Summary
この記事では、小型モデル魚メダカ(Oryzias latipes)から精子を採取するための2つの迅速かつ効率的な方法と、コンピューター支援精子分析(CASA)を使用して精子の質を確実に評価するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
日本のメダカ(Oryzias latipes)は、硬骨魚であり、生態毒性学、発生学、遺伝学、生理学の研究のための新しい脊椎動物モデルです。メダカは脊椎動物の繁殖を調べるためにも広く使用されており、これは種が永続することを可能にするため、不可欠な生物学的機能です。精子の質は男性の生殖能力、したがって生殖の成功の重要な指標です。精子を抽出するための技術と精子分析は、硬骨魚を含む多くの種について十分に文書化されています。精子の採取は、大きな魚では比較的簡単ですが、小さなモデル魚では精子が少なく、繊細であるため、より複雑になる可能性があります。そこで本稿では、小型モデル魚であるメダカの精子採取方法について、精巣解離と腹筋マッサージの2つについて述べる。本稿では、メダカに対して両方のアプローチが実行可能であることを示し、魚が手順からすぐに回復するため、腹部マッサージを何度も繰り返し実行できることを示しています。この記事では、メダカの精子の質のいくつかの重要な指標(運動性、進行性、運動持続時間、相対濃度)を客観的に評価するための、メダカでのコンピューター支援精子分析のプロトコルについても説明します。この有用な小型硬骨動物モデルのために指定されたこれらの手順は、脊椎動物の男性の生殖能力に影響を与える環境的、生理学的、および遺伝的要因の理解を大幅に強化します。
Introduction
日本のメダカは、東アジア原産の小さな産卵淡水硬骨魚です。メダカは、生態毒性学、発生遺伝学、ゲノミクス、進化生物学および生理学研究のための優れた脊椎動物モデルシステムになりました1,2。人気のあるゼブラフィッシュと同様に、それらは比較的繁殖しやすく、多くの一般的な魚の病気に対して非常に耐性があります1,2。メダカをモデルとして使用することには、世代時間が短い、透明な胚1,2、配列決定されたゲノム3など、いくつかの利点があります。ゼブラフィッシュとは異なり、メダカは性決定遺伝子4と高温(4〜40°C)および塩分(ユーリハリン種)耐性5を持っています。また、多くの遺伝的および解剖学的ツール、ならびにプロトコル6,7,8,9,10,11,12がメダカで開発され、その生物学の研究を容易にする。
生殖は、種が永続することを可能にするため、不可欠な生理学的機能です。脊椎動物の繁殖には、雌の卵母細胞の産生や雄の精子の産生など、正確に調整された無数のイベントが必要です。精子は、精子形成の複雑なプロセスを通じて生成されるユニークな細胞であり、高品質の製品の配送を保証するためにいくつかのチェックポイントがあります13。配偶子の品質は、受精の成功と幼虫の生存に影響を与えるため、水産養殖と魚の個体数研究の焦点となっています。したがって、精子の質は脊椎動物の男性の生殖能力の重要な指標です。
魚の精子の質を評価するための3つの有用な要素は、運動性、進行性、および寿命です。運動率と進行性運動性は、漸進的な運動が受精の成功に必要であり、強く相関しているため、精子の質の一般的な指標です14,15。ほとんどの硬骨魚種で精子が2分未満完全に運動したままであり、精子の軌跡は一般に哺乳類よりも直線的ではないため、移動時間も魚の重要な指標です15。しかし、過去に精子の運動性を評価した多くの研究は、精子を分析する主観的または半定量的方法に依存していました15,16。例えば、メダカの精子運動性は、過去に顕微鏡下で目視で推定されてきた17。また、精子の動きを記録し、イメージングソフトウェアを使用してフレームをマージし、遊泳経路と速度を測定することによって推定されています18,19,20。そのようなアプローチはしばしば堅牢性を欠き、分析を実行する人に応じて異なる結果を提供する15,21。
コンピュータ支援精子分析(CASA)は、当初哺乳類向けに開発されました。CASAは、速度と軌跡を自動化された方法で記録および測定することにより、精子の質を評価するための迅速な定量的方法です15。魚類では、精子の質に対するいくつかの水質汚染物質の影響を監視し、家畜を改善するための興味深い前駆細胞を特定し、凍結保存と貯蔵の効率を改善し、受精の条件を最適化するために、さまざまな種で使用されてきました15。したがって、さまざまな脊椎動物種の精子の品質を確実に評価するための強力なツールです。しかし、魚類間の繁殖戦略の重要な多様性のために、硬骨魚の精子は哺乳類の精子とは異なり、魚種ごとに異なります。配偶子を水中に放出することによって主に卵子を外部から受精させる硬骨魚は、内部で受精するため、水中での希釈を補う必要はありませんが、より粘性のある液体に耐える必要がある哺乳類とは異なり、先体のない構造が比較的単純な高濃度の精子を持っています14。さらに、ほとんどの魚の精子は急速に動きますが、活性化後2分未満は完全に運動しますが、いくつかの例外があります15,22。ほとんどの魚で運動性が急速に低下する可能性があるため、魚の精子分析プロトコルを決定する際には、活性化後の分析のタイミングに細心の注意を払う必要があります。
生殖は生物学の中でも、硬骨魚やメダカがモデル生物として広く利用されてきた分野の一つです。確かに、メダカの男性は、配偶者を守る23,24など、興味深い生殖行動と社会的行動を示します。さらに、この種の生殖の神経内分泌制御を研究するために、いくつかのトランスジェニック系統が存在する25,26,27。精子サンプリングは、大きな魚では比較的簡単な手順ですが、小さなモデル魚では精子が少なく、繊細であるため、より複雑になる可能性があります。このため、メダカ抽出物白子(魚精液)における精子採取を含むほとんどの研究は、解剖精巣を粉砕することによって17、28、29、30である。いくつかの研究では、整形腹部マッサージを使用して、白子を活性化培地に直接表現しています18,19,20;しかし、この方法では、抽出された白子の量と色を視覚化することは困難です。ゼブラフィッシュでは、腹部マッサージは白子を表現するために一般的に使用され、これは直ちに毛細管31、32、33に集められる。この方法は、白子の体積の推定、ならびに精子の質の迅速かつ簡単な指標である射精色の観察を可能にする32,33。したがって、精子の収集と分析のための明確でよく記述されたプロトコルは、メダカには欠けています。
そこで本稿では,小型モデル魚メダカにおける精巣郭清と毛細血管による腹式マッサージの2つの精子採取方法について述べる.これは、両方のアプローチがメダカにとって実行可能であることを示し、魚が手順からすぐに回復するため、腹部マッサージを何度も繰り返すことができることを示しています。また、メダカの精子の質(運動性、進行性、寿命、および相対的な精子濃度)のいくつかの重要な指標を確実に測定するためのメダカでのコンピューター支援精子分析のプロトコルについても説明します。この有用な小型硬骨動物モデルのために指定されたこれらの手順は、脊椎動物の男性の生殖能力に影響を与える環境的、生理学的、および遺伝的要因の理解を大幅に強化します。
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Protocol
すべての実験と動物の取り扱いは、ノルウェー生命科学大学(NMBU)の実験動物福祉に関する推奨事項に従って実施されました。実験は、NMBU(ノルウェー、オース)で飼育された成体(6〜9ヶ月齢)のオスの日本メダカ(Hd-rR株)を用いて行った。また、国立研究開発法人農業・食品・環境研究所(INRAE、フランス、レンヌ)で飼育した生後9ヶ月のオスのメダカ(CAB株)でも簡単に試験した。
1. 装置と溶液の調製
- 麻酔薬ストック溶液(0.6%トリカイン)を準備します。
- 0.6 gのトリカイン(MS-222)を100 mLの10xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈します。
- 2 mLの麻酔薬ストック溶液を50 2 mLプラスチックチューブに分注し、麻酔または安楽死に使用するまで-20°Cで保存します。
- 回収水(0.9%塩化ナトリウム[NaCl]溶液)を準備します。
- 27 gのNaClを3 Lの水槽水に加えます。
- 使用するまで室温(RT)で溶液を保管してください。
- 必要に応じて活性化培地を調整します(ハンクの平衡塩溶液[HBSS])。
注:HBSSは、商業的に購入することも、実験室で製造することもできます(材料表)。- pHメーターを使用してHBSSのpHを測定します。必要に応じて塩酸または水酸化ナトリウムを使用してpHを調整し、最終的なpHが7.1〜7.3になるようにします。
- 将来の報告のために、浸透圧計を使用してHBSSの浸透圧を測定します。
注:市販製品の範囲は266-294 mOsmol / kgです。現在の研究では、浸透圧は287mOsmol / kgでした。必要に応じて蒸留水で希釈して浸透圧を下げることもできますが、150〜300 mOsmol / kg HBSSではメダカ精子の活性化に大きな差がないため、これは必要ありません。 - 使用するまでRTで溶液を保管してください。
- 保持スポンジを準備します。
- 柔らかいスポンジをペトリ皿にぴったりと収まるように切ります。
- スポンジの中央に、魚を受け入れるのに十分な長さ(3〜4 cm)、深さ約1 cmの直線を切ります(図1A)。スポンジのこのスリットは、魚の腹側を上にしてクロアカを露出させます。
2.精子採取
注:精子の収集は、腹部マッサージまたは精巣解剖の2つの異なる方法で達成できます。
- 腹部マッサージによる精子採取
- 1本のチューブのトリカインストック(0.6%)を100 mLのガラス容器内の38 mLの水槽水で希釈することにより、0.03%麻酔液を調製します。
- 平滑端平滑鉗子、10 μLの使い捨て校正済みガラスマイクロピペットおよびアスピレーターチューブアセンブリを含む機器を準備します(図1A)。手順1.4で準備した保持スポンジを麻酔液で湿らせます。
- すぐに分析できるように、36 μLの活性化溶液でチューブを準備します。活性化溶液を27°Cに設定された水浴またはインキュベーターで少なくとも5分間予熱します。
注:サンプルは個々の魚から分析できますが、同じ活性化溶液に複数のオスからのサンプルをプールすることで、個体差を減らすことができます。複数の魚からのサンプルをプールする場合は、魚ごとに36 μLの活性化溶液を使用します。この希釈は、精子の濃度や量に影響を与える可能性があるため、使用するメダカのひずみや飼育条件に応じて調整する必要があります。CASAプログラムは、濃度が高すぎて精子を特定できないかどうかを示します。 - 魚を麻酔液に30〜90秒間入れて麻酔します。
注:麻酔時間は魚のサイズによって異なるため、調整する必要があります。魚が完全に麻酔されていることを確実にするために、鉗子で尾の茎をそっとつまみます。魚が反応しない場合は、マッサージを開始できます。 - 麻酔液から魚を取り出し、ペーパータオルを使用するか、そっと拭いて魚の腹部を乾かします。湿った保持スポンジの腹側を上にして、魚の谷がスポンジの麻酔液にさらされるように、魚を置きます(図1B)。
- クロアカの周りが濡れている場合は、使い捨てのティッシュワイプで魚の下側をそっと乾かします。
- 解剖顕微鏡下で魚を保持スポンジに入れ、魚のクロアカにアスピレーターチューブを取り付けたマイクロピペットを置きます(図1C)。
- 鈍い端の滑らかな鉗子で吻側から尾側への動きでそっと絞ると同時に、排出された白子をピペットに集めるために吸いながら、魚の腹部をマッサージします(図1D)。
- 魚をスポンジから回収水に放します。水槽システムに戻す前に、少なくとも15分間溶液中で回復させてください。
- 白子を予熱した活性化溶液を入れた準備されたチューブに移し、アスピレーターチューブアセンブリを吸ったり吹いたりして数回上下にピペットします。
- 分析前にチューブをフリックして、希釈した精子を穏やかに均質化します。
注意: 最良の結果を得るには、アクティベーション後すぐに(たとえば、5秒)サンプルを分析してください。メダカでは、精子が数時間運動性を維持するため、必要に応じて分析を遅らせることがありますが、運動性は時間とともに低下するため、サンプル間で時間は一定である必要があります。
- 精巣解剖による精子採取
- 100 mLガラス容器中の2本のチューブのトリカインストック(0.6%)を26 mLの水槽水で希釈することにより、0.08%安楽死溶液を調製します。
- 鈍くて細かい鉗子や小さな解剖ハサミなどの解剖ツールを準備します(図1E)。
- 即時分析のために、120 μLの活性化溶液を含む各サンプル用のチューブを準備します。活性化溶液を27°Cに設定された水浴またはインキュベーターで少なくとも5分間予熱します。
注:サンプルは個々の魚から分析できますが、同じ活性化溶液に複数のオスからのサンプルをプールすることで、個体差を減らすことができます。複数の魚からのサンプルをプールするには、魚ごとに120 μLの活性化溶液を使用します。この希釈は、精子の濃度や量に影響を与える可能性があるため、使用するメダカのひずみや飼育条件に応じて調整する必要があります。CASAプログラムは、濃度が高すぎて精子を特定できないかどうかを示します。 - 魚を0.08%麻酔液に30〜90秒間入れて安楽死させます。
注:期間は魚のサイズによって異なります。魚が安楽死させられることを確実にするために、オペラキュラムの動きが止まるのを待ちます。魚は鉗子のタッチに反応してはいけません。 - 安楽死液から魚を取り除き、ペーパータオルで魚をやさしく乾かすか、やさしく拭きます。
注:このステップでは、魚の体重を量って、後で性腺体指数(GSI、生殖腺重量/体重)を計算することができます。 - 魚を解剖顕微鏡の下に置き、左側の側面を上に向けています(図1F)。
- 小さな解剖ハサミを使用して、クロアカから背側のフラップを切り取り、次に肋骨を横切ってえらまで内臓を露出させます(図1G)。
- 精巣を見つけ、両端のアタッチメントを細かい鉗子で切断し、精巣を取り外します(図1H)。
注:GSIを計算するために、このステップで精巣を計量することができます。組織の乾燥を避けるために迅速に作業してください。 - 予熱した活性化溶液と共に調製したチューブに精巣を移す。
- 鉗子を使用して精巣をチューブの側面に対して数回押しつぶし、精子を放出します。精子の放出は通常視覚化することができ、溶液をわずかに曇らせます。
- 分析前にチューブをフリックして、希釈した精子を穏やかに均質化します。
注意: 最良の結果を得るには、アクティベーション後すぐに(たとえば、5秒)サンプルを分析してください。メダカでは、精子が数時間運動性を維持するため、必要に応じて分析を遅らせることがありますが、運動性は時間とともに低下するため、サンプル間で時間は一定である必要があります。
図1:腹部マッサージ(A-D)と精巣解剖(E-H)による白子採取 。 (A)腹部マッサージ用器具:スポンジ、鈍い滑らかな鉗子、およびアスピレーターチューブアセンブリを備えた10μLの使い捨て校正済みガラスマイクロピペットを保持します。(B)保持スポンジ内の魚の位置、スポンジ内の麻酔にさらされた鰓、およびクロアカが上を向いている。(C)腹部の鈍い滑らかな鉗子の位置とクロアカに対するマイクロピペット。(D)穏やかなマッサージと吸引後のマイクロピペットで白子。(E)精巣解剖用器具:鈍器鉗子、細鉗子、および小型解剖ハサミ。(F)精巣解剖のための魚の位置。(G)内臓の側面図。(h)両端のアタッチメントを細かい鉗子で切って精巣を取り除きます。スケールバー:2 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. CASAシステムによる精子分析
- CASAシステム(SCA Evolution)は、緑色のフィルターを使用した顕微鏡と位相差のある10倍の対物レンズを使用して、マニュアルに従ってセットアップする必要があります。
- 使い捨ての20 μm計数チャンバースライドを、加温プレートまたは27°Cに設定されたインキュベーターで少なくとも5分間予熱して準備します。
- 精子分析ソフトウェアを開き、運動性モジュールを選択します。
- メダカの構成を 図2Bのように設定します。
- 予熱した使い捨ての20 μm計数チャンバースライドを、27°Cに設定された加熱ステージ上に顕微鏡下に置きます。
- サンプルをスライド上のチャンバーにピペットで入れ、過充填せずにチャンバーを満たします。チャンバーの入り口から余分なサンプルを綿の先端で慎重に拭き取るか、細胞の浮遊を防ぐためにそっと拭きます。
- [ 分析] を選択して、顕微鏡でサンプルを確認します。
注意: 顕微鏡アイコンが赤の場合、精子を正確に追跡するために、プログラムが顕微鏡の照明を調整する必要があります。顕微鏡の明るさを調整して、精子の尾の動きがはっきりと見えるようにします。アイコンは青色である必要があります。 - 顕微鏡の焦点が合っていることを確認し、もう一度 [分析] を選択して、フィールドの精子を記録します。サンプルの新しい領域がフレーム内になるようにスライドを移動し、繰り返して3〜5の異なる視野をキャプチャします。気泡、細胞塊、またはアーチファクトのあるフィールドは避けてください。
- [ 結果 ] を選択して結果を表示します。
注: 結果ページのフィールドが赤で囲まれている場合は、システムの指示に従って、濃度または運動性が大きく異なるフィールドを削除します。 - フィールドをダブルクリックして、個々のフィールドの結果を表示するか、ラベル付けされていない精子や追跡されていない精子を手動で確認します。必要に応じて、個々の精子を右クリックして運動性を再ラベル付けします(図2A)。
図2:SCAエボリューションソフトウェアのスクリーンショット 。 (A)1つのフィールドの精子追跡結果。右側のフィールドデータを表示し、精子をダブルクリックして個々のデータを表示します。(B) 設定メニューが開いているすべてのフィールドの結果の概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
取得するデータの種類
SCA Evolutionソフトウェアの精子運動性分析は、運動性(運動性および不動性の精子の割合)、および進行性(進行性および非進行性の精子の割合)、および速度(急速、中、およびゆっくりと動く精子の割合)に関するデータを提供します。また、プログレッシブと速度(ラピッドプログレッシブ、ミディアムプログレッシブ、非プログレッシブ)を兼ね備えています。これらのラベルは、プログラムによって提供される精子運動の測定(図3A)および計算(図3B)に基づいています(補足表1)。メダカについては、先行文献19,34,35に基づく推奨ゼブラフィッシュパラメータと18個体のメダカデータの分布から以下の閾値を適合させた。運動性は曲線速度(VCL)に基づいており、不動<10 μm/s≤低速<20 μm/s≤中≤40 μm/s<高速です。真直度指数(STR)が68%>場合、精子は進行性と見なされます。
SCA Evolutionは、サンプルの体積と希釈率を提供した場合の精子の濃度も計算します。腹部マッサージ法は、着色を可視化し、白子の存在を確認するのに役立ちますが、採取量が小さすぎて正確に測定できません。飼育条件や異なる菌株の使用によりミルト量が改善され、測定できる場合は、プログラムを使用して濃度を算出できます。ただし、精巣全体を解剖して同じ量の液体で希釈する限り、精巣解剖によって採取されたサンプルについて魚または治療群を比較するために相対濃度を計算することもできます。
図3:精子の動きの解析。 (A)CASAシステムによって記録されたデータには、曲線速度(VCL、実際の経路に沿った距離を使用して計算された速度)、平均経路速度(VAP、平均経路の距離を使用して計算された速度)、直線速度(VSL、精子トラックの開始と終了の間の距離を使用して計算された速度)、 横方向の頭部変位の振幅(ALH、その平均経路に関する精子頭部の横方向変位の大きさ)、ビート交差周波数(BCF、曲線経路が平均経路を横切る速度)。(B)CASAシステムからの計算値には、真直度指数(STR、平均経路の直線性)、直線性指数(LIN、曲線経路の直線性)、およびウォブル(WOB、平均経路に関する実際の経路の振動)が含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
精子の運動性評価:さまざまな活性化ソリューション
驚くべきことに、腹部マッサージと精巣解離の両方でサンプリングされた精子は、水槽水(16 mOsmol / kg)(図4A)およびNaCl溶液で34 mOsmol / kgに調整された水槽水中で不動でした。また、脱イオン水(-1 mOsmol/kg)や23 mOsmol/kgに調整した脱イオン水にも運動性は認められなかった。精子はHBSS(287 mOsmol/kg)(図4B)および脱イオン水で36 mOsmol/kgおよび113 mOsmol/kgに希釈したHBSSで運動性を示したが、運動率は36 mOsmol/kgで有意に低下した(図4C)。
図4:活性化溶液の浸透圧による運動性。 精巣解剖によってサンプリングされた精子は、(A)水槽水(16 mOsmol / kg)および(B)未調整HBSS(287 mOsmol / kg)でサンプリングされます。黄色の円は不動の精子にラベルを付け、色付きの線は精子の動きを示します:赤(急速な進行)、緑(中程度の進行)、青(非進行)。スケールバー:100μm。 (C)HBSSで活性化された精子の運動性は36、113、および287 mOsmol/kg H2Oです。36と113の場合、n = 4で、サンプルごとに2匹の魚がプールされています。287の場合、n = 9で、サンプルごとに2匹の魚がプールされています。統計分析は、TUKEY事後検定を伴うANOVAを使用して実行され、有意差は異なる文字で示されています。データはSEM±平均値として表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
サンプリング方法:腹部マッサージと精巣解剖
精巣解剖によってサンプリングされた精子は、同じ魚からの腹部マッサージサンプルと比較して有意に運動性が高い(図5A)。運動性精子のうち、より高い割合はまた進行性であり、中程度または速速移動である。腹部マッサージによってサンプリングされた精子では、より多くの運動性精子は動きが遅く、進行性がありません(図5B-C)。但し、異なる系統のメダカ(CAB)や代替飼育条件を用いることで異なる結果が得られる場合がある(補足表2)。
図5:腹部マッサージと精巣解離。 (A)腹部マッサージまたは精巣解離によってサンプリングされた不動性および運動性の精子の割合。(B)非進行性および進行性の精子、および(C)低速、中程度、および急速な動きの運動性精子の割合。すべての精子サンプルはHBSS(287 mOsmol / kg H2O)で活性化されました。統計解析はマン・ホイットニーU検定を用いて行い、有意差はアスタリスクで示した。データはSEM±平均値として表され、n = 9である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
保管条件に応じた運動持続時間
精巣解剖によってサンプリングされ、27°Cに維持された精子は、活性化後最初の30分間で運動性の50%の減少を有していた。2.5時間後、精子の5%未満が運動性であった。4°Cで保存した場合、最初の30分間で運動性はわずか14%減少し、最初の運動性から50%低下するまでに5時間かかりました。氷も同様の伸長効果がありましたが、効果が低く、最初の30分間で運動性が26%低下しました(図6A)。進行性も氷上での最初の30分間で52%低下しましたが、27°Cでは65%、4°Cでは33%でした(図6B)。氷上と4°Cの両方で、一部の精子(<3%)は活性化後42時間も動いていました。
図6:保存条件による精子の寿命。HBSS(287 mOsmol/kg H2O)で活性化され、27°C、4°C、または氷上で保存されたサンプルの(A)運動性および(B)経時的な進行性の割合。データポイントはSEM±平均値であり、n = ≥4である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
環境と住宅条件の重要性
雌と共同飼育された雄は、産卵の機会を得る前(ライトが点灯する前)またはライトが点灯し、水槽内の雌が卵を産んだ後の朝に精巣解剖によってサンプリングされました。精子の運動性に有意差はなかった。雌を1ヶ月間飼育した雄もサンプリングされ、運動性が高い傾向はあったものの、その差も有意ではなかった(図7)。
しかし、CAB株メダカをオスとメスを分けた別の施設で1ヶ月以上飼育したところ、魚は大きくなり、腹部マッサージで5〜7μLの白子を採取した。腹部マッサージで5匹の魚から採取したサンプルは、300 mOsmol/kg HBSSで活性化した場合、68.34%の運動性を示しました。同じ条件でメスで飼育した場合、白子採取量は約2μLであり、平均運動性はオス3人で46.2%でした(補足表2)。
図 7.精子の運動性に対する環境条件の影響。 雌と共同飼育された雄からの産卵前(n = 5)および産卵後(n = 4)の精子、および雌なしで飼育された雄からの精子(n = 6)の運動性の割合。すべてのサンプルを精巣解剖によってサンプリングし、HBSS(287 mOsmol/kgH2O)で活性化しました。統計解析は t検定を用いて行い、差は有意ではなかった。データはSEM±平均値として示され、円は個々の魚を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:腹部マッサージおよび精巣解離によってサンプリングされた精子の平均速度および運動計算(n = 9)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:フランス・レンヌのINRAEで飼育されたCAB株(カルビオとも呼ばれる)メダカの精子分析データ。 すべてのサンプルは300 mOsmol/kg HBSSで活性化されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
浸透圧は、魚の精子の活性化における重要な要素です36,37。一般に、精子は精巣内で不動であり、海産魚では精液に対して高浸透圧性であり、淡水魚では精液に対して低浸透圧性である培地中で運動性になる37。血液と同様に、淡水魚の精漿は通常、海産魚の精漿よりも低い(400 mOsmol / kgと比較して約300 mOsmol / kg)22,37。したがって、魚の精子は通常、それらが住んでいる水と接触すると活性化され、この水は精子分析のための最良かつ最も生物学的活性化培地として機能します。しかし、腹部マッサージと精巣解離によってサンプリングされたメダカ精子は、2つの異なる実験室で飼育されたHd-rRまたはCAB株メダカの水槽水中では運動しませんでした(図4A)。さらに、運動性は36 mOsmol/kg HBSSよりも287 mOsmol/kg HBSSの方が高く(図4C)、淡水魚としては珍しいものでした。
メダカの精子分析に関する以前のほとんどの研究では、浸透圧について議論することなく、メダカ精子の活性化培地としてHBSS 28,29,38または山本溶液18,19を使用していました。HBSSはメダカ精子にとって優れた活性化培地ですが、浸透圧の変動は運動性に影響を与える可能性があります。したがって、精子分析研究では、実験間の比較のために活性化溶液の浸透圧を開示することが不可欠です。活性化培地の理想的な浸透圧を調査したある研究では、メダカ精子は脱イオン水(25 mOsmol / kg)およびHBSSで運動性であり、浸透圧値は686 mOsmol / kg<、運動性は25〜227 mOsmol / kgの間で最も高いことがわかりました17。しかし、現在の研究では、精子は脱イオン水でも運動しませんでした。ユーリハリン魚として、メダカはさまざまな環境に非常に適応し、塩水でも生きて繁殖することができるため39、さまざまな飼育条件がこの不一致の原因である可能性があります。興味深いことに、淡水魚の標準的な精子活性化培地であるにもかかわらず、水槽水(または熟成水道水などの同様のもの)でメダカ精子の運動性をテストした報告は他にありません。
メダカにおけるこの非定型の精子活性化の考えられる説明の1つは、卵巣液との相互作用です。魚の精子は通常周囲の水で活性化されますが、卵巣液は多くの種で精子の運動性の持続時間を延長または延長します40,41。メダカは淡水魚を外部から受精させていますが、ひれの巻き付けや震えを含む産卵行動は、放送産卵者よりもはるかに近接しています23。淡水魚の卵巣液の浸透圧(約300mOsmol/kg)はHBSS40に近いため、雌が放出した体液が水槽の水ではなく精子を活性化している可能性があります。精漿と卵巣血漿の浸透圧は類似しているので、メダカ卵巣液のイオン組成が重要な役割を果たす可能性があります40,42。メダカ精子の活性化における卵巣液とイオンの役割は、さらなる調査が必要です。
以前の研究では、メダカ精子は、解剖された精巣を粉砕することによってのみ収集されました17,28,29,30または腹部マッサージによって白子を活性化培地に直接発現させる18,19,20;腹部マッサージによって毛細血管に集められた精子のデータを報告した研究はありませんが、ゼブラフィッシュや他の硬骨魚では一般的な方法です33,43,44。この方法はメダカでも実現可能です。白子は毛細管内で容易に可視化され、体積が小さすぎて正確に測定できないが、この方法は品質の迅速な指標として色の収集と分析の成功を確認することができる32。糞便汚染の回避は、培地よりも毛細管に集めた方が簡単です。精巣解離で採取した精子検体は、腹式マッサージで採取した精子よりもメダカの運動性が高く(図5)、魚を屠殺する実験には好ましいが、腹部マッサージは安楽死を必要としない低侵襲手術であり、同じ魚で繰り返すことができる。そのため、同じ魚を経時的に追う実験に役立ちます。また、腹部マッサージで収集されたサンプルには、精漿44で放出された成熟細胞のみが含まれ、精巣解剖からのサンプルには、未熟な精子細胞やその他の破片が含まれる場合があります。CASAシステムは、最大面積よりも大きい丸いセルと破片を割り引いていますが、このパラメータの設定が高すぎると、運動性の結果に影響を与える可能性があります。
これらのメダカでは、腹部マッサージで採取した精子の量が少ないため、毛細血管内の精子量を正確に測定することはできず、通常のアプローチで精子濃度を計算することは不可能でした。しかし、精巣解剖によって採取されたサンプルについては、活性化培地の体積を一定に保ち、精巣を秤量することにより、CASAシステムによって与えられた精子濃度に基づいて相対濃度を計算し、個人間または治療群間で比較することができる。品質分析に加えて、相対濃度は凍結保存に最適なサンプル希釈を決定するのにも役立ちます。飼育条件や別の菌株の使用により腹部マッサージで採取した体積が改善された場合は、毛細管内の白子の高さを測定し、プログラムに入力して濃度を計算することで体積を算出できます。数マイクロリットルが得られるこれらの場合、精巣解剖よりも腹部マッサージの方が運動性が高くなる可能性があります(補足表2)。少量を収集すると、サンプルが汚染されやすくなり、運動性に影響を与える可能性がありますが、これらの効果は体積が類似している場合に一貫しているように見えるため、処理グループ間で比較を行うことができます。ただし、白子の量や着色が大きく異なるサンプル間で比較しないでください。
腹式マッサージを用いたメダカから得られる白子の量が少ないことは、大量の白子を必要とする実験の限界となる可能性がある。そのような場合、解剖とマッサージの両方でゼブラフィッシュと緑色の刀剣から白子を採取した研究に示されているように、精巣の解剖が好ましいかもしれませんが、体積が少ないためメダカでの解剖によってのみ30。精巣の解剖は、通常、同じ理由で他の種との比較に適しています。他の同様のサイズの魚と比較して腹部マッサージによる限られた量は、精巣が小さいこと(ゼブラフィッシュ45の7.0 ± 2.5 mgと比較してメダカで1.9 ± 0.6 mg)と産生される精子が少ないこと(ゼブラフィッシュ46の7.7 ± 2.0 x 106精子細胞/ mg精巣と比較してメダカの2.0 ± 0.4 x 10精巣/ mg精巣)による可能性があります。 または、孵化場で飼育されたアフリカナマズ47で示唆されているように、技術を制限する他の未知の生物学的要因に。違いは、ひずみや環境条件に応じて生理学的なもの、またはゼブラフィッシュとは異なり、メダカの精巣がより内側に配置されているため、腹部マッサージではアクセスしにくい可能性がありますが、融合した精巣を持つ他の魚もいます。
ゼブラフィッシュなどの一部の種では、魚が朝に産卵する機会を得る前に精子をサンプリングするか48 、産卵を防ぐために前夜に個々のタンクでオスを隔離するのが最善です32。本研究のHd-rRメダカでは、サンプリングのタイミング(産卵前後)や住居条件(雌の有無にかかわらず1ヶ月間)などの環境条件は、精子の運動性に有意な影響を与えませんでした(図7)。サンプルサイズを大きくするか、男性を女性から長期間分離すると、精子の量や運動性が高くなる可能性があります。別の施設のCAB株メダカでは、女性と一緒に飼育された男性と比較して、単独で飼育された男性の方が精子の質と体積が優れているという同様の傾向が見られました(統計的結論を導き出すにはテストされた魚が少なすぎます)。また、これらの魚では腹部マッサージによって比較的大量の白子を採取することができたが(別表2)、Hd-rR株メダカではごく少量の白子が得られ、CAB株メダカ30でも同様の手法で少量が報告されている。しかし、これらの違いが系統によるもの(近親交配ではなく市販の系統)によるものなのか、飼育の違いによるもの(施設間が多い)によるものなのかは不明である。これらの魚では、数マイクロリットルの白子を集めることができ、汚染を制限し、品質を向上させます。しかし、男女の同棲が重要な実験では、結果を得るためにそれらを分離する必要はないようです。また、産卵前に一度にオスをサンプリングする必要もないようです。
メダカ精子が個体群や環境要因によってどのように異なるかを正確に判断するにはさらなる研究が必要であるが、実験装置を設計する際には系統や飼育条件を考慮し、精子の生産量が異なる集団間の比較には注意が必要である。より多くの量の白子が得られる場合は、活性化溶液の希釈を調整する必要があります(たとえば、1:60ですが、好ましい濃度はCASAシステムによって異なる場合があります)。.同様に、解剖された精巣がひずみまたは飼育条件のために通常(2 mg)よりもはるかに大きい場合は、CASAプログラムがすべての精子細胞を正確に標識できるように希釈を増やす必要があります。
精子分析の方法はメダカによって大きく異なり、主観的であることが多いため、研究間で結果を比較することは困難です。さまざまなレベルの専門知識を持つ技術者が使用する主観的方法と客観的方法を比較した研究では、経験豊富な技術者はCASA運動プログラムによって提供されるデータの10パーセントポイント以内で魚の精子の運動性を推定できるのに対し、経験の浅い技術者は最大30パーセントポイントの振幅でCASA運動値を過大評価していることがわかりました21.しかし、メダカの運動性を決定するパラメータの標準化の欠如は、より客観的な方法を使用するパラメータ間のばらつきを引き起こす可能性もあります。たとえば、精子を毎秒33フレーム(fps)で記録し、30フレームを分析し、2 μm / s運動よりも速く動く精子を検討したある研究では、対照魚の平均速度が約60 μm / sで、運動性が約70%でした18。同じプロトコルを使用した別の研究では、対照精子の平均速度は40 μm / sで、運動率は80%を超えていました19。47 fpsで200フレームを分析した別のグループは、対照魚の平均VCLが100 um / sを超えましたが、平均運動性は50%未満でした。彼らは、どのパラメータが運動性を決定するかを明らかにしなかった。したがって、このプロトコルでは、コンピューター支援精子分析ソフトウェアを使用して、メダカ精子の特性に合わせてカスタマイズされた一連のパラメーターに基づいて、精子を客観的、迅速、確実に分析します。ラボ間の比較では運動パラメータが一貫していることが重要であるため、この研究で使用された完全な構成が利用可能であるため(図2B)、このプロトコルは異なる研究者によって異なるラボで確実に複製できます。
硬骨魚は多種多様な精子特性を示すため、このプロトコルは当初、SCA Evolutionソフトウェアに推奨されるゼブラフィッシュパラメーターを使用してテストされましたが、低速で寿命の長いメダカ精子に合わせてパラメーターを調整する必要があることは明らかでした。そこで、ゼブラフィッシュのパラメータは、同様の精子特性を報告したメダカや他の種の文献を使用してメダカに適合させ19,34,35し、18個体からの17,580の分析された精子トラックの分布に最も適した閾値を選択しました。運動性は曲線速度(VCL)に基づいており、不動<10 μm/s≤低速<20 μm/s≤中≤40 μm/s<高速です。真直度指数(STR)が68%>場合、精子は進行性と見なされます。運動性を定義する閾値は、いくつかの文献で使用されているように、2 μm/sではなく10 μm/sに保たれました18,19、べん毛運動を欠く多くの精子は、この設定で運動性として誤ってラベル付けされたためです。同様のサイズの精子頭部(~2 μm)を持つ他の魚種も、運動性精子を定義するために10 μm/sを使用しました35,43。最大面積はゼブラフィッシュの設定である90 μm 2から20 μm2に減少したため、精巣の解剖による大きな細胞破片は無視されます。
運動の持続時間は、べん毛の動きがエネルギーの急速な消費を必要とするため、活性化前に貯蔵されるATPの量に依存するようです。おそらくこの急速な枯渇のために、高い初速度の精子と運動性のより短い持続時間との間に相関関係があります49。浸透圧ショックは通常、魚の精子を活性化するために必要ですが、運動期間中に膜の損傷を引き起こす可能性があり、これも寿命に影響を与える可能性があります。この効果は淡水種49でより重要であり、淡水精子と同様の平均速度と運動性を示すにもかかわらず、海洋精子がより長い運動持続時間(淡水種の約150秒と比較して平均約550秒)が可能な理由を説明している可能性があります14,22。30分を超える運動持続時間は一般的ではないが、いくつかの海洋種で報告されている22,49。淡水魚であるにもかかわらず、メダカの結果は、海洋種からの速度が遅く、持続時間が長い精子のプロファイルに適合します。これは、精漿と同様の培地での活性化に関連している可能性があり、浸透圧ショックがなく、メダカ精子は他の淡水魚のような膜損傷を受けない可能性が高い。
活性化しない溶液と、活性化後の非常に迅速で一貫したタイミング分析は、数分間しか運動しない精子の分析にしばしば必要です。しかし、メダカ精子の運動性は自然に数時間持続し、4°Cまたは氷上で保存することでより高い運動性を維持することができます(図6)。したがって、即時分析が不可能な実験では、分析の一貫性を保つために収集時間が記録されている限り、精巣を氷上の活性化溶液に1時間保存するようにプロトコルを変更することができます。ただし、最適な結果を得るには、即時分析が依然として最良の選択肢です。運動性は緩やかであるため、依然として低下しますが、活性化後の分析時間のわずかな違いによる結果への影響は少なくなります。それでも、データを比較して再現できるように、サンプルの保存温度と活性化後の分析時間の両方を報告することが重要です。
また、サンプリング中に白子が尿で汚染されないようにすることも通常非常に重要です, これは浸透圧を変化させ、精子を時期尚早に活性化する可能性があるためです16,50.ただし、これはメダカ(運動性の持続時間が長いため)およびこのプロトコルでは、サンプルがすぐに活性化培地に入れられるため、それほど懸念されません。白子が少ないと尿が混入しやすいため、少量調達時にめだかの腹式マッサージで多少の変色が予想されます。ただし、これが母集団で一貫している場合でも、治療群間で比較を行うことができます。白子の量や色が異なるメダカの個体群を比較する際には注意が必要です。
精子分析の結果は使用する方法に大きく依存するため、さまざまなラボで簡単に繰り返すことができる詳細で信頼性の高い方法が有益です。また、再現性を実現するためには、論文が方法の詳細を開示することも重要です。メダカは生殖研究のモデルとしてますます使用されるようになり、精子の質の評価に関する情報は不足しています。精子サンプリングのためにこの論文で説明されている2つの異なる方法は、異なる実験に有益である可能性があります。精巣の解剖は通常、より高い運動性の精子を生成し、相対濃度の計算を可能にしますが、腹部マッサージは同じ魚に対して繰り返し行うことができ、産卵イベントのより純粋な生物学的表現です。したがって、この原稿は、運動性、進行性、速度、およびその他の運動学的パラメーターを含む、精子の動きに関する十分なデータを提供する信頼性の高い客観的な手法であるCASAのパラメーターを提供します。したがって、これらのプロトコルは、毒物学、生態学、生殖学、生理学など、メダカのさまざまな研究に役立ちます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、ノルウェー生命科学大学と米国フルブライトプログラムによって資金提供されています。著者らは、魚施設のメンテナンスについてNMBUのアンソニーペルティエとルルドカレオンGタン、およびこれらの方法をさらにテストするための魚とラボスペースを提供してくれたINRAE(フランス)のISC LPGPのギヨームグルメランに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Axygen | MCT-150-C | Any standard brand can be used |
| 10 µL disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly | Drummond | 2-000-010 | |
| 10x objective with phase contrast | Nikon | MRP90100 | |
| 2 mL tubes | Axygen | MCT-200-c-s | Any standard brand can be used |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Blunt smooth forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Disposable 20 micron counting chamber slide | Microptic | 20.2.25 | Leja 2 chamber slides |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX7 | Any standard brand can be used |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| HBSS | Sigmaaldrich | H8264-1L | |
| Holding sponge | self-made | ||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ts2R | |
| SCA Evolution | Microptic | ||
| Small dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigmaaldrich | S9888 | |
| Tabletop vortex | Labnet | C1301B | |
| Tricaine | Sigmaaldrich | A5040 |
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