osmolalität der aktivierenden Lösung. Spermien, die durch Hodendissektion in (A) Aquarienwasser (16 mOsmol/kg) und (B) unadjustiertem HBSS (287 mOsmol/kg) entnommen wurden. Gelbe Kreise kennzeichnen unbewegliche Spermien und farbige Linien zeigen die Spermienbewegung an: rot (schnell progressiv), grün (mittel progressiv), blau (nicht progressiv). Maßstabsbalken: 100 μm. (C)Spermienmotilität aktiviert mit HBSS bei 36, 113 und 287 mOsmol/kgH2O. Für 36 und 113 gilt n = 4 mit zwei Fischen pro Probe. Für 287 gilt n = 9 mit zwei Fischen pro Probe. Statistische Analysen wurden unter Verwendung einer ANOVA mit Tukey Post-hoc-Test durchgeführt und signifikante Unterschiede werden durch verschiedene Buchstaben angezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Probenahmemethoden: Bauchmassage versus Hodendissektion
Spermien, die durch Hodendissektion entnommen werden, sind im Vergleich zu Bauchmassageproben desselben Fisches signifikant beweglicher (Abbildung 5A). Von den beweglichen Spermien ist ein höherer Prozentsatz auch progressiv und mittel- oder schnellbewegend. Bei Spermien, die durch Bauchmassage entnommen werden, bewegen sich beweglichere Spermien langsam und nicht progressiv (Abbildung 5B-C). Unterschiedliche Ergebnisse können jedoch durch Verwendung eines anderen Medaka-Stammes (CAB) oder alternativer Aufzuchtbedingungen erzielt werden (Zusatztabelle 2).
Abbildung 5: Bauchmassage versus Hodendissektion. Prozentsatz der (A) unbeweglichen und beweglichen Spermien, die durch Bauchmassage oder Hodendissektion entnommen wurden. Prozentsatz der beweglichen Spermien, die (B) nicht progressive und progressive Spermien und (C) langsam, mittel und schnell bewegend sind. Alle Spermienproben wurden in HBSS aktiviert (287 mOsmol/kgH2O). Statistische Analysen wurden mit einem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt und signifikante Unterschiede werden durch Sternchen angezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt, n = 9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Motilitätsdauer je nach Lagerbedingung
Spermien, die durch Hodendissektion entnommen und bei 27 °C gehalten wurden, hatten in den ersten 30 Minuten nach der Aktivierung eine 50%ige Verringerung der Motilität. Nach 2,5 h waren weniger als 5% der Spermien beweglich. Bei Lagerung bei 4 °C wurde die Motilität in den ersten 30 Minuten nur um 14% reduziert, und es dauerte 5 Stunden, um eine 50%ige Reduktion gegenüber der ursprünglichen Motilität zu sehen. Eis hatte eine ähnliche dehnende Wirkung, war aber weniger effektiv, mit einer Motilitätsreduktion von 26% in den ersten 30 Minuten (Abbildung 6A). Die Progressivität sank ebenfalls um 52% in den ersten 30 Minuten auf Eis, verglichen mit 65% bei 27 °C und 33% bei 4 °C (Abbildung 6B). Sowohl auf Eis als auch bei 4 °C bewegten sich einige Spermien (<3%) noch 42 h nach der Aktivierung.
Abbildung 6: Langlebigkeit der Spermien je nach Lagerbedingung. Prozent (A) Motilität und (B) Progressivität über die Zeit für Proben, die mit HBSS (287 mOsmol/kgH2O) aktiviert und bei 27 °C, 4 °C oder auf Eis gelagert werden. Die Datenpunkte sind Mittelwert ± SEM, n = ≥4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Bedeutung der Umwelt- und Wohnbedingungen
Männchen, die gemeinsam mit Weibchen untergebracht waren, wurden morgens durch Hodendissektion beprobt, bevor sie die Möglichkeit zum Laichen hatten (bevor die Lichter eingeschaltet wurden) oder nachdem die Lichter eingeschaltet waren und Weibchen im Tank Eier hatten. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Beweglichkeit der Spermien. Männer, die einen Monat lang ohne Weibchen untergebracht waren, wurden ebenfalls untersucht, und obwohl es einen Trend zu höherer Beweglichkeit gab, war der Unterschied ebenfalls nicht signifikant (Abbildung 7).
Als jedoch der CAB-Stamm Medaka in einer anderen Einrichtung aufgezogen wurde, wobei Männchen für mindestens einen Monat von Weibchen getrennt waren, waren die Fische größer und 5-7 μL Milz wurden durch Bauchmassage gesammelt. Proben, die von fünf Fischen durch Bauchmassage entnommen wurden, hatten eine Motilität von 68,34%, wenn sie mit 300 mOsmol/kg HBSS aktiviert wurden. Unter den gleichen Bedingungen, aber mit Weibchen, betrug das Volumen der gesammelten Milz etwa 2 μL, und die durchschnittliche Motilität betrug 46,2% von drei Männchen (Zusatztabelle 2).
Abbildung 7. Einfluss der Umweltbedingungen auf die Beweglichkeit der Spermien. Prozentuale Motilität der Spermien, die vor (n = 5) und nach dem Laichen (n = 4) von Männchen entnommen wurden, die zusammen mit Weibchen untergebracht waren, und Spermien von Männchen, die ohne Weibchen untergebracht waren (n = 6). Alle Proben wurden durch Hodendissektion entnommen und mit HBSS (287 mOsmol/kgH2O) aktiviert. Statistische Analysen wurden mit Hilfe von t-Tests durchgeführt und die Unterschiede waren nicht signifikant. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM mit Kreisen dargestellt, die einzelne Fische darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Tabelle 1: Mittlere Geschwindigkeits- und Bewegungsberechnungen für Spermien, die durch Bauchmassage und Hodendissektion entnommen wurden (n = 9). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Spermienanalysedaten des CAB-Stammes (auch Carbio genannt) Medaka, der bei INRAE in Rennes, Frankreich, aufgezogen wurde. Alle Proben wurden in 300 mOsmol/kg HBSS aktiviert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Osmolalität ist ein wichtiger Faktor bei der Aktivierung von Fischspermien36,37. Im Allgemeinen sind Spermien in den Hoden unbeweglich und werden beweglich in Medien, die im Verhältnis zur Samenflüssigkeit für Meeresfische hyperosmotisch und bei Süßwasserfischen hypoosmotisch relativ zur Samenflüssigkeit sind37. Ähnlich wie Blut ist das Samenplasma bei Süßwasserfischen typischerweise niedriger als bei Meeresfischen (etwa 300 mOsmol/kg im Vergleich zu 400 mOsmol/kg)22,37. So wird Fischsperma normalerweise bei Kontakt mit dem Wasser, in dem sie leben, aktiviert, und dieses Wasser dient als das beste und biologischste Aktivierungsmedium für die Spermienanalyse. Medaka-Spermien, die durch Bauchmassage und Hodendissektion entnommen wurden, waren jedoch nicht beweglich im Aquarienwasser (Abbildung 4A) in Hd-rR- oder CAB-Stamm Medaka, der in zwei verschiedenen Labors aufgezogen wurde. Darüber hinaus war die Motilität bei 287 mOsmol/kg HBSS höher als bei 36 mOsmol/kg HBSS (Abbildung 4C), was für einen Süßwasserfisch ungewöhnlich ist.
Die meisten früheren Studien mit Spermienanalyse in Medaka verwendeten HBSS 28,29,38 oder Yamamoto-Lösung 18,19 als aktivierende Medien für Medaka-Spermien, ohne die Osmolalität zu diskutieren. Während HBSS ein gutes aktivierendes Medium für Medaka-Spermien ist, kann die Variation der Osmolalität die Motilität beeinflussen. Daher ist es für Spermienanalysestudien unerlässlich, die Osmolalität ihrer aktivierenden Lösung für den Vergleich zwischen Experimenten offenzulegen. Eine Studie, die die ideale Osmolalität des aktivierenden Mediums untersuchte, ergab, dass Medaka-Spermien in entionisiertem Wasser (25 mOsmol / kg) und HBSS mit Osmolalitätswerten < 686 mOsmol / kg beweglich sind, mit der höchsten Motilität zwischen 25 und 227 mOsmol / kg17. In der aktuellen Studie waren Spermien jedoch auch in entionisiertem Wasser nicht beweglich. Als Euryhaline-Fisch sind Medaka sehr anpassungsfähig an verschiedene Umgebungen und können sogar in Salzwasser leben und sich fortpflanzen39, so dass es möglich ist, dass unterschiedliche Aufzuchtbedingungen für diese Diskrepanz verantwortlich sind. Interessanterweise haben keine anderen Studien berichtet, dass Medaka-Spermienmotilität in Aquarienwasser (oder ähnlichem, wie gealtertem Leitungswasser) getestet wurde, obwohl es das Standard-Spermienaktivierungsmedium für Süßwasserfische ist.
Eine mögliche Erklärung für diese atypische Spermienaktivierung bei Medaka ist die Wechselwirkung mit der Eierstockflüssigkeit. Während Fischsperma normalerweise im umgebenden Wasser aktiviert wird, erhöht oder verlängert die Eierstockflüssigkeit bei vielen Arten die Dauer der Spermienmotilität40,41. Obwohl Medaka Süßwasserfische von außen befruchten, bringt ihr Laichverhalten, das Flossenwickeln und Zittern beinhaltet, sie viel näher als Broadcast-Laicher23. Da die Osmolalität der Eierstockflüssigkeit bei Süßwasserfischen (ca. 300 mOsmol/kg) nahe an HBSS40 liegt, ist es möglich, dass die vom Weibchen freigesetzte Flüssigkeit das Sperma und nicht das Aquarienwasser aktiviert. Da die Osmolalität von Samen- und Eierstockplasma ähnlich sind, ist es möglich, dass die ionische Zusammensetzung der Medaka-Ovarialflüssigkeit eine wichtige Rolle spielt40,42. Die Rolle von Eierstockflüssigkeit und Ionen bei der Aktivierung von Medaka-Spermien erfordert weitere Untersuchungen.
In früheren Studien wurden Medaka-Spermien nur durch Zerkleinern der sezierten Hoden 17,28,29,30 oder durch Bauchmassage gesammelt, um die Milz direkt in das aktivierende Medium 18,19,20 zu exprimieren; Keine Studien haben Daten mit Spermien berichtet, die durch Bauchmassage in ein Kapillarrohr gesammelt wurden, obwohl dies bei Zebrafischen und anderen Teleostfischen üblich ist 33,43,44. Diese Methode ist auch in Medaka möglich. Milt kann leicht im Kapillarrohr visualisiert werden, und obwohl das Volumen zu klein ist, um genau gemessen zu werden, ermöglicht diese Methode die Bestätigung der erfolgreichen Erfassung und Analyse von Farbe als schneller Qualitätsindikator32. Auch die Vermeidung fäkaler Verunreinigungen ist bei der Entnahme in einem Kapillarrohr einfacher als bei einem Medium. Obwohl Spermaproben, die durch Hodendissektion gesammelt werden, eine bessere Motilität in Medaka aufweisen als Proben, die durch Bauchmassage gesammelt werden (Abbildung 5) und daher für Experimente vorzuziehen sind, in denen der Fisch geopfert werden kann, ist die Bauchmassage ein minimalinvasives Verfahren, das keine Euthanasie erfordert und bei demselben Fisch wiederholt werden kann. Daher ist es nützlich für Experimente, die den gleichen Fischen im Laufe der Zeit folgen. Außerdem enthalten Proben, die mit Bauchmassage entnommen wurden, nur reife Zellen, die mit Samenplasma44 freigesetzt werden, während Proben aus der Hodendissektion unreife Samenzellen und andere Trümmer enthalten können. Das CASA-System diskontiert runde Zellen und Ablagerungen, die größer als die maximale Fläche sind, aber wenn dieser Parameter zu hoch eingestellt ist, können die Motilitätsergebnisse beeinträchtigt werden.
Aufgrund der geringen Menge an Spermien, die mit der Bauchmassagetechnik in diesen Medaka gesammelt wurden, war es unmöglich, das Spermienvolumen in der Kapillare genau zu messen und somit die Spermienkonzentrationen mit regelmäßigen Ansätzen zu berechnen. Für Proben, die durch Hodendissektion entnommen werden, kann jedoch durch Konstanthalten des Aktivierungsmediums und Wiegen der Hoden eine relative Konzentration auf der Grundlage der vom CASA-System angegebenen Spermienkonzentration berechnet werden, um zwischen Einzelpersonen oder Behandlungsgruppen zu vergleichen. Neben der Qualitätsanalyse ist die relative Konzentration auch nützlich, um optimale Probenverdünnungen für die Kryokonservierung zu bestimmen. Wenn das durch Bauchmassage gesammelte Volumen durch Aufzuchtbedingungen oder eine andere Belastung verbessert wird, kann das Volumen durch Messung der Höhe der Milz im Kapillarrohr berechnet und in das Programm eingegeben werden, um die Konzentration zu berechnen. In diesen Fällen, in denen mehrere Mikroliter gewonnen werden können, kann die Motilität durch Bauchmassage höher sein als durch Hodendissektion (Zusatztabelle 2). Wenn geringe Volumina gesammelt werden, sind die Proben anfälliger für Kontamination, was die Motilität beeinflussen kann, obwohl diese Effekte konsistent zu sein scheinen, wenn die Volumina ähnlich sind, so dass immer noch Vergleiche zwischen Behandlungsgruppen angestellt werden können. Es sollten jedoch keine Vergleiche zwischen Proben angestellt werden, die sich in Volumen oder Färbung der Milz stark unterscheiden.
Das geringe Milzvolumen, das aus Medaka mit Bauchmassage gewonnen wird, kann eine Einschränkung für Experimente sein, die eine große Menge an Milz erfordern. In solchen Fällen kann die Hodendissektion vorzuziehen sein, wie in einer Studie gezeigt wurde, die Milz von Zebrafischen und grünem Schwertschwanz sowohl durch Dissektion als auch durch Massage sammelte, aber nur durch Dissektion in Medaka aufgrund des geringen Volumens30. Die Hodendissektion ist aus dem gleichen Grund typischerweise besser für Vergleiche mit anderen Arten. Das begrenzte Volumen durch Bauchmassage im Vergleich zu anderen, ähnlich großen Fischen kann auf kleinere Hoden (1,9 ± 0,6 mg in Medaka im Vergleich zu 7,0 ± 2,5 mg in Zebrafisch 45) und weniger produzierte Spermien (2,0 ± 0,4 x 10 6 Samenzellen/mg-Hoden in Medaka im Vergleich zu 7,7 ± 2,0 x 106 Samenzellen/mg-Hoden in Zebrafisch46) zurückzuführen sein. oder auf andere unbekannte biologische Faktoren, die die Technik einschränken, wie in Brüterei aufgezogener afrikanischer Wels47 vorgeschlagen. Der Unterschied könnte physiologisch sein, je nach Belastung oder Umweltbedingungen, oder anatomisch, da Medaka-Hoden im Gegensatz zu Zebrafischen verschmolzen und medial lokalisiert sind und daher durch Bauchmassage schwerer zugänglich sein könnten, obwohl es auch andere Fische mit verschmolzenen Hoden gibt.
Für einige Arten, wie z.B. Zebrafische, ist es am besten, Spermien zu entnehmen, bevor die Fische am Morgen laichenkönnen 48 oder Männchen in einzelnen Becken in der Nacht zuvor zu isolieren, um das Laichen zu verhindern32. Mit Hd-rR medaka aus dieser Studie hatten Umweltbedingungen wie der Zeitpunkt der Probenahme (vor oder nach dem Laichen) und die Unterbringungsbedingungen (mit oder ohne Weibchen für 1 Monat) keinen signifikanten Einfluss auf die Beweglichkeit der Spermien (Abbildung 7). Es ist möglich, dass eine größere Stichprobengröße oder die Isolierung von Männchen von Weibchen über einen längeren Zeitraum zu einer höheren Spermienmenge und/oder Beweglichkeit führen könnte. Beim CAB-Stamm Medaka aus einer anderen Einrichtung wurde ein ähnlicher Trend mit besserer Spermienqualität und -volumen von allein untergebrachten Männchen im Vergleich zu Männchen mit Weibchen beobachtet (zu wenige Fische wurden getestet, um statistische Schlussfolgerungen zu ziehen). Es war auch möglich, bei diesen Fischen relativ große Mengen an Milz durch Bauchmassage zu sammeln (Zusatztabelle 2), obwohl sehr kleine Mengen an Milz mit Hd-rR-Stamm Medaka erhalten wurden, und andere haben auch kleine Mengen mit der gleichen Technik in CAB-Stamm Medaka30 berichtet. Ob diese Unterschiede jedoch auf den Stamm (der eher ein kommerzieller Stamm als eine Inzucht ist) oder auf Unterschiede in der Aufzucht (es gibt viele zwischen den Einrichtungen) zurückzuführen sind, bleibt unklar. In diesen Fischen konnten mehrere Mikroliter Milz gesammelt werden, was die Kontamination begrenzt und die Qualität verbessert. Aber für Experimente, bei denen es wichtig ist, beide Geschlechter zusammenzuleben, scheint es nicht notwendig zu sein, sie zu trennen, um Ergebnisse zu erhalten. Es scheint auch nicht notwendig zu sein, Männchen vor dem Laichen gleichzeitig zu beproben.
Obwohl weitere Studien erforderlich sind, um genau zu bestimmen, wie sich Medaka-Spermien je nach Population und Umweltfaktoren unterscheiden, sollten die Belastungs- und Aufzuchtbedingungen dennoch bei der Gestaltung des Versuchsaufbaus berücksichtigt werden, und beim Vergleich zwischen Populationen, die unterschiedliche Mengen an Spermien produzieren, ist Vorsicht geboten. Wenn größere Mengen an Milz erhalten werden, sollte die Verdünnung der aktivierenden Lösung angepasst werden (z. B. 1:60, obwohl die bevorzugte Konzentration mit dem CASA-System variieren kann). Wenn die sezierten Hoden aufgrund der Belastung oder der Aufzuchtbedingungen viel größer sind als typisch (2 mg), muss die Verdünnung erhöht werden, damit das CASA-Programm alle Samenzellen genau kennzeichnen kann.
Die Methoden der Spermienanalyse variieren stark für Medaka und sind oft subjektiv, so dass die Ergebnisse schwer zwischen den Studien verglichen werden können. Eine Studie, in der subjektive und objektive Methoden verglichen wurden, die von Technikern mit unterschiedlichem Fachwissen verwendet wurden, ergab, dass sehr erfahrene Techniker die Spermienmotilität von Fischen innerhalb von 10 Prozentpunkten der von einem CASA-Motilitätsprogramm bereitgestellten Daten schätzen können, während Techniker mit mittlerer und niedriger Erfahrung die CASA-Motilitätswerte mit Amplituden von bis zu 30 Prozentpunkten überschätzen21 . Ein Mangel an Standardisierung für die Parameter, die die Motilität in Medaka bestimmen, kann jedoch auch zu Abweichungen zwischen denen führen, die objektivere Methoden verwenden. Zum Beispiel hatte eine Studie, die Spermien mit 33 Bildern pro Sekunde (fps) aufzeichnete, 30 Bilder analysierte und Spermien, die sich schneller als 2 μm / s beweglich bewegten, eine durchschnittliche Geschwindigkeit von etwa 60 μm / s und eine Motilität von etwa 70% für ihre Kontrollfischehatte 18. Eine andere Studie, die das gleiche Protokoll verwendete, hatte eine durchschnittliche Geschwindigkeit von 40 μm / s für Kontrollspermien und eine prozentuale Motilität von über 80%19. Eine andere Gruppe, die 200 Bilder bei 47 fps analysierte, hatte eine durchschnittliche VCL über 100 um/s für Kontrollfische, aber eine durchschnittliche Motilität unter 50%. Sie gaben nicht bekannt, welche Parameter die Motilität bestimmen. In diesem Protokoll wird daher eine computergestützte Spermienanalysesoftware verwendet, um Spermien objektiv, schnell und zuverlässig auf der Grundlage einer Reihe von Parametern zu analysieren, die für die Eigenschaften von Medaka-Spermien angepasst wurden. Da es für die Konsistenz der Motilitätsparameter für Laborvergleiche von entscheidender Bedeutung ist, ist die vollständige Konfiguration, die in dieser Studie verwendet wird, verfügbar (Abbildung 2B), sodass dieses Protokoll von verschiedenen Forschern zuverlässig in einem anderen Labor repliziert werden kann.
Teleostfische zeigen eine große Vielfalt an Spermieneigenschaften, so dass, obwohl dieses Protokoll ursprünglich mit den empfohlenen Zebrafischparametern für die SCA Evolution-Software getestet wurde, es offensichtlich war, dass die Parameter für die Medaka-Spermien mit geringerer Geschwindigkeit und größerer Langlebigkeit angepasst werden mussten. So wurden die Zebrafischparameter an Medaka angepasst, wobei Literatur von Medaka und anderen Arten verwendet wurde, die ähnliche Spermieneigenschaften berichteten 19,34,35 und wählten die Schwellenwerte aus, die am besten zur Verteilung von 17.580 analysierten Spermienspuren von18 Individuen passten. Die Motilität basiert auf der Kurvengeschwindigkeit (VCL) mit unbeweglichen < 10 μm/s ≤ langsamen < 20 μm/s ≤ mittleren ≤ 40 μm/s < schnell. Spermien gelten als progressiv, wenn der Geradheitsindex (STR) > 68% beträgt. Der Schwellenwert, der die Motilität definiert, wurde bei 10 μm/s und nicht bei 2 μm/s gehalten, wie in einigen Literaturenverwendet 18,19, da viele Spermien ohne Geißelbewegung mit dieser Einstellung fälschlicherweise als beweglich bezeichnet wurden. Andere Fischarten mit ähnlich großen Samenköpfen (~2 μm) verwendeten ebenfalls 10 μm/s, um bewegliche Spermien35,43 zu definieren. Die maximale Fläche wurde von der Zebrafischeinstellung von 90 μm 2 auf 20 μm2 verringert, so dass große Zelltrümmer von der Hodendissektion ignoriert wurden.
Die Dauer der Motilität scheint von der Menge an ATP abhängig zu sein, die vor der Aktivierung gespeichert wurde, da die Flagellenbewegung einen schnellen Energieverbrauch erfordert. Wahrscheinlich aufgrund dieser schnellen Erschöpfung besteht eine Korrelation zwischen Spermien mit hoher Anfangsgeschwindigkeit und einer kürzeren Dauer der Motilität49. Während ein osmotischer Schock typischerweise erforderlich ist, um Fischsperma zu aktivieren, kann er während der Motilitätsperiode auch zu Membranschäden führen, die sich auch auf die Langlebigkeit auswirken können. Dieser Effekt ist bei Süßwasserarten49 kritischer, was erklären könnte, warum marine Spermien zu einer längeren Motilitätsdauer fähig sind (durchschnittlich etwa 550 s im Vergleich zu etwa 150 s für Süßwasserarten), obwohl sie eine ähnliche durchschnittliche Geschwindigkeit und Motilität aufweisen wie Süßwasserspermien14,22. Eine Motilitätsdauer von mehr als 30 min ist nicht üblich, wurde jedoch bei mehreren marinen Arten berichtet 22,49. Obwohl es sich um einen Süßwasserfisch handelt, passen die Ergebnisse mit Medaka zum Profil von Spermien, die eine geringere Geschwindigkeit und längere Dauer von Meerestieren haben. Dies kann mit der Aktivierung in einem Medium zusammenhängen, das dem Samenplasma ähnelt - ohne osmotischen Schock erleiden Medaka-Spermien wahrscheinlich keine Membranschäden wie andere Süßwasserfische.
Eine nicht aktivierende Lösung und eine sehr schnelle, konsistent zeitgesteuerte Analyse nach der Aktivierung ist oft für die Analyse von Spermien erforderlich, die nur minutenlang beweglich sind. Die Beweglichkeit der Medaka-Spermien hält jedoch von Natur aus mehrere Stunden an und eine höhere Beweglichkeit kann durch Lagerung bei 4 °C oder auf Eis erhalten bleiben (Abbildung 6). So kann bei Experimenten, bei denen eine sofortige Analyse nicht möglich ist, das Protokoll so geändert werden, dass beispielsweise Hoden eine Stunde lang in aktivierender Lösung auf Eis gelagert werden, solange die Sammelzeit aufgezeichnet wird, damit die Analyse konsistent bleiben kann. Für optimale Ergebnisse ist jedoch eine sofortige Analyse immer noch die beste Option. Während die Motilität immer noch abnimmt, weil sie allmählich ist, werden die Ergebnisse weniger durch geringfügige Unterschiede in der Analysezeit nach der Aktivierung beeinflusst. Dennoch ist es wichtig, sowohl die Lagertemperatur der Proben als auch den Zeitpunkt der Analyse nach der Aktivierung anzugeben, damit die Daten verglichen und reproduziert werden können.
Es ist auch typischerweise sehr wichtig bei Fischen, eine Kontamination von Milz mit Urin während der Probenahme zu vermeiden, da dies die Osmolalität verändern und die Spermien vorzeitig aktivieren kann16,50. Dies ist jedoch bei Medaka (aufgrund der längeren Motilitätsdauer) und bei diesem Protokoll weniger problematisch, da die Probe sofort in ein Aktivierungsmedium gegeben wird. Geringe Mengen an Milz sind anfällig für Urinkontamination, so dass bei der Bauchmassage von Medaka eine gewisse Verfärbung zu erwarten ist, wenn geringe Volumina beschafft werden. Wenn dies jedoch in der Bevölkerung konsistent ist, können immer noch Vergleiche zwischen den Behandlungsgruppen angestellt werden. Vorsicht ist geboten beim Vergleich von Medaka-Populationen, die sich im Volumen oder in der Färbung der Milz unterscheiden.
Da die Ergebnisse der Spermienanalyse stark von den verwendeten Methoden abhängen, sind detaillierte und zuverlässige Methoden, die in verschiedenen Laboren leicht wiederholt werden können, von Vorteil. Es ist auch wichtig, dass Papiere Einzelheiten über ihre Methoden offenlegen, um Wiederholbarkeit zu ermöglichen. Da medaka zunehmend als Modell für die Fortpflanzungsforschung verwendet wird, fehlen die Informationen zur Beurteilung der Spermienqualität. Die beiden verschiedenen Methoden, die in diesem Artikel für die Spermienentnahme beschrieben werden, können für verschiedene Experimente von Vorteil sein. Die Hodendissektion ergibt typischerweise Spermien mit höherer Motilität und ermöglicht relative Konzentrationsberechnungen, während die Bauchmassage wiederholt am selben Fisch durchgeführt werden kann und eine reinere, biologische Darstellung eines Laichereignisses darstellt. Dieses Manuskript liefert daher die Parameter für CASA, eine zuverlässige, objektive Technik, die umfangreiche Daten über die Spermienbewegung liefert, einschließlich Motilität, Progressivität, Geschwindigkeit und anderer kinematischer Parameter. Diese Protokolle werden daher für eine Vielzahl von Studien in Medaka nützlich sein, einschließlich Toxikologie, Ökologie, Fortpflanzung und Physiologie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Norwegian University of Life Sciences und dem US-amerikanischen Fulbright-Programm finanziert. Die Autoren danken Anthony Peltier und Lourdes Carreon G Tan von NMBU für die Wartung von Fischanlagen und Guillaume Gourmelin vom ISC LPGP am INRAE (Frankreich) für die Bereitstellung von Fisch- und Laborräumen, um diese Methoden weiter zu testen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
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