Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Preclinical Sciences and Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences, 2Department of Production Animal Clinical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

Summary

מאמר זה מתאר שתי שיטות מהירות ויעילות לאיסוף זרע מדאקה דג מודל קטן (Oryzias latipes), כמו גם פרוטוקול להערכה אמינה של איכות הזרע באמצעות ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA).

Abstract

מדאקה יפנית (Oryzias latipes) היא דג טלוסט ומודל מתפתח של בעלי חוליות למחקר אקוטוקסיקולוגיה, התפתחות, גנטיקה ופיזיולוגיה. מדאקה משמשת באופן נרחב גם כדי לחקור רבייה של בעלי חוליות, שהיא פונקציה ביולוגית חיונית מכיוון שהיא מאפשרת למין להנציח. איכות הזרע היא אינדיקטור חשוב לפוריות הגבר, ובכך להצלחת הרבייה. טכניקות להפקת זרע וניתוח זרע מתועדות היטב עבור מינים רבים, כולל דגי טלוסט. איסוף זרע הוא פשוט יחסית בדגים גדולים יותר, אך יכול להיות מסובך יותר בדגים קטנים מכיוון שהם מייצרים פחות זרע והם עדינים יותר. מאמר זה, אם כן, מתאר שתי שיטות לאיסוף זרע בדג המודל הקטן, מדאקה יפנית: דיסקציה של האשכים ועיסוי בטן. מאמר זה מדגים כי שתי הגישות אפשריות עבור medaka ומראה כי עיסוי בטן יכול להתבצע מספר חוזר של פעמים כאשר הדגים מתאוששים במהירות מההליך. מאמר זה מתאר גם פרוטוקול לניתוח זרע בעזרת מחשב במדאקה כדי להעריך באופן אובייקטיבי מספר אינדיקטורים חשובים לאיכות הזרע של medaka (תנועתיות, התקדמות, משך תנועתיות, ריכוז יחסי). הליכים אלה, המפורטים עבור מודל טלוסט קטן ושימושי זה, ישפרו מאוד את ההבנה של הגורמים הסביבתיים, הפיזיולוגיים והגנטיים המשפיעים על הפוריות אצל זכרים בעלי חוליות.

Introduction

מדאקה יפנית היא דג טלוסט קטן המטיל ביצים במים מתוקים שמקורו במזרח אסיה. מדאקה הפכה למערכת מודל מצוינת של בעלי חוליות עבור אקוטוקסיקולוגיה, גנטיקה התפתחותית, גנומיקה, ביולוגיה אבולוציונית ומחקרי פיזיולוגיה 1,2. בדומה לדגי הזברה הפופולריים, הם קלים יחסית לגידול ועמידים מאוד למחלות דגים נפוצות רבות 1,2. ישנם מספר יתרונות לשימוש במדאקה כמודל, כולל זמן דור קצר, עוברים שקופים 1,2 וגנום מרוצף3. שלא כמו דגי זברה, למדאקה יש גן הקובע את המין4 וכן טמפרטורה גבוהה (בין 4-40 מעלות צלזיוס) וסבילות מליחות (מינים אוריהלינים)5. כמו כן, כלים גנטיים ואנטומיים רבים, כמו גם פרוטוקולים 6,7,8,9,10,11,12, פותחו במדאקה כדי להקל על חקר הביולוגיה שלה.

רבייה היא פונקציה פיזיולוגית חיונית מכיוון שהיא מאפשרת למין להנציח. רבייה של בעלי חוליות דורשת מספר עצום של אירועים מתוזמרים במדויק, כולל ייצור ביציות אצל נקבות וייצור זרע אצל זכרים. זרע הם תאים ייחודיים, המיוצרים בתהליך מורכב של זרעונים, שבו ישנם מספר מחסומים במקום כדי להבטיח אספקה של מוצר באיכות גבוהה13. איכות הגמטה הפכה למוקד בחקלאות ימית ובחקר אוכלוסיות דגים בשל השפעתה על הצלחת ההפריה והישרדות הזחלים. איכות הזרע היא, אם כן, אינדיקטור חשוב לפוריות הגבר אצל בעלי חוליות.

שלושה גורמים שימושיים להערכת איכות זרע הדגים הם תנועתיות, התקדמות ואריכות ימים. תנועתיות באחוזים ותנועתיות פרוגרסיבית הם אינדיקטורים נפוצים לאיכות הזרע שכן תנועה פרוגרסיבית נחוצה ומתואמת מאוד עם הצלחת ההפריה14,15. משך התנועה הוא גם אינדיקטור חשוב בדגים שכן הזרע נשאר תנועתי באופן מלא במשך פחות מ -2 דקות ברוב מיני הטלוסט ומסלול הזרע הוא בדרך כלל פחות ליניארי מאשר ביונקים15. עם זאת, מחקרים רבים שהעריכו את תנועתיות הזרע בעבר הסתמכו על שיטות סובייקטיביות או כמותיות למחצה לניתוח זרע15,16. לדוגמה, תנועתיות הזרע במדאקה הוערכה בעבר באופן חזותי תחת מיקרוסקופ17. כמו כן, הוא הוערך על ידי רישום תנועת זרע ושימוש בתוכנת הדמיה למיזוג מסגרות ומדידת נתיב שחייה ומהירות18,19,20. גישות כאלה לעתים קרובות חסרות חוסן, ומספקות תוצאות שונות בהתאם לאדם המבצע את הניתוח 15,21.

ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA) פותח בתחילה עבור יונקים. CASA היא שיטה כמותית מהירה להערכת איכות הזרע על ידי הקלטה ומדידה של מהירות ומסלול באופן אוטומטי15. בדגים, הוא שימש במינים שונים כדי לפקח על ההשפעות של כמה מזהמי מים על איכות הזרע, לזיהוי אבות מעניינים כדי לשפר broodstock, כדי לשפר את היעילות של שימור בהקפאה ואחסון, כדי לייעל את התנאים להפריה15. לכן, זהו כלי רב עוצמה להערכה אמינה של איכות הזרע במינים שונים של בעלי חוליות. עם זאת, בשל המגוון החשוב באסטרטגיות הרבייה בין דגים, הזרע של דגי הטלוסט שונה מזה של יונקים וממין דג אחד למשנהו. לדגי טלוסט, המפרים בעיקר ביציות חיצונית על ידי שחרור גמטות למים, יש זרע מרוכז מאוד שהוא פשוט יחסית במבנה ללא אקרוזום, בניגוד ליונקים, אשר מפרים פנימית ולכן אינם צריכים לפצות על דילול במים, אך כן צריכים לעמוד בנוזלים צמיגים יותר14. בנוסף, זרע מרוב הדגים נע במהירות אך הוא תנועתי לחלוטין במשך פחות מ -2 דקות לאחר ההפעלה, אם כי ישנם מספר יוצאים מן הכלל15,22. מכיוון שהתנועתיות יכולה לרדת במהירות אצל רוב הדגים, יש לנקוט בזהירות רבה עם תזמון הניתוח לאחר ההפעלה בעת קביעת פרוטוקול ניתוח זרע לדגים.

רבייה היא אחד התחומים בביולוגיה שבהם טלאוסטים ומדאקה שימשו באופן נרחב כאורגניזמי מודל. ואכן, זכרי מדאקה מראים התנהגויות רבייה וחברתיות מעניינות, כגון שמירה עלהזדווגות 23,24. בנוסף, קיימים מספר קווים מהונדסים כדי לחקור את השליטה הנוירואנדוקרינית של רבייה במין זה25,26,27. דגימת זרע, הליך שהוא פשוט יחסית בדגים גדולים יותר, יכולה להיות מסובכת יותר בדגי מודל קטנים מכיוון שהם מייצרים פחות זרע והם עדינים יותר. מסיבה זו, רוב המחקרים הכוללים דגימת זרע בתמצית medaka milt (זרע דגים) על ידי ריסוק אשכים מנותחים 17,28,29,30. כמה מחקרים משתמשים גם בעיסוי בטן שונה כדי לבטא את המילט ישירות להפעלתמדיום 18,19,20; עם זאת, בשיטה זו קשה לדמיין את כמות וצבע של Milt שחולץ. אצל דגי זברה, עיסוי בטן משמש בדרך כלל כדי להביע milt, אשר נאסף מיד בצינור נימי31,32,33. שיטה זו מאפשרת להעריך את נפח המילט, כמו גם תצפית על צבע השפיכה, המהווה אינדיקטור מהיר ופשוט לאיכות הזרע32,33. לכן, פרוטוקול ברור ומתואר היטב לאיסוף וניתוח זרע חסר למדקה.

מאמר זה מתאר אפוא שתי שיטות לאיסוף זרע בדגם הקטן של דג מדאקה יפני: דיסקציה של האשכים ועיסוי בטן עם צינורות נימיים. הוא מדגים כי שתי הגישות אפשריות למדאקה ומראה כי ניתן לבצע עיסוי בטן מספר חוזר ונשנה של פעמים כאשר הדג מתאושש במהירות מההליך. הוא גם מתאר פרוטוקול לניתוח זרע בסיוע מחשב במדאקה כדי למדוד באופן מהימן מספר אינדיקטורים חשובים לאיכות הזרע של medaka (תנועתיות, התקדמות, אריכות ימים וריכוז זרע יחסי). הליכים אלה, המפורטים עבור מודל טלוסט קטן ושימושי זה, ישפרו מאוד את ההבנה של הגורמים הסביבתיים, הפיזיולוגיים והגנטיים המשפיעים על הפוריות אצל זכרים בעלי חוליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים והטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות על רווחת בעלי חיים ניסיוניים באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים (NMBU). הניסויים בוצעו באמצעות זכרי מדאקה (זן Hd-rR) זכרים בוגרים (בני 6-9 חודשים) שגודלו ב-NMBU (Ås, נורבגיה). השיטות נבדקו לזמן קצר גם במדאקה יפנית זכרית בת 9 חודשים (זן CAB) שגדלה במכון המחקר הלאומי לחקלאות, מזון וסביבה (INRAE, רן, צרפת).

1. הכנת מכשירים ופתרונות

  1. הכן תמיסת מלאי הרדמה (0.6% טריקאין).
    1. יש לדלל 0.6 גרם של טריקאין (MS-222) ב-100 מ"ל של מלח 10x פוספט בופר מלח (PBS).
    2. Aliquot 2 מ"ל של תמיסת מלאי ההרדמה לתוך 50 צינורות פלסטיק 2 מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש בהרדמה או המתת חסד.
  2. הכינו מי התאוששות (0.9% תמיסת נתרן כלורי [NaCl]).
    1. הוסיפו 27 גרם של NaCl ל-3 ליטר מי אקווריום.
    2. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש.
  3. התאם את מדיום ההפעלה במידת הצורך (תמיסת המלח המאוזנת של האנק [HBSS]).
    הערה: HBSS ניתן לרכוש באופן מסחרי או מיוצר במעבדה (טבלת חומרים).
    1. מדוד את ה- pH של HBSS באמצעות מד pH. התאם את ה- pH במידת הצורך, באמצעות חומצה הידרוכלורית או נתרן הידרוקסיד, כך שה- pH הסופי הוא 7.1-7.3.
    2. מדוד את האוסמוליות של HBSS באמצעות אוסמומטר לדיווח עתידי.
      הערה: הטווח במוצר המסחרי הוא 266-294 mOsmol/kg; במחקר הנוכחי, האוסמולליות הייתה 287 mOsmol/kg. זה יכול להיות מדולל עם מים מזוקקים כדי להפחית את osmolality אם תרצה, אבל זה לא הכרחי כמו אין הבדל גדול בהפעלת זרע medaka ב 150-300 mOsmol / kg HBSS.
    3. אחסן את הפתרון ב-RT עד לשימוש.
  4. הכינו את ספוג האחיזה.
    1. חותכים ספוג רך כך שיתאים היטב לצלחת פטרי.
    2. חתכו קו ישר במרכז הספוג שהוא ארוך מספיק כדי לקלוט את הדג (3-4 ס"מ) ובעומק של כ-1 ס"מ (איור 1A). חריץ זה בספוג יחזיק את צד הגחון של הדג כלפי מעלה כדי לחשוף את הקלואקה.

2. איסוף זרע

הערה: איסוף זרע יכול להתבצע בשתי שיטות שונות: עיסוי בטן או דיסקציה של האשכים.

  1. איסוף זרע על ידי עיסוי בטן
    1. הכן תמיסת הרדמה של 0.03% על ידי דילול צינור אחד של מלאי טריקאין (0.6%) ב -38 מ"ל של מי אקווריום במיכל זכוכית של 100 מ"ל.
    2. הכן את המכשירים, כולל מלקחיים חלקים בקצה קהה ומכלול מיקרופיפטה מזכוכית מכוילת בגודל 10 μL ומכלול צינורות אספירטור (איור 1A). הרטיבו את ספוג ההחזקה שהוכן בשלב 1.4 עם תמיסת ההרדמה.
    3. הכן צינורות עם 36 μL של הפתרון המפעיל לניתוח מיידי. מחממים מראש את התמיסה המפעילה באמבט מים או באינקובטור המוגדר ל-27 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
      הערה: למרות שניתן לנתח דגימות מדגים בודדים, ניתן להפחית את השונות האינדיבידואלית על ידי איגום דגימות ממספר זכרים באותו פתרון הפעלה. בעת איגום דגימות ממספר דגים, השתמש ב-36 μL של תמיסה מפעילה לכל דג. ייתכן שיהיה צורך להתאים דילול זה בהתאם למתח או לתנאי הגידול של המדאקה המשמשים מכיוון שגורמים אלה יכולים להשפיע על ריכוז הזרע ונפחו. תוכנית CASA תציין אם הריכוז גבוה מכדי לזהות זרע.
    4. הרדמת הדג על ידי הכנסתו לתמיסת הרדמה למשך 30-90 שניות.
      הערה: משך ההרדמה חייב להיות מותאם כפי שהוא משתנה בהתאם לגודל הדג. כדי להבטיח כי הדג הוא מורדם לחלוטין, בעדינות לצבוט את peduncle caudal עם מלקחיים. אם הדג אינו מגיב, ניתן להתחיל את העיסוי.
    5. הוציאו את הדג מתמיסת ההרדמה והשתמשו במגבת נייר או נגבו בעדינות כדי לייבש את בטן הדג. הניחו את הדג בשוקת של הגחון הספוגי הלח כלפי מעלה, כך שהזימים שלו ייחשפו לתמיסת ההרדמה שבספוג (איור 1B).
    6. אם האזור סביב הקלואקה רטוב, יבשו בעדינות את החלק התחתון של הדג עם מגבון טישו חד פעמי.
    7. הניחו את הדגים בספוג ההחזקה תחת מיקרוסקופ מנתח והניחו את המיקרופיפטה עם צינור שואב שמחובר כנגד הקלואקה של הדג (איור 1C).
    8. עסו את הבטן של הדגים על ידי סחיטה עדינה עם מלקחיים חלקים בקצה קהה בתנועה רוסטרלית לקאודלית ובמקביל מציצה כדי לאסוף את המילט המגורש לתוך הפיפטה (איור 1D).
    9. שחררו את הדג מהספוג אל מי ההתאוששות. אפשרו להם להתאושש בתמיסה במשך 15 דקות לפחות לפני שתחזירו אותם למערכת האקווריום.
    10. מעבירים את המילט לצינור מוכן עם תמיסת הפעלה מחוממת מראש ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים על ידי מציצה ונשיפה על מכלול צינור השואף.
    11. הומוגניזציה של הזרע המדולל בעדינות על ידי הזזת הצינורות לפני הניתוח.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, נתח דגימות מיד (לדוגמה, 5 שניות) לאחר ההפעלה. במדאקה, הניתוח עשוי להתעכב, במידת הצורך, מכיוון שהזרע נשאר תנועתי במשך מספר שעות, אך הזמן צריך להישאר עקבי בין הדגימות ככל שהתנועתיות פוחתת עם הזמן.
  2. איסוף זרע על ידי נתיחת אשכים
    1. הכן תמיסת המתת חסד של 0.08% על ידי דילול שתי שפופרות של מלאי טריקאין (0.6%) ב -26 מ"ל של מי אקווריום במיכל זכוכית של 100 מ"ל.
    2. הכינו כלי דיסקציה, כולל מלקחיים קהים ועדינים ומספריים קטנים לחיתוך (איור 1E).
    3. הכן צינור לכל דגימה עם 120 μL של פתרון הפעלה לניתוח מיידי. מחממים מראש את התמיסה המפעילה באמבט מים או באינקובטור המוגדר ל-27 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
      הערה: למרות שניתן לנתח דגימות מדגים בודדים, ניתן להפחית את השונות האינדיבידואלית על ידי איגום דגימות ממספר זכרים באותו פתרון הפעלה. לאיגום דגימות ממספר דגים, השתמש ב-120 μL של תמיסה מפעילה לכל דג. ייתכן שיהיה צורך להתאים דילול זה בהתאם למתח או לתנאי הגידול של המדאקה המשמשים מכיוון שגורמים אלה יכולים להשפיע על ריכוז הזרע ונפחו. תוכנית CASA תציין אם הריכוז גבוה מכדי לזהות זרע.
    4. להרדים את הדג על ידי הכנסתו לתמיסת ההרדמה של 0.08% למשך 30-90 שניות.
      הערה: משך הזמן תלוי בגודל הדג. כדי להבטיח שהדג מורדם, המתן עד שתנועות האופרקולום ייפסקו. הדגים לא צריכים להגיב למגע של מלקחיים.
    5. הסר את הדג מתמיסת המתת החסד ויבש בעדינות את הדג במגבת נייר או נגב בעדינות.
      הערה: בשלב זה, ניתן לשקול את הדג כדי לחשב מאוחר יותר את האינדקס הגונדוסומטי (GSI, משקל גונדל / משקל גוף).
    6. הניחו את הדג מתחת למיקרוסקופ חותך כשצדו השמאלי הצדדי פונה כלפי מעלה (איור 1F).
    7. באמצעות מספריים קטנים לנתח, חותכים דש באופן דורסלי מהקלואקה, ואז חוצים את הצלעות אל הזימים כדי לחשוף את האיברים הפנימיים (איור 1G).
    8. אתרו את האשכים, חתכו את החיבור בשני הקצוות בעזרת מלקחיים עדינים והסירו את האשכים (איור 1H).
      הערה: כדי לחשב את ה- GSI, ניתן לשקול את האשכים בשלב זה. יש לעבוד במהירות כדי למנוע ייבוש של הרקמה.
    9. העבירו את האשכים לצינור מוכן עם תמיסת ההפעלה שחוממה מראש.
    10. השתמש מלקחיים כדי למחוץ את האשכים מספר פעמים נגד הצד של הצינור כדי לשחרר את הזרע. שחרור הזרע בדרך כלל יכול להיות חזותי ויהפוך את הפתרון מעט מעונן.
    11. הומוגניזציה של הזרע המדולל בעדינות על ידי הזזת הצינורות לפני הניתוח.
      הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, נתח דגימות מיד (לדוגמה, 5 שניות) לאחר ההפעלה. במדאקה, הניתוח עשוי להתעכב, במידת הצורך, מכיוון שהזרע נשאר תנועתי במשך מספר שעות, אך הזמן צריך להישאר עקבי בין הדגימות ככל שהתנועתיות פוחתת עם הזמן.

Figure 1
איור 1: איסוף מילט על ידי עיסוי בטן (A-D) ודיסקציה של האשכים (E-H). (A) מכשירים לעיסוי בטן: ספוג מחזיק, מלקחיים חלקים קהים, ומיקרופיפט זכוכית מכויל חד פעמי 10 μL עם מכלול צינור אספירטור; (B) מיקום הדגים בספוג ההחזקה, כאשר הזימים חשופים להרדמה בספוג ובקלואקה הפונים כלפי מעלה; (C) מיקום של מלקחיים חלקים קהים על הבטן ומיקרופיפטה כנגד קלואקה; (D) מילט במיקרופיפטה לאחר עיסוי עדין ומציצה. (E) מכשירים לנתיחת אשכים: מלקחיים קהים, מלקחיים עדינים ומספריים קטנים; (ו) מיקום הדגים לצורך נתיחת אשכים; (ז) מבט רוחבי על איברים פנימיים; (H) הסר את האשכים על ידי חיתוך החיבור בשני הקצוות עם מלקחיים עדינים. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. ניתוח זרע עם מערכת CASA

  1. מערכת CASA (SCA Evolution) צריכה להיות מוגדרת על פי המדריך עם מיקרוסקופ באמצעות מסנן ירוק ומטרה פי 10 עם ניגודיות פאזה.
  2. הכינו שקופיות חד פעמיות של 20 מיקרומטר על ידי חימום מראש על צלחת חימום או באינקובטור שנקבע ל-27 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.
  3. פתח את תוכנת ניתוח הזרע ובחר את מודול התנועתיות.
  4. הגדר את התצורה של המדאקה כפי שמוצג באיור 2B.
  5. הניחו שקופית חד פעמית של 20 מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ על במה מחוממת בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס.
  6. צמחו את הדגימה לתוך התא בשקופית עד שהיא ממלאת את התא מבלי למלא אותו יתר על המידה. נגבו בזהירות דגימות עודפות מהכניסה לתא בעזרת קצה כותנה או נגבו בעדינות כדי למנוע תאים צפים.
  7. בחר נתח כדי להסתכל על הדגימה מתחת למיקרוסקופ.
    הערה: אם סמל המיקרוסקופ אדום, יש להתאים את תאורת המיקרוסקופ כדי שהתוכנית תעקוב אחר הזרע במדויק. התאם את בהירות המיקרוסקופ, כך שתנועת הזנב של הזרע נראית בבירור. הסמל צריך להיות כחול.
  8. ודא שהמיקרוסקופ ממוקד ובחר נתח שוב כדי להקליט את הזרע בשדה. הזז את השקופית כך שאזור חדש של הדוגמה יהיה במסגרת וחזור על הפעולה כדי ללכוד עבור 3-5 שדות תצוגה שונים. הימנע משדות עם בועות אוויר, מסות תאים או חפצים.
  9. בחר תוצאות כדי להציג את התוצאות.
    הערה: אם השדות בדף התוצאות מסומנים בקו אדום, פעל בהתאם להנחיות המערכת כדי למחוק את השדות המשתנים מדי בריכוז או בתנועתיות.
  10. לחץ פעמיים על שדה כדי להציג את התוצאות עבור השדה הבודד או כדי לבדוק באופן ידני אם קיימים זרעונים עם תווית שגויה או ללא מעקב. לחצו לחיצה ימנית על זרעונים בודדים כדי לסמן מחדש את התנועתיות, במידת הצורך (איור 2A).

Figure 2
איור 2: צילום מסך של תוכנת SCA Evolution . (A) תוצאות מעקב זרע עבור שדה אחד. הצג נתוני שדה בצד ימין ולחץ פעמיים על זרעונים כדי להציג נתונים בודדים; (B) סיכום תוצאות עבור כל השדות עם תפריט תצורה פתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סוג הנתונים שהתקבלו
ניתוח תנועתיות זרע מתוכנת SCA Evolution מספק נתונים על תנועתיות (אחוז הזרע התנועתי והלא תנועתי), כמו גם על התקדמות (אחוז הזרע המתקדם והלא פרוגרסיבי), ומהירות (אחוז הזרע המהיר, הבינוני והאיטי). הוא גם משלב התקדמות ומהירות (פרוגרסיבי מהיר, פרוגרסיבי בינוני, לא פרוגרסיבי). תוויות אלה מבוססות על מדידות (איור 3A) וחישובים (איור3B) של תנועת זרעונים, המסופקים על ידי התוכנית (טבלה משלימה 1). עבור מדאקה, ערכי הסף הבאים הותאמו מהפרמטרים המומלצים של דגי זברה בהתבסס על ספרות קודמת 19,34,35 והתפלגות נתוני מדאקה מ-18 פרטים. התנועתיות מבוססת על מהירות עקמומית (VCL) עם < 10 מיקרומטר לשנייה ≤ < איטי 20 מיקרומטר לשנייה ≤ בינוני ≤ 40 מיקרומטר לשנייה < מהיר. זרע נחשבים פרוגרסיביים אם מדד הישרות (STR) הוא > 68%.

SCA Evolution מחשבת גם את ריכוז הזרע אם היא מספקת את נפח הדגימה ואת הדילול. בעוד ששיטת עיסוי הבטן מועילה להמחשת הצבע ולאישור נוכחותו של המילט, הנפח שנאסף קטן מכדי שניתן יהיה למדוד אותו במדויק. אם נפח המילוט משופר על ידי תנאי גידול או שימוש בזן אחר וניתן למדוד אותו, ניתן להשתמש בתוכנית כדי לחשב את הריכוז. עם זאת, ריכוז יחסי יכול להיות מחושב גם כדי להשוות דגים או קבוצות טיפול עבור דגימות שנלקחו על ידי דיסקציה האשכים, כל עוד האשכים כולו מנותח ומדולל באותו נפח של נוזל.

Figure 3
איור 3: ניתוח תנועת זרעונים. (A) הנתונים שנרשמו על ידי מערכת CASA כוללים מהירות עקמומית (VCL, מהירות המחושבת באמצעות המרחק לאורך הנתיב בפועל), מהירות נתיב ממוצעת (VAP, מהירות המחושבת באמצעות המרחק של הנתיב הממוצע), מהירות קו ישר (VSL, מהירות המחושבת באמצעות המרחק בין ההתחלה לסוף של מסלול הזרע), משרעת של תזוזת ראש לרוחב (ALH, גודל התזוזה הצידית של ראש זרע בערך הנתיב הממוצע שלו), תדירות צולבת פעימה (BCF, קצב שבו הנתיב המעוגל חוצה את הנתיב הממוצע); (B) ערכים מחושבים ממערכת CASA כוללים מדד ישרות (STR, ליניאריות של הנתיב הממוצע), מדד ליניאריות (LIN, ליניאריות של הנתיב העקמומי) והתנדנדות (WOB, תנודה של הנתיב בפועל לגבי הנתיב הממוצע). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הערכת תנועתיות זרע: פתרונות הפעלה שונים
באופן מפתיע, זרע שנדגם הן על ידי עיסוי בטן והן על ידי נתיחת אשכים היה חסר תנועה במי אקווריום (16 mOsmol/kg) (איור 4A) ובמי אקווריום שהותאמו עם תמיסת NaCl ל-34 mOsmol/kg. כמו כן, לא הייתה תנועתיות במים שעברו דה-יוניזציה (-1 mOsmol/kg), או במים שעברו דה-יוניזציה שהותאמו ל-23 mOsmol/kg. הזרע היה תנועתי ב-HBSS (287 mOsmol/kg) (איור 4B), כמו גם ב-HBSS מדולל במים שעברו דה-יוניזציה ל-36 mOsmol/kg ו-113 mOsmol/kg, אם כי אחוז התנועתיות פחת באופן משמעותי ב-36 mOsmol/kg (איור 4C).

Figure 4
איור 4: תנועתיות על-ידי אוסמוליות של הפעלת תמיסה. זרע שנדגם על ידי נתיחת אשכים ב-(A) מי אקווריום (16 mOsmol/kg) ו-(B) HBSS לא מותאם (287 mOsmol/kg). עיגולים צהובים מסמנים זרע תנועתי וקווים צבעוניים מציינים את תנועת הזרע: אדום (פרוגרסיבי מהיר), ירוק (פרוגרסיבי בינוני), כחול (לא פרוגרסיבי). סרגל קנה מידה: 100 μm. (C)תנועתיות זרע מופעלת עם HBSS ב-36, 113 ו-287 mOsmol/kg H2O. עבור 36 ו-113, n = 4 עם שני דגים במאגר לכל דגימה. עבור 287, n = 9 עם שני דגים במאגר לכל דגימה. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות ANOVA עם מבחן טוקי פוסט-הוק והבדלים משמעותיים מסומנים על ידי אותיות שונות. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שיטות הדגימה: עיסוי בטן לעומת דיסקציה של האשכים
זרע שנדגם על ידי כריתת אשכים הוא תנועתי יותר באופן משמעותי בהשוואה לדגימות עיסוי בטן מאותו דג (איור 5A). מבין הזרעונים התנועתיים, אחוז גבוה יותר הם גם פרוגרסיביים ובינוניים או מהירים. בזרע שנדגם על ידי עיסוי בטן, יותר זרע תנועתי נע באיטיות ולא מתקדם (איור 5B-C). עם זאת, ניתן לקבל תוצאות שונות על ידי שימוש בזן אחר של מדאקה (CAB) או בתנאי גידול חלופיים (טבלה משלימה 2).

Figure 5
איור 5: עיסוי בטן לעומת כריתת אשכים. אחוז (A) זרע תנועתי ותנועתי שנדגם על ידי עיסוי בטן או כריתת אשכים. אחוז הזרע התנועתי שהוא (B) זרע לא פרוגרסיבי ומתקדם, ו-(C) איטי, בינוני ומהיר-תנועה. כל דגימות הזרע הופעלו ב-HBSS (287 mOsmol/kg H2O). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחן Mann-Whitney U והבדלים משמעותיים מסומנים על ידי כוכביות. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM, n = 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

משך תנועתיות בהתאם למצב האחסון
זרע שנדגם על ידי דיסקציה של האשכים ונשמר בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס היה בעל ירידה של 50% בתנועתיות ב-30 הדקות הראשונות לאחר ההפעלה. לאחר 2.5 שעות, פחות מ-5% מהזרע היה תנועתי. כאשר אוחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, התנועתיות הופחתה ב-14% בלבד ב-30 הדקות הראשונות, ונדרשו 5 שעות כדי לראות ירידה של 50% מהתנועתיות הראשונית. לקרח הייתה השפעה מאריכה דומה, אך הוא היה פחות יעיל, עם ירידה של 26% בתנועתיות ב-30 הדקות הראשונות (איור 6A). ההתקדמות ירדה גם ב-52% ב-30 הדקות הראשונות על הקרח, לעומת 65% ב-27 מעלות צלזיוס ו-33% ב-4 מעלות צלזיוס (איור 6B). גם על קרח וגם ב-4 מעלות צלזיוס, חלק מהזרע (<3%) עדיין נע 42 שעות לאחר ההפעלה.

Figure 6
איור 6: אורך חיי הזרע בהתאם למצב האחסון. אחוז (A) תנועתיות ו-(B) התקדמות לאורך זמן עבור דגימות המופעלות עם HBSS (287 mOsmol/kg H2O) ומאוחסנות בטמפרטורה של 27 °C, 4 °C או על קרח. נקודות הנתונים ממוצעות ± SEM, n = ≥4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

חשיבות תנאי הסביבה והדיור
זכרים ששוכנו יחד עם נקבות נדגמו על ידי נתיחת אשכים בבוקר לפני שהייתה להם הזדמנות להשריץ (לפני שהאורות נדלקו) או לאחר שהאורות נדלקו והנקבות במיכל אכלו ביצים. לא היה הבדל משמעותי בתנועתיות הזרע. כמו כן נדגמו זכרים ששוכנו ללא נקבות במשך חודש, ובעוד שהייתה מגמה של תנועתיות גבוהה יותר, גם ההבדל לא היה משמעותי (איור 7).

עם זאת, כאשר זן CAB medaka גודל במתקן אחר עם זכרים מופרדים מנקבות במשך חודש לפחות, הדגים היו גדולים יותר 5-7 μL של milt נאספו על ידי עיסוי בטן. דגימות שנאספו מחמישה דגים על ידי עיסוי בטן היו תנועתיות של 68.34% כאשר הופעלו עם 300 mOsmol / kg HBSS. כאשר הוחזקו באותם תנאים אך עם נקבות, נפח המילט שנאסף היה כ-2 μL, והתנועתיות הממוצעת הייתה 46.2% משלושה זכרים (טבלה משלימה 2).

Figure 7
תרשים 7. השפעת תנאי הסביבה על תנועתיות הזרע. אחוז תנועתיות הזרע שנדגם לפני (n = 5) ואחרי (n = 4) השרצה מזכרים ששוכנו במשותף עם נקבות, וזרע מזכרים ששוכנו ללא נקבות (n = 6). כל הדגימות נדגמו על ידי דיסקציה של האשכים והופעלו באמצעות HBSS (287 mOsmol/kg H2O). ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות מבחני t וההבדלים לא היו מובהקים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM עם עיגולים המייצגים דגים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה 1: חישובי מהירות ותנועה ממוצעים עבור זרע שנדגם על ידי עיסוי בטן וכריתת אשכים (n = 9). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: נתוני ניתוח זרע מזן CAB (המכונה גם Carbio) medaka שגודלו ב- INRAE ברן, צרפת. כל הדגימות הופעלו ב-HBSS של 300 mOsmol/kg. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אוסמולליות היא גורם חשוב בהפעלת זרע דגים36,37. באופן כללי, זרעונים הם תנועתיים באשכים והופכים תנועתיים במדיה שהיא היפרוסמוטית ביחס לנוזל הזרע עבור דגים ימיים, והיפו-אוסמוטי ביחס לנוזל הזרע עבור דגי מים מתוקים37. בדומה לדם, פלזמת הזרע בדגי מים מתוקים בדרך כלל נמוכה מזו של דגי ים (כ-300 מאוסמול/ק"ג לעומת 400 מאוסמול/ק"ג)22,37. לפיכך, זרע דגים מופעל בדרך כלל במגע עם המים שבהם הם חיים, ומים אלה משמשים כאמצעי ההפעלה הטוב והביולוגי ביותר לניתוח זרע. עם זאת, זרע מדאקה שנדגם על ידי עיסוי בטן וכריתת אשכים לא היה תנועתי במי אקווריום (איור 4A) בזן Hd-rR או CAB שגדל בשתי מעבדות שונות. בנוסף, התנועתיות הייתה גבוהה יותר ב-HBSS של 287 mOsmol/kg מאשר ב-HBSS של 36 mOsmol/kg (איור 4C), דבר יוצא דופן עבור דג מים מתוקים.

רוב המחקרים הקודמים שכללו ניתוח זרע במדאקה השתמשו ב-HBSS 28,29,38 או בתמיסת ימאמוטו 18,19 כאמצעי הפעלה לזרע מדאקה מבלי לדון באוסמולליות. בעוד HBSS הוא מדיום מפעיל טוב עבור זרע medaka, וריאציה osmolality יכול להשפיע על תנועתיות. לכן, חיוני למחקרי ניתוח זרע לחשוף את האוסמולליות של הפתרון המפעיל שלהם להשוואה בין ניסויים. מחקר אחד שבחן את האוסמולליות האידיאלית של הפעלת מדיום מצא כי זרע מדאקה הוא תנועתי במים שעברו דה-יוניזציה (25 mOsmol/kg) ו-HBSS עם ערכי אוסמולליות <-686 mOsmol/kg, עם התנועתיות הגבוהה ביותר בין 25 ל-227 mOsmol/kg17. עם זאת, במחקר הנוכחי, גם הזרע לא היה תנועתי במים שעברו דה-יוניזציה. כדג אוריהאלי, מדאקה מסתגלים מאוד לסביבות שונות ויכולים אפילו לחיות ולהתרבות במים מלוחים39, כך שייתכן שתנאי גידול שונים אחראים לפער זה. באופן מעניין, אף מחקר אחר לא דיווח על בדיקת תנועתיות זרע מדאקה במי אקווריום (או דומה, כגון מי ברז מיושנים), למרות שזהו אמצעי הפעלת הזרע הסטנדרטי לדגי מים מתוקים.

הסבר אפשרי אחד להפעלת זרע לא טיפוסית זו במדאקה הוא אינטראקציה עם נוזל השחלות. בעוד שזרע דגים מופעל בדרך כלל במים הסובבים אותו, נוזל השחלות מגדיל או מאריך את משך תנועתיות הזרע במינים רבים40,41. למרות שמדאקה מפרים באופן חיצוני דגי מים מתוקים, התנהגות ההשרצה שלהם, הכוללת עטיפת סנפירים ורעידה, מעמידה אותם בסמיכות רבה יותר מאשר שרצים משודרים23. מכיוון שהאוסמולליות של נוזל השחלות בדגי מים מתוקים (כ-300 מ'אוסמול/ק"ג) קרובה ל-HBSS40, ייתכן שנוזל המשתחרר על ידי הנקבה מפעיל את הזרע, ולא את מי האקווריום. מאחר שהאוסמולליות של פלזמה הזרע והשחלות דומות, ייתכן שההרכב היוני של נוזל השחלות מדאקה ממלא תפקיד חשוב40,42. תפקידם של נוזל השחלות והיונים בהפעלת זרע מדאקה מצדיק חקירה נוספת.

במחקרים קודמים, זרע medaka נאסף רק על ידי ריסוק אשכים מנותחים 17,28,29,30 או על ידי עיסוי בטן כדי להביע את milt ישירות לתוך הפעלת בינוני 18,19,20; אף מחקר לא דיווח על נתונים עם זרע שנאסף על ידי עיסוי בטן לתוך צינור נימי, אם כי זה נוהג נפוץ דגי זברה ודגי טלוסט אחרים 33,43,44. שיטה זו אפשרית גם במדאקה. Milt הוא הדמיה בקלות בצינור נימי, ולמרות שהנפח קטן מכדי שניתן יהיה למדוד אותו במדויק, שיטה זו מאפשרת אישור של איסוף וניתוח מוצלחים של צבע כאינדיקטור מהיר לאיכות32. הימנעות מזיהום צואה גם קלה יותר עם איסוף בצינור נימי בהשוואה למדיום. למרות שלדגימות זרע שנאספו על ידי נתיחת אשכים יש תנועתיות טובה יותר במדאקה מאשר דגימות שנאספו על ידי עיסוי בטן (איור 5) ולכן הן עדיפות על ניסויים שבהם ניתן להקריב את הדגים, עיסוי בטן הוא הליך זעיר פולשני שאינו דורש המתת חסד וניתן לחזור עליו באותו דג. לכן, זה שימושי עבור ניסויים כי בצע את אותו דגים לאורך זמן. כמו כן, דגימות שנאספו עם עיסוי בטן מכילות רק תאים בוגרים ששוחררו עם פלזמה זרע44, בעוד שדגימות מניתוח אשכים עשויות לכלול תאי זרע לא בשלים ופסולת אחרת. מערכת CASA מפחיתה תאים עגולים ופסולת הגדולה מהשטח המרבי, אך אם פרמטר זה מוגדר גבוה מדי, תוצאות התנועתיות עלולות להיות מושפעות.

בשל כמות הזרע הנמוכה שנאספה בטכניקת עיסוי הבטן במדאקה זו, לא ניתן היה למדוד במדויק את נפח הזרע בנימים ובכך לחשב את ריכוזי הזרע באמצעות גישות רגילות. עם זאת, עבור דגימות שנלקחו על ידי דיסקציה של אשכים, על ידי שמירה על נפח ההפעלה בינוני עקבי ושקילת האשכים, ניתן לחשב ריכוז יחסי על סמך ריכוז הזרע שניתן על ידי מערכת CASA כדי להשוות בין אנשים או קבוצות טיפול. מלבד ניתוח איכות, ריכוז יחסי הוא גם שימושי לקביעת דילולים מדגם אופטימלי עבור שימור הקפאה. אם הנפח שנאסף על ידי עיסוי בטן משופר על ידי תנאי גידול או באמצעות זן אחר, ניתן לחשב את הנפח על ידי מדידת גובה המילט בצינור הנימי ולהיכנס לתוכנית לחישוב הריכוז. במקרים אלה, בהם ניתן להשיג מספר מיקרוליטרים, תנועתיות עשויה להיות גבוהה יותר על ידי עיסוי בטן מאשר דיסקציה של האשכים (טבלה משלימה 2). כאשר נאספים נפחים נמוכים, הדגימות נוטות יותר לזיהום, מה שעלול להשפיע על התנועתיות, אם כי נראה כי השפעות אלה עקביות כאשר הנפחים דומים, כך שעדיין ניתן לערוך השוואות בין קבוצות הטיפול. עם זאת, אין לערוך השוואות בין דגימות המשתנות מאוד בנפח או בצבע של מילט.

הנפח הנמוך של מילט המתקבל ממדאקה באמצעות עיסוי בטן עשוי להיות מגבלה לניסויים הדורשים נפח גדול של מילט. במקרים כאלה, דיסקציה של האשכים עשויה להיות עדיפה, כפי שהוכח במחקר שאסף מילט מדגי זברה וזנב חרב ירוק הן על ידי דיסקציה והן על ידי עיסוי, אך רק על ידי דיסקציה במדאקה בשל נפח נמוך30. נתיחת אשכים בדרך כלל טובה יותר להשוואות למינים אחרים מאותה סיבה. הנפח המוגבל על ידי עיסוי בטן בהשוואה לדגים אחרים, בגודל דומה, עשוי לנבוע מאשכים קטנים יותר (1.9 ± 0.6 מ"ג במדאקה לעומת 7.0 ± 2.5 מ"ג בדגי זברה 45) ופחות זרע המיוצר (2.0 ± 0.4 x 10 6 תאי זרע/מ"ג אשכים במדאקה לעומת 7.7 ± 2.0 x 106 תאי זרע/מ"ג אשכים בדגי זברה46), או לגורמים ביולוגיים לא ידועים אחרים המגבילים את הטכניקה, כפי שהוצע בשפמנון אפריקאי שגודל בבקתה47. ההבדל יכול להיות פיזיולוגי, על פי תנאי המתח או הסביבה, או אנטומי, שכן בניגוד לדגי זברה, אשכי מדאקה מתמזגים וממוקמים בצורה מדיאלית יותר, ולכן יכול להיות קשה יותר לגשת אליהם על ידי עיסוי בטן, אם כי ישנם דגים אחרים עם אשכים מתמזגים גם כן.

עבור מינים מסוימים, כגון דגי זברה, עדיף לדגום זרע לפני שלדגים יש סיכוי להשריץ בבוקר48 או לבודד זכרים במכלים בודדים בלילה הקודם כדי למנוע השרצה32. עם Hd-rR medaka ממחקר זה, לתנאים סביבתיים כמו תזמון הדגימה (לפני או אחרי ההשרצה) ותנאי הדיור (עם או בלי נקבות במשך חודש אחד) לא הייתה השפעה משמעותית על תנועתיות הזרע (איור 7). ייתכן שגודל מדגם גדול יותר או בידוד זכרים מנקבות לתקופה ארוכה יותר עשויים להניב כמות זרע ו/או תנועתיות גבוהות יותר. בזן CAB medaka ממתקן אחר, מגמה דומה נצפתה עם איכות זרע ונפח טובים יותר מזכרים ששוכנו לבדם בהשוואה לזכרים ששוכנו עם נקבות (מעט מדי דגים נבדקו כדי להסיק מסקנות סטטיסטיות). ניתן היה גם עם דגים אלה לאסוף כמויות גבוהות יחסית של מילט על ידי עיסוי בטן (טבלה משלימה 2), אם כי כמויות קטנות מאוד של מילט התקבלו באמצעות זן Hd-rR medaka, ואחרים דיווחו על נפחים קטנים גם כן באותה טכניקה בזן CAB medaka30. עם זאת, עדיין לא ברור אם הבדלים אלה נובעים מהזן (שהוא זן מסחרי ולא גזעי) או מהבדלים בגידול (ישנם רבים בין המתקנים). בדגים אלה ניתן לאסוף כמה מיקרוליטרים של מילט, מה שמגביל את הזיהום ומשפר את האיכות. אבל, עבור ניסויים שבהם חשוב לחיות יחד את שני המינים, זה לא נראה צורך להפריד אותם כדי להניב תוצאות. זה גם לא נראה צורך לדגום זכרים בכל פעם לפני ההשרצה.

למרות שנדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע בדיוק כיצד זרע מדאקה שונה בהתאם לאוכלוסייה ולגורמים סביבתיים, בכל זאת יש לקחת בחשבון את תנאי המתח והגידול בעת תכנון מערך הניסוי, ויש לנקוט משנה זהירות בהשוואה בין אוכלוסיות המייצרות כמויות זרע שונות. אם מתקבלים נפחים גדולים יותר של מילט, יש להתאים את דילול התמיסה המפעילה (לדוגמה, 1:60, אם כי הריכוז המועדף עשוי להשתנות עם מערכת CASA). באופן דומה, אם האשכים המנותחים גדולים בהרבה מהרגיל (2 מ"ג) בשל תנאי המתח או הגידול, יהיה צורך להגדיל את הדילול כדי שתוכנית CASA תוכל לתייג במדויק את כל תאי הזרע.

שיטות ניתוח הזרע משתנות מאוד עבור medaka והן לעתים קרובות סובייקטיביות, מה שמקשה על השוואת התוצאות בין המחקרים. מחקר שהשווה שיטות סובייקטיביות ואובייקטיביות המשמשות טכנאים עם רמות שונות של מומחיות מצא כי טכנאים מנוסים מאוד יכולים להעריך את תנועתיות זרע הדגים בטווח של 10 נקודות אחוז מהנתונים המסופקים על ידי תוכנית תנועתיות CASA, בעוד שטכנאי ניסיון בינוני ונמוך מעריכים יתר על המידה את ערכי התנועתיות של CASA עם אמפליטודות של עד 30 נקודות אחוז21 . עם זאת, היעדר סטנדרטיזציה לפרמטרים הקובעים תנועתיות במדאקה יכול גם לגרום לשונות בין אלה המשתמשים בשיטות אובייקטיביות יותר. לדוגמה, מחקר אחד שתיעד זרע בקצב של 33 פריימים לשנייה (fps), ניתח 30 פריימים וחשב שזרע נע מהר יותר מ-2 מיקרומטר לשנייה תנועתי היה בעל מהירות ממוצעת של כ-60 מיקרומטר לשנייה ותנועתיות של כ-70% עבור דגי הבקרה שלהם18. במחקר אחר שהשתמש באותו פרוטוקול הייתה מהירות ממוצעת של 40 מיקרומטר לשנייה עבור זרע בקרה ואחוז תנועתיות מעל 80%19. לקבוצה אחרת, שניתחה 200 פריימים ב-47 פריימים לשנייה, היה VCL ממוצע מעל 100 um/s עבור דגי בקרה, אך תנועתיות ממוצעת נמוכה מ-50%. הם לא חשפו אילו פרמטרים קבעו תנועתיות. לכן, בפרוטוקול זה, תוכנת ניתוח זרע בסיוע מחשב משמשת לניתוח זרע באופן אובייקטיבי, מהיר ואמין בהתבסס על קבוצה של פרמטרים שהותאמו אישית למאפייני זרע מדקה. מכיוון שזה קריטי שפרמטרים של תנועתיות יהיו עקביים להשוואות בין מעבדות, התצורה המלאה ששימשה במחקר זה זמינה (איור 2B), כך שחוקרים שונים יכולים לשכפל את הפרוטוקול הזה באופן אמין במעבדה אחרת.

דגי טלוסט מראים מגוון רחב של מאפייני זרע, כך שלמרות שפרוטוקול זה נבדק בתחילה באמצעות הפרמטרים המומלצים של דגי זברה עבור תוכנת SCA Evolution, היה ברור שיש להתאים את הפרמטרים לזרע medaka בעל המהירות הנמוכה יותר, בעל תוחלת החיים הגבוהה יותר. לכן, הפרמטרים של דגי זברה הותאמו למדאקה באמצעות ספרות של מדאקה ומינים אחרים שדיווחו על מאפייני זרע דומים 19,34,35 ובחרו את ערכי הסף המתאימים ביותר להתפלגות של 17,580 מסלולי זרע מנותחים מ -18 פרטים. התנועתיות מבוססת על מהירות עקמומית (VCL) עם < 10 מיקרומטר לשנייה ≤ < איטי 20 מיקרומטר לשנייה ≤ בינוני ≤ 40 מיקרומטר לשנייה < מהיר. זרע נחשב פרוגרסיבי אם מדד ישרות (STR) הוא > 68%. התנועתיות המגדירה את הסף נשמרה על 10 מיקרומטר לשנייה ולא על 2 מיקרומטר לשנייה, כפי שנעשה בספרות מסוימת18,19, שכן זרעונים רבים חסרי תנועת פלגלר תויגו בטעות כתנועתיים עם הגדרה זו. מיני דגים אחרים עם ראשי זרע בגודל דומה (~2 מיקרומטר) השתמשו גם הם ב-10 מיקרומטר לשנייה כדי להגדיר זרע תנועתי35,43. השטח המרבי הצטמצם מהגדרת דגי הזברה של 90 מיקרומטר 2 עד 20 מיקרומטר2 כך שפסולת תאית גדולה מניתוח האשכים תתעלם.

נראה כי משך התנועתיות תלוי בכמות ה-ATP המאוחסנת לפני ההפעלה, שכן תנועת פלגלר דורשת צריכה מהירה של אנרגיה. ככל הנראה בשל תשישות מהירה זו, קיים מתאם בין זרע במהירות התחלתית גבוהה לבין משך קצר יותר של תנועתיות49. בעוד שבדרך כלל נדרש זעזוע אוסמוטי כדי להפעיל זרע דגים, הוא יכול גם להוביל לפגיעה בממברנה במהלך תקופת התנועתיות, מה שיכול להשפיע גם על תוחלת החיים. השפעה זו קריטית יותר במינים של מים מתוקים49, מה שעשוי להסביר מדוע זרע ימי מסוגל להימשך תנועתיות ארוכה יותר (כ-550 שניות בממוצע לעומת כ-150 שניות עבור מיני מים מתוקים), למרות שהוא מפגין מהירות ותנועתיות ממוצעות דומות לאלה של זרע מים מתוקים14,22. משך תנועתיות ארוך מ-30 דקות אינו נפוץ, אך הוא דווח במספר מינים ימיים22,49. למרות היותו דג מים מתוקים, התוצאות עם מדאקה מתאימות לפרופיל הזרע שיש לו מהירות נמוכה יותר ומשך זמן ארוך יותר ממינים ימיים. זה עשוי להיות קשור להפעלה בתווך דומה פלזמה הזרע - ללא הלם אוסמוטי, זרע medaka כנראה לא סובל נזק ממברנה דומה דגי מים מתוקים אחרים.

פתרון שאינו מפעיל וניתוח מהיר מאוד, מתוזמן באופן עקבי לאחר ההפעלה הוא לעתים קרובות הכרחי לניתוח של זרע כי הם תנועתיים רק במשך דקות. עם זאת, תנועתיות זרע מדאקה נמשכת באופן טבעי מספר שעות, ותנועתיות גבוהה יותר עשויה להישמר על-ידי אחסון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או על קרח (איור 6). כך, בניסויים שבהם ניתוח מיידי אינו אפשרי, ניתן לשנות את הפרוטוקול כך, למשל, האשכים מאוחסנים בהפעלת תמיסה על קרח למשך שעה, כל עוד זמן האיסוף נרשם כך שהניתוח יכול להישאר עקבי. עם זאת, לקבלת תוצאות אופטימליות, ניתוח מיידי הוא עדיין האפשרות הטובה ביותר. בעוד שהתנועתיות עדיין פוחתת, מכיוון שהיא הדרגתית, התוצאות מושפעות פחות מהבדלים קלים בזמן הניתוח לאחר ההפעלה. עם זאת, חשוב לדווח הן על טמפרטורת האחסון של דגימות והן על זמן הניתוח לאחר ההפעלה כדי שניתן יהיה להשוות ולשחזר נתונים.

זה גם בדרך כלל חשוב מאוד בדגים כדי למנוע זיהום של milt עם שתן בזמן הדגימה, כמו זה יכול לשנות את osmolality בטרם עת להפעיל את הזרע16,50. עם זאת, זה פחות מדאיג במדאקה (בשל משך הזמן הארוך יותר של תנועתיות) ועם פרוטוקול זה, שכן המדגם ממוקם במדיום ההפעלה באופן מיידי. כמויות נמוכות של מילט נוטות לזיהום בשתן, ולכן ניתן לצפות לשינוי צבע מסוים עם עיסוי בטן ממדאקה כאשר נרכשים נפחים נמוכים. עם זאת, אם זה עקבי באוכלוסייה, אז עדיין ניתן לערוך השוואות בין קבוצות טיפול. יש לנקוט משנה זהירות בהשוואה בין אוכלוסיות של מדאקה המשתנות בנפח או בצבע של מילט.

מכיוון שתוצאות ניתוח הזרע תלויות מאוד בשיטות בהן נעשה שימוש, שיטות מפורטות ואמינות שניתן לחזור עליהן בקלות במעבדות שונות מועילות. זה גם חיוני עבור ניירות לחשוף פרטים על השיטות שלהם כדי לאפשר חזרתיות. כאשר medaka משמש יותר ויותר כמודל לחקר רבייה, גוף המידע לגבי הערכת איכות הזרע חסר. שתי השיטות השונות המתוארות במאמר זה לדגימת זרע עשויות להועיל לניסויים שונים. דיסקציה של האשכים מניבה בדרך כלל תנועתיות גבוהה יותר ומאפשרת חישובי ריכוז יחסי, בעוד שעיסוי בטן יכול להיעשות שוב ושוב על אותו דג והוא ייצוג ביולוגי טהור יותר של אירוע השרצה. כתב יד זה, אם כן, מספק את הפרמטרים עבור CASA, שהיא טכניקה אמינה ואובייקטיבית המספקת נתונים רבים על תנועת הזרע, כולל תנועתיות, התקדמות, מהירות ופרמטרים קינמטיים אחרים. פרוטוקולים אלה יהיו שימושיים אפוא למגוון מחקרים במדאקה, כולל טוקסיקולוגיה, אקולוגיה, רבייה ופיזיולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי האוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים ותוכנית פולברייט האמריקאית. המחברים רוצים להודות לאנתוני פלטייה וללורדס קאריון ג'י טאן מ-NMBU על תחזוקת מתקני הדגים ולגיום גורמלין מ-ISC LPGP ב-INRAE (צרפת) על כך שסיפקו לדגים ולמעבדה שטח לבדיקה נוספת של שיטות אלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tubes Axygen MCT-150-C Any standard brand can be used
10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly Drummond 2-000-010
10x objective with phase contrast Nikon MRP90100
2 mL tubes Axygen MCT-200-c-s Any standard brand can be used
Blunt forceps Fine Science Tools 11000-12
Blunt smooth forceps Millipore XX6200006P
Disposable 20 micron counting chamber slide Microptic 20.2.25  Leja 2 chamber slides
Dissecting microscope Olympus SZX7 Any standard brand can be used
Fine forceps Fine Science Tools 11253-20
HBSS Sigmaaldrich H8264-1L
Holding sponge self-made
Inverted microscope Nikon Eclipse Ts2R
SCA Evolution Microptic
Small dissecting scissors Fine Science Tools 14090-09
Sodium Chloride (NaCl) Sigmaaldrich S9888
Tabletop vortex Labnet C1301B
Tricaine Sigmaaldrich A5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shima, A., Mitani, H. Medaka as a research organism: past, present and future. Mechanisms of Development. 121 (7-8), 599-604 (2004).
  2. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka - a model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2001).
  3. Kasahara, M., et al. The medaka draft genome and insights into vertebrate genome evolution. Nature. 447 (7145), 714-719 (2007).
  4. Matsuda, M., et al. DMY is a Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish. Nature. 417 (6888), 559-563 (2002).
  5. Sakamoto, T., Kozaka, T., Takahashi, A., Kawauchi, H., Ando, M. Medaka (Oryzias latipes) as a model for hypoosmoregulation of euryhaline fishes. Aquaculture. 193 (3-4), 347-354 (2001).
  6. Royan, M. R., et al. 3D atlas of the pituitary gland of the model fish medaka (Oryzias latipes). Frontiers in Endocrinology. 12, 719843 (2021).
  7. Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. Healthy brain-pituitary slices for electrophysiological investigations of pituitary cells in teleost fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
  8. Fontaine, R., Weltzien, F. -A. Labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
  9. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  10. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. Journal of Visualized Experiments. (46), e1937 (2010).
  11. Wiley-Blackwell. Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. , Wiley-Blackwell. (2019).
  12. Royan, M. R., et al. Gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (Oryzias latipes). Journal of Visualized Experiments. (166), e62006 (2020).
  13. Bhat, I. A., et al. Testicular development and spermatogenesis in fish: insights into molecular aspects and regulation of gene expression by different exogenous factors. Reviews in Aquaculture. 13 (4), 2142-2168 (2021).
  14. vander Horst, G., Garcia Alvarez, O., Garde, J. J., Soler, A. J., Jones, D. Status of sperm functionality assessment in wildlife species: From fish to primates. Animals. 11 (6), 1491 (2021).
  15. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 130 (4), 425-433 (2001).
  16. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234 (1-4), 1-28 (2004).
  17. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm motility initiation and duration in a euryhaline fish, medaka (Oryzias latipes). Theriogenology. 72 (3), 386-392 (2009).
  18. Hashimoto, S., et al. Effects of ethinylestradiol on medaka (Oryzias latipes) as measured by sperm motility and fertilization success. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 56 (2), 253-259 (2009).
  19. Hara, Y., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 53 (3), 406-410 (2007).
  20. Kawana, R., Strüssmann, C. A., Hashimoto, S. Effect of p-Nonylphenol on sperm motility in Japanese medaka (Oryzias latipes). Fish Physiology and Biochemistry. 28, 213-214 (2003).
  21. Gallego, V., Herranz-Jusdado, J. G., Rozenfeld, C., Pérez, L., Asturiano, J. F. Subjective and objective assessment of fish sperm motility: when the technique and technicians matter. Fish Physiology and Biochemistry. 44 (6), 1457-1467 (2018).
  22. Browne, R. K., et al. Sperm motility of externally fertilizing fish and amphibians. Theriogenology. 83 (1), 1-13 (2015).
  23. Arias Padilla, L. F., et al. Cystic proliferation of germline stem cells is necessary to reproductive success and normal mating behavior in medaka. eLife. 10, 62757 (2021).
  24. Okuyama, T., Yokoi, S., Takeuchi, H. Molecular basis of social competence in medaka fish. Development, Growth, and Differentiation. 59 (4), 211-218 (2017).
  25. Okubo, K., et al. Forebrain Gonadotropin-releasing hormone neuronal development: Insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  26. Hodne, K., Fontaine, R., Ager-Wick, E., Weltzien, F. A. Gnrh1-induced responses are indirect in female Medaka Fsh cells, generated through cellular networks. Endocrinology. 160 (12), 3018-3032 (2019).
  27. Karigo, T., et al. Whole brain-pituitary in vitro preparation of the transgenic Medaka (Oryzias latipes) as a tool for analyzing the differential regulatory mechanisms of LH and FSH release. Endocrinology. 155 (2), 536-547 (2014).
  28. Kowalska, A., Kowalski, R., Zakęś, Z. The effect of selective cyclooxygenase (COX) inhibitors on japanese medaka (Oryzias latipes) reproduction parameters. World Academy of Science, Engineering and Technology. 77, 19-23 (2011).
  29. Kowalska, A., Siwicki, A. K., Kowalski, R. K. Dietary resveratrol improves immunity but reduces reproduction of broodstock medaka Oryzias latipes (Temminck & Schlegel). Fish Physiology and Biochemistry. 43 (1), 27-37 (2007).
  30. Tan, E., Yang, H., Tiersch, T. R. Determination of sperm concentration for small-bodied biomedical model fishes by use of microspectrophotometry. Zebrafish. 7 (2), 233-240 (2010).
  31. Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Canadian Journal of Zoology. 60 (8), 1867-1870 (1982).
  32. Wasden, M. B., Roberts, R. L., DeLaurier, A. Optimizing sperm collection procedures in Zebrafish. Journal of the South Carolina Academy of Science. 15 (2), 7 (2017).
  33. Draper, B. W., Moens, C. B. A High-throughput method for Zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  34. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis. Fertility and Sterility. 96 (1), 24-27 (2011).
  35. Acosta, I. B., et al. Effects of exposure to cadmium in sperm cells of zebrafish, Danio rerio. Toxicology Reports. 3, 696-700 (2016).
  36. Wilson-Leedy, J. G., Kanuga, M. K., Ingermann, R. L. Influence of osmolality and ions on the activation and characteristics of zebrafish sperm motility. Theriogenology. 71 (7), 1054-1062 (2009).
  37. Alavi, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review. Cell Biology International. 30 (1), 1-14 (2006).
  38. Kowalska, A., Kamaszews ki, M., Czarnowska-Kujawska, M., Podlasz, P., Kowalski, R. K. Dietary ARA improves COX activity in broodstock and offspring survival fitness of a model organism (Medaka Oryzias latipes). Animals. 10 (11), 2174 (2020).
  39. Inoue, K., Takei, Y. Asian medaka fishes offer new models for studying mechanisms of seawater adaptation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 136 (4), 635-645 (2003).
  40. Zadmajid, V., Myers, J. N., Sørensen, S. R., Ernest Butts, I. A. Ovarian fluid and its impacts on spermatozoa performance in fish: A review. Theriogenology. 132, 144-152 (2019).
  41. Poli, F., Immler, S., Gasparini, C. Effects of ovarian fluid on sperm traits and its implications for cryptic female choice in zebrafish. Behavioral Ecology. 30 (5), 1298-1305 (2019).
  42. Cosson, J., Groison, A. L., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C., Billard, R. Studying sperm motility in marine fish: An overview on the state of the art. Journal of Applied Ichthyology. 24 (4), 460-486 (2008).
  43. Beirão, J., Soares, F., Herráez, M. P., Dinis, M. T., Cabrita, E. Sperm quality evaluation in Solea senegalensis during the reproductive season at cellular level. Theriogenology. 72 (9), 1251-1261 (2009).
  44. Beirão, J., et al. Sperm handling in aquatic animals for artificial reproduction. Theriogenology. 133, 161-178 (2019).
  45. Yang, H., Tiersch, T. R. Current status of sperm cryopreservation in biomedical research fish models: Zebrafish, medaka, and Xiphophorus. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 149 (2), 224-232 (2009).
  46. Yang, H., Tiersch, T. R. Sperm cryopreservation in biomedical research fish models. Cryopreservation in Aquatic Species. 2, 439-454 (2011).
  47. Viveiros, A., Fessehaye, Y., ter Veld, M., Schulz, R., Komen, H. Hand-stripping of semen and semen quality after maturational hormone treatments, in African catfish Clarias gariepinus. Aquaculture. 213 (1-4), 373-386 (2002).
  48. Ransom, D. G., Zon, L. I. Appendix 3 collection, storage, and use of Zebrafish sperm. Methods in Cell Biology. 60, 365-372 (1998).
  49. Cosson, J. Frenetic activation of fish spermatozoa flagella entails short-term motility, portending their precocious decadence. Journal of Fish Biology. 76 (1), 240-279 (2010).
  50. Kowalski, R. K., Cejko, B. I. Sperm quality in fish: Determinants and affecting factors. Theriogenology. 135, 94-108 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 188 גונדות זרע מילט אשכים מדאקה דגים רבייה קאזה
איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (<em>Oryzias latipes</em>)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. … More

Closs, L., Sayyari, A., Fontaine, R. Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes). J. Vis. Exp. (188), e64326, doi:10.3791/64326 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter