Summary
هنا ، نصف جهازا جديدا وبسيطا ومنخفض التكلفة لإجراء فحوصات العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) بنجاح في المختبر باستخدام ثقافة خلايا HeLa ثنائية الأبعاد و verteporfin كحساس للضوء.
Abstract
تصف هذه الورقة جهازا جديدا وبسيطا ومنخفض التكلفة لإجراء فحوصات العلاج الضوئي الديناميكي في المختبر (PDT) ، يسمى PhotoACT. تم بناء الجهاز باستخدام مجموعة من الثنائيات التقليدية الباعثة للضوء القابلة للبرمجة (LEDs) ، ووحدة عرض الكريستال السائل (LCD) ، ومستشعر الضوء المتصل بلوحة متحكم تجارية. تم تصنيع الهيكل القائم على الصندوق للنموذج الأولي باستخدام ألواح ليفية متوسطة الكثافة (MDFs). يمكن للمقصورة الداخلية تخصيص أربع لوحات دقيقة متعددة الآبار في وقت واحد.
كدليل على المفهوم ، درسنا التأثير السام للخلايا للمحسس الضوئي (PS) verteporfin ضد خط خلية HeLa في ثقافة ثنائية الأبعاد (2D). عولجت خلايا هيلا بتركيزات متزايدة من فيرتيبورفين لمدة 24 ساعة. تم التخلص من الوسط الطافي المحتوي على الدواء ، وتم غسل الخلايا الملتصقة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وأضيف وسط خال من المخدرات. في هذه الدراسة ، تم فحص تأثير verteporfin على الخلايا إما دون التعرض للضوء أو بعد التعرض لمدة 1 ساعة للضوء باستخدام قيم الأحمر والأخضر والأزرق (RGB) من 255 و 255 و 255 (متوسط الطلاقة 49.1 ± 0.6 J / cm2). بعد 24 ساعة ، تم تقييم صلاحية الخلية بواسطة مقايسة 3- (4،5-ثنائي ميثيل -2-ثيازوليل) -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT).
أظهرت النتائج التجريبية أن تعرض الخلايا المعالجة ب verteporfin للضوء من الجهاز يعزز التأثير السام للخلايا للدواء عبر آلية بوساطة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقق من صحة استخدام النموذج الأولي الموصوف في هذا العمل من خلال مقارنة النتائج بجهاز PDT تجاري. وبالتالي ، فإن هذا النموذج الأولي للعلاج الضوئي الديناميكي القائم على LED يمثل بديلا جيدا للدراسات المختبرية ل PDT.
Introduction
من بين أكثر الأمراض غير السارية فتكا، يمثل السرطان سببا رئيسيا عالميا للوفاة المبكرة. وبلغ عدد الوفيات ما يقرب من 10 ملايين حالة وفاة في عام 2020 ، وهو ما يمثل حوالي واحد من كل ستة وفيات في جميع أنحاء العالم1. بالإضافة إلى ذلك ، تمثل ظاهرة مقاومة الأدوية المتعددة (MDR) تهديدا هائلا للصحة العامة ، حيث تفشل بروتوكولات العلاج الكيميائي المعتمدة في الوصول إلى مراحل مغفرة لهذه الحالة السريرية2. يمكن للخلايا السرطانية تطوير مقاومة للعلاج الكيميائي من خلال عدة آليات. ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن بعض ناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP (ABC) - مضخات التدفق المعتمدة على ATP - يعتبر السبب الرئيسي لتطور MDR داخل البيئة المكروية للورم3. بالإضافة إلى MDR ، تعزز مضاعفات السرطان الأخرى ، مثل التكرار والورم الخبيث ، الطلب الملح لتطوير وتحسين الأساليب العلاجية للتغلب على هذا التحدي الأورامي.
تم ممارسة الاستخدام العلاجي للضوء لعدة قرون4 ، ويمثل العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) نهجا علاجيا معتمدا سريريا للأورام الصلبة. يجمع PDT بين إعطاء محسس ضوئي (PS) متبوعا بتشعيع خفيف لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لممارسة السمية الخلوية الانتقائية في الخلايا السرطانية. هذا النهج العلاجي متفوق على الطرق التقليدية ، بما في ذلك الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي5 ؛ إنها تقنية طفيفة التوغل تظهر سمية خلوية أقل في الأنسجة الضامة6. يضمن تطبيق الضوء وتراكم PS مباشرة في الورم أو بيئته المكروية استهدافا دقيقا ، وبالتالي آثارا جانبية جهازية طفيفة وغير مرغوب فيها7 وإمكانية العلاج المتكرر في نفس الموقع. علاوة على ذلك ، فإن التكلفة أقل من تكلفة الأساليب الأخرى. نظرا لميزاته الواعدة ، يمكن اعتبار PDT خيارا مناسبا لكل من الفردي ، خاصة في حالة الأورام غير القابلة للعمل ، أو علاج السرطان المساعد7 ، ويمثل بديلا ل MDR المتعلق بالعلاج الكيميائي 8,9.
تم وصف التقرير الأول الذي يظهر معدل استجابة موضوعي مرتفع باستخدام PDT في عام 1975 في نموذج الفئران والجرذان10. منذ ذلك الحين ، أجريت دراسات باستخدام PDT مع نتائج إيجابية7 في كل من الجسم الحي وفي المختبر مع خطوط الخلايا السرطانية البشرية في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد11,12. بالنظر إلى قابلية التطبيق الواسع ل PS المعتمد سريريا ، بغض النظر عن مسارات التراكم المحددة ونطاقات الطول الموجي لقمم الامتصاص ، فإن العملية العامة هي كما يلي: (i) امتصاص PS ، (ii) ذروة تركيز PS في الورم أو بيئته المكروية ، (iii) تطبيق الضوء ، (iv) تفاعل ضوء PS ، (v) نقل طاقة الحالة المثارة PS إلى ركيزة الأنسجة أو جزيئات الأكسجين المحيطة ، (vi) إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التي تنطوي على الأكسجين المفرد أو أنيون الأكسيد الفائق ، (vii) موت الخلايا السرطانية عن طريق ، بشكل أساسي ، النخر أو موت الخلايا المبرمج (الموت المباشر) ، الالتهام الذاتي (آلية الحماية الخلوية) ، نقص تروية الأنسجة (تلف الأوعية الدموية) ، التعديل المناعي ، أو تداخل هذه الآليات7. في هذه المرحلة النهائية ، يعتمد تنشيط مسار موت خلية معين على العديد من العوامل ، مثل خصائص الخلية ، والتصميم التجريبي ، والأهم من ذلك ، توطين PS داخل الخلايا والضرر المستهدف المرتبط ب PDT13.
Verteporfin هو الجيل الثاني من PS ، معتمد من قبل الوكالات التنظيمية للاستخدام السريري في النرويج والصين لعلاج الضمور البقعي المرتبط بالعمر7. بعد تسليم الجرعة ، تم الإبلاغ عن أن هذا الدواء الأولي يتراكم جزئيا في الميتوكوندريا14 ويحفز فسفرة التيروزين البروتين الخلوي وتجزئة الحمض النووي ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية15,16. بعد 24 ساعة حضانة لاستيعاب verteporfin ، يوصى باستخدام بروتوكول PDT باستخدام إعداد الطول الموجي 690 نانومتر لتحقيق مستويات فعالة من نقل الإشعاع الكهرومغناطيسي إلى الجزيئات المجاورة 7,17.
فيما يتعلق بمصدر الضوء ل PDT ، عادة ما تكون أنظمة ليزر الصمام الثنائي الكلاسيكية باهظة الثمن ومعقدة تقنيا وكبيرة الحجم وبالتالي غير محمولة18,19. نتيجة لملف تعريف الطول الموجي الفردي ، والذي يمكن ملاحظته أيضا في معدات PDT القائمة على LED ، فإن الطلب على الوحدات المستقلة لكل تطبيق محسس ضوئي يجعل استخدام أنظمة ليزر الصمام الثنائي أكثر تعقيدا وغير مجد اقتصاديا20,21. لذلك ، يعتبر استخدام آلات LED البديل الواعد ليس فقط لحل مشاكل التكاليف22 والصيانة ، ولكن أيضا لتوفير خرج طاقة عالي وأقل ضررا 23 وقدرة إضاءة أوسع24،25،26،27.
على الرغم من المساهمة المحتملة التي يمكن أن تقدمها المعدات المستندة إلى LED لتجارب PDT28 ، لا تزال معظم الخيارات التجارية تمتلك عيوبا مثل نقص قابلية النقل والتكلفة العالية ومشاريع البناء المعقدة والتشغيل29. كان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو تقديم أداة بسيطة وموثوقة لفحوصات PDT في المختبر . تصف هذه الورقة PhotoACT ، وهو جهاز PDT قائم على LED مدمج داخليا ، وهو غير مكلف وسهل الاستخدام ومحمول. كدليل على المفهوم ، يظهر هذا الجهاز لتعزيز السمية الخلوية لل verteporfin في نموذج زراعة الخلايا 2D ، وبالتالي ، يمكن استخدامه كأداة بحث في تجارب PDT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. بناء الجهاز
- المنشار الألواح الليفية متوسطة الكثافة بسمك 3 مم (MDF) للحصول على قطع بالأبعاد الموضحة في الشكل 1 أ.
ملاحظة: استخدم الملف المتجه (الملف التكميلي 1) لقطع التحكم العددي بالكمبيوتر (CNC). - قم ببناء صندوقين بالأبعاد التالية (الطول × العرض × الارتفاع): 330 مم × 235 مم × 225 مم للصناديق الأكبر ، و 300 مم × 220 مم × 150 م للصناديق الأصغر (الشكل 1 ب).
- قم بحفر الجزء الخلفي من الصندوق الأكبر لتثبيت موصل مقبس الأسطوانة. قم بحفر الجزء العلوي من الصندوق الأكبر والجزء العلوي والسفلي من الصندوق الأصغر لتوفير ممر للكابلات الكهربائية (الشكل 1C).
- قم بطلاء جميع الأسطح الداخلية بالحبر الأسود لتعزيز حدوث الضوء المتجانس (الشكل 1 د).
- قم بتوصيل ، بالتوازي ، ثلاثة أشرطة LED مع 10 مصابيح LED لكل منها على السطح الداخلي العلوي للصندوق الأصغر (الشكل 1E).
- قم بتركيب مستشعر سطوع في وسط السطح الداخلي السفلي للصندوق الأصغر (الشكل 1F).
- اطبع هيكل وحدة التحكم (الشكل 1G) باستخدام ملف الطباعة ثلاثي الأبعاد (الملف التكميلي 2).
- قم بتثبيت جميع المكونات (زر الطاقة ، ومقاييس الجهد ، ولوحة اللمس للوقت / البدء ، ومصابيح LED ، ومستشعر السطوع ، وشاشة LCD ، والجرس ، ومصدر الطاقة) في منافذ لوحة التحكم ESP32 المثبتة في وحدة التحكم الداخلية (الشكل 2).
- قم بتحميل رمز البرمجة (الملف التكميلي 3 والملف التكميلي 4 والملف التكميلي 5) وقم بإجراء اختبار للتحقق من أن جميع الاتصالات تعمل (الشكل 1H).
- قم بتجميع الصناديق وإصلاحها معا لتجنب الفجوات ، وبالتالي تداخل الضوء الخارجي وفقدان الضوء المنبعث. قم بتوصيل وحدة التحكم المركبة بالمنطقة المحفورة في الجزء العلوي من النموذج الأولي (الشكل 1I).
- ثبت بابا أماميا من نفس المادة وأبعاد 330 مم × 225 مم (الطول × العرض) على الصندوق الأكبر بمفصلتين صغيرتين. أيضا ، قم بتوصيل أشرطة الفيلكرو جانبيا بالصندوق الأكبر لتعزيز إغلاق النموذج الأولي (الشكل 1J). قم بتركيب مقبض للتعامل مع الباب الأمامي للمعدات.
- قم بتوصيل أربع وسادات قدم مطاطية في الجزء السفلي من النموذج الأولي لضمان مزيد من الثبات أثناء العمليات (الشكل 1K).
2. خطوط الخلايا: الزراعة والبذر والعلاج
- المواد الكيميائيه
- قم بإذابة البورفيرين في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لتحقيق تركيز 100 mM.
تنبيه: يجب التعامل مع DMSO بعناية (التعامل مع استخدام معدات الحماية الشخصية وفي منطقة جيدة التهوية). تعامل مع كل من المخزون والمحاليل المخففة بعناية لتجنب التعرض المفرط للضوء.
- قم بإذابة البورفيرين في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لتحقيق تركيز 100 mM.
- خطوط الخلايا
- قم بزراعة خط خلايا HeLa في وسط منخفض الجلوكوز منخفض الجلوكوز (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ جنتاميسين.
- احتفظ بقوارير المزرعة في حاضنة زراعة خلايا CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية.
- إدارة وفحص الخلايا حتى تصل إلى 80٪ -90٪ التقاء.
- عملية البذر
- قم بإزالة وسط الثقافة من القارورة.
- اغسل الخلية أحادية الطبقة باستخدام برنامج تلفزيوني.
- افصل زراعة الخلايا المتقاربة باستخدام التربسين-EDTA (0.5٪) 1x لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. أوقف عمل التربسين عن طريق إعادة تعليق الخلايا بوسط استزراع مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ جنتاميسين.
- عد الخلايا المعاد تعليقها باستخدام مقياس الدم وزرعها في صفيحة من 96 بئرا عند 2.0 × 104 خلايا / بئر.
- تحضير لوحين للظروف المظلمة والخفيفة.
- احتضان لوحات لمدة 24 ساعة لمرفق الخلية.
- عملية العلاج
- قم بإزالة الوسط من كل من لوحات 96 بئر.
- علاج الخلايا مع 100 ميكرولتر من تركيزات متزايدة من verteporfin (0.045 إلى 24 ميكرومتر ، التخفيف التسلسلي).
- احتضان الخلايا مع العلاج من تعاطي المخدرات لمدة 24 ساعة للسماح باستيعاب verteporfin.
- بعد 24 ساعة ، تخلص من الوسط الذي يحتوي على الدواء ، واغسل الطبقة الأحادية من الخلايا باستخدام PBS (100 ميكرولتر) ، وأضف وسيطا خاليا من المخدرات (100 ميكرولتر).
- قم بتغطية صفيحة دقيقة واحدة بورق الألمنيوم لحمايتها من التعرض للضوء واحتضانها لمدة 24 ساعة. ستوفر هذه اللوحة بيانات التحكم لنتائج PDT (الحالة المظلمة). سيتم استخدام الصفيحة الدقيقة الأخرى في حالة التعرض للضوء في الجهاز.
3. تشغيل الجهاز
- قم بتوصيل جهاز PDT بمأخذ التيار الكهربائي وقم بتشغيله بالضغط على زر الطاقة .
- ضع الصفيحة الدقيقة الأخرى (حالة الضوء) في جهاز PDT وأغلق الجهاز عن طريق تثبيت الباب الأمامي بأشرطة الفيلكرو.
- استخدم مقاييس الجهد لضبط تكوين RGB (تجربة RGB 255 ، 255 ، 255 هنا ) وتعيين لون انبعاث الضوء.
ملاحظة: تحتوي كل مجموعة RGB على طيف انبعاث محدد ، والذي يجب تعديله للتجارب مع محسسات ضوئية مختلفة ، وبالتالي منحنيات امتصاص مختلفة. - اضغط على لوحة اللمس (+) / (- ) لضبط تكوين الوقت (تجربة مدتها 60 دقيقة هنا) وتعيين مدة الفحص.
ملاحظة: سيحدد تكوين الوقت ، بالاقتران مع قيمة الإشعاع ، طلاقة العملية - الجرعة الخفيفة المطبقة في الفحص. - تحقق من معلومات الإعداد على الشاشة.
- اضغط على زر ابدأ لبدء الفحص. تأكد من سماع صفارة صوت تنبيه واحد في بداية الفحص.
- أثناء التجربة ، لاحظ المعلومات في الوقت الفعلي على الشاشة ، مثل الإشعاع والوقت المتبقي.
- لا تفتح الباب الأمامي أو تغير أي تكوين أثناء فحص PDT.
- في نهاية الفحص ، انتظر صفارة بأربعة أصوات تنبيه والنظام الإلكتروني لإيقاف تشغيل جميع مصابيح LED. راقب رسالة منتهية والكمية النهائية للطاقة المستهلكة - الطلاقة - أثناء التجربة في الشاشة.
ملاحظة: يتم حساب القيمة النهائية للفلوانس باستخدام المعادلة (1):
(1)
حيث F يساوي J / cm 2 و I يساوي mW / cm 2 أو mJ / s · cm2. تأخذ قيمة الإشعاع في الاعتبار قوة مصابيح LED (مصدر الانبعاث) والمنطقة المشععة بشكل موحد للغرفة المظلمة (660 سم 2) (المعادلة [2]):
(2)
يتم عرض قيمة الإشعاع النظري على شاشة الجهاز في جميع أنحاء اختبار PDT بأكمله. في نهاية العملية ، استخدم المعادلة (3) لحساب الطلاقة:
فلوينس (F) = الإشعاع (I ، قيمة ثابتة) × وقت (أوقات) التشغيل (3)
(1)
(2)4. فحص صلاحية الخلية
- بعد فحص PDT ، قم بتغطية الصفيحة الدقيقة التي تعرضت للضوء واحتضانها لمدة 24 ساعة.
- بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة وسط الاستزراع من كلا اللوحين ، واغسل الطبقة الأحادية من الخلايا باستخدام PBS (100 ميكرولتر) ، وأضف محلول MTT (0.5 مجم / مل ، 100 ميكرولتر). احتضان كل من اللوحات - الظروف المظلمة والخفيفة - لمدة 4 ساعات للسماح بتكوين بلورات الفورمازان.
- قم بإزالة محلول MTT بعناية وقم بإذابة البلورات الأرجوانية بمحلول DMSO / الإيثانول (1: 1).
- بعد الذوبان الكامل للبلورات ، قم بإجراء قياس الامتصاص باستخدام قارئ microplate عند 595 نانومتر.
ملاحظة: يمكن استخدام الجهاز في تجارب مهمة أخرى مثل موت الخلايا بوساطة ROS الناجم عن المحسسات الضوئية بعد التعرض للضوء عن طريق قياس التدفق الخلوي30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تضمن جهاز PDT النهائي ، المسمى PhotoACT ، غرفة مظلمة لتخصيص ما يصل إلى أربع لوحات دقيقة متعددة الآبار ، مع سطحها الداخلي العلوي المجهز بمجموعة من 30 مصباح LED متناثرة مبرمجة لإصدار أطياف مميزة من الضوء المرئي (الشكل 3 والملف التكميلي 6). تم بناء الجهاز باستخدام صندوقين مرتبطين: صندوق داخلي مصمم كغرفة مظلمة لفحوصات PDT ، وصندوق خارجي لتغطية الغرفة الداخلية وحمل وحدة التحكم (الشكل 1B). تم طلاء الصندوق الداخلي باللون الأسود (الشكل 1D) ويتكون من نموذج شريط LED RGB WS2812 (أو WS281B) مع 30 مصباح LED وطول 1 متر (تم تقطيعه لاحقا إلى ثلاث قطع) و 9 واط ، والذي يحمل معالجا مدمجا. سمح هذا الجهاز باستخدام أكثر تحكما ، وبالتالي انبعاث ألوان أكثر دقة. تم توزيع 30 مصباح LED بالتساوي على كامل السطح الداخلي العلوي لغرفة PDT بواسطة ثلاثة أشرطة متوازية مع 10 مصابيح LED لكل منها (الشكل 1E). تم إنشاء حدوث ضوء متجانس بسبب الانعكاس المنخفض للأسطح الداخلية السوداء والتوزيع الموحد لتكوين LED. تم أيضا دمج مستشعر سطوع TSL2561 في الجزء السفلي الأوسط من الصندوق الداخلي للإشارة إلى حدوث الضوء والعمل كأداة لمراقبة الجودة ، مما يضمن توحيد الإشعاع داخل الغرفة المظلمة (الجدول التكميلي S1) ومراقبة قوة نظام LED ، والذي من المعروف أن له عددا معينا من الساعات من العمر الإنتاجي (الشكل 1F ). الصندوق الخارجي عبارة عن هيكل يغطي الصندوق الداخلي ، ويتكون من ستة أجزاء MDF ، مطلية باللون الرمادي ، ومقطوعة بالليزر لتناسب مثالي (الأشكال 1 أ ، ب). تم تصميم وحدة التحكم باستخدام برنامج 31 عبر الإنترنت ،3D مطبوع بحمض polylactic كجزء واحد باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد ، ومطلي باللون الرمادي. يحتوي على جميع مكونات الإلكترونيات ، بما في ذلك الشاشة ومقاييس الجهد والأزرار والجرس (الشكل 1I والشكل 2).
لتمكين تعديلات حوادث الضوء المستقلة ، تم اختيار لوحة التحكم ESP32 لدمج وحدة التحكم (الشكل 2). يجب أن يسمح هذا التكوين بواجهة USB للبرمجة ، والبلوتوث ، و Wi-Fi ، والمعالج ثنائي النواة ، والعديد من المنافذ ، والقدرة على الاتصال بدائرة متكاملة (I2C) ، وواجهة طرفية تسلسلية (SPI) ، وواجهات أخرى. لتشغيل النظام ، تمت كتابة برنامج بلغة C من خلال بيئة تطوير متكاملة (IDE). تعتمد بنية التعليمات البرمجية32 على FreeRTOS ، وهو نظام تشغيل مجاني في الوقت الفعلي تدعمه لوحة تحكم ESP32. يسمح المنطق المشار إليه ببرمجة التطبيقات المستقلة ، والتي يمكن معالجتها بواسطة ESP32 في مناهج متوازية أو متوازية ، مما يجعل المشروع وعمليات الصيانة والتحسين والتحديث أكثر تنوعا وأمانا.
الواجهة بين الماكينة والمشغل سهلة الاستخدام وتتكون من شاشة عرض بلورية سائلة (LCD) ومقاييس جهد وأزرار وجرس (الشكل 3 والملف التكميلي 6). تحتوي شاشة LCD الصغيرة مقاس 16 مم × 2 مم (الأعمدة مقابل الخطوط) على وحدة تحكم HD44780 مدمجة مع بروتوكول اتصال I2C ، مما يمنح سهولة التركيب وتعدد استخدامات الإرسال ، على التوالي. يتضمن الإعداد الأولي RGB وتعديلات الوقت من قبل المشغل. يمكن ضبط حجم الضوء وتكوين اللون باستخدام مقاييس الجهد ، والتي تعدل شدة (0 إلى 255) لمكونات الألوان الأساسية الثلاثة - RGB. يمكن أن تؤدي هذه التعديلات إلى العديد من تركيبات الألوان التي تم تناولها في جدول ألوان RGB الدولي33. يمتلك كل تكوين RGB طولا موجيا محددا ، والذي يجب تعديله وفقا ل PS المستخدم في تجربة PDT ؛ يجب أن يتداخل منحنى الامتصاص ل PS والطول الموجي للإشعاع حتى يحدث التنشيط الضوئي بشكل مرض (الشكل التكميلي S1). على طول العملية ، يمكن الوصول إلى حالة العملية مع الوقت المتبقي ومعلومات حوادث الضوء على شاشة LCD.
في نهاية الوقت المبرمج ، قام النظام الإلكتروني بإيقاف تشغيل جميع مصابيح LED ، وأصدر تحذيرا مسموعا ، وأظهر على الشاشة إجمالي كمية الطاقة لكل منطقة (J / cm²) ، والتي تم حسابها بضرب القيمة الثابتة للإشعاع في وقت التشغيل بالثواني. قدم هذا النموذج الرقمي مجموعة واسعة من مستويات الكشف (حدود بين 0.1 و 40,000+ لوكس) ، وواجهة I2C ، وكثافة منخفضة للتيار الكهربائي (0.5 مللي أمبير و 15 μA في حالة التشغيل والاستعداد ، على التوالي).
كدليل على المفهوم ، تم استخدام الجهاز لتعزيز التأثير السام للخلايا للفيرتيبورفين في زراعة خلايا 2D HeLa بعد التعرض للضوء لمدة ساعة واحدة (49.1 ± 0.6 جول / سم2). كما هو موضح في الشكل 4A ، كانت قيمة GI50 3.1 ميكرومتر لحالة الإضاءة و 13.8 ميكرومتر للحالة المظلمة. وبالتالي ، فإن التحول بمقدار 4.4 أضعاف مقارنة الظروف أثبت صحة استخدام verteporfin باعتباره PS وقابلية تطبيق PhotoACT على فحوصات PDT. للتحقق من صحة استخدام النموذج الأولي الموصوف في هذا العمل ، تم استخدام جهاز PDT تجاري في ظل نفس الظروف التجريبية ، بما في ذلك PS والخلايا والطلاقة ، ومقارنة النتائج. كما هو موضح في الشكل 4B ، قام كلا الجهازين بتنشيط فيرتيبورفين ضوئيا بالتساوي ، مما يعزز التأثير السام للخلايا. أكدت هذه النتائج قابلية تطبيق هذا في جهاز PDT المبني في المنزل (الشكل 4 أ ، ب). أخيرا ، تم تأكيد موت الخلايا بوساطة ROS الناجم عن verteporfin بعد التعرض للضوء عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام مقايسة DCFDA (الشكل 4C ، D).
الشكل 1: تعليمات بناء وتجميع PhotoACT. رسم توضيحي مفصل لبناء المكونات وحفرها وطلائها وتركيبها وإكسسواراتها في الجهاز. تعرض اللوحة دليلا تفصيليا لبناء الجهاز. اختصار: LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تعليمات بناء وحدة التحكم والتركيب الإلكتروني. رسم عرض مكبر لوحدة التحكم المتفجرة والمخطط التفصيلي للتوصيلات الإلكترونية في منافذ لوحة التحكم ESP32 مع التوصيلات والمكونات المستخدمة في النموذج الأولي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تمثيل PhotoACT. رسم تجميع لتصميم المنتج النهائي مع فاتورة المواد ، وبالونات الملصقات ، وعرض مفصل لمصابيح LED الداخلية العلوية. يسمح الشكل بتحديد أجزاء ومكونات النموذج الأولي. الاختصارات: MDF = اللوح الليفي متوسط الكثافة ؛ LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: السمية الضوئية في المختبر لتوليد verteporfin و ROS. (أ ، ب) اختبار صلاحية الخلية الذي تم إجراؤه باستخدام طريقة MTT: أجريت المقايسات لتقييم المظهر السام للخلايا ل verteporfin المحسس الضوئي بتركيزات مختلفة. عولجت خلايا هيلا لمدة 24 ساعة بتركيزات مختلفة من فيرتيبورفين (0.045-24 ميكرومتر) ، معرضة للضوء (PhotoACT (A) أو معدات PDT التجارية (B)) أو الظروف المظلمة ، ثم خضعت لفحص MTT. أظهرت كلتا الحالتين انخفاضا في صلاحية الخلية عند تركيزات أعلى من فيرتيبورفين ، لكن التعرض للضوء - الذي تم الحصول عليه من مقايسات PDT - عزز المظهر السام للخلايا ل PS ، مما يعني أن PDT يعزز السمية الخلوية للفقرة. تم تركيب منحنيات الجدوى باستخدام برنامج GraphPad Prism 6. (ج، د) عولجت خلايا هيلا لمدة 24 ساعة بتركيزات منخفضة وعالية من فيرتيبورفين (0.187 ميكرومتر و 6 ميكرومتر) ثم تعرضت للضوء (PhotoACT) أو الظروف المظلمة. تم قياس مستويات ROS داخل الخلايا بعد التشعيع عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام مسبار DCFDA (الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 1 ميكرومتر). يشير التحول الأيمن بين الرسوم البيانية إلى كثافة مضان أعلى بسبب تراكم أعلى داخل الخلايا ل DCF ، وبالتالي مستويات ROS أكبر. أظهرت النتائج عدم وجود فرق ذي صلة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في الحالة المظلمة (C) ولكنها أظهرت زيادة في الاستجابة للجرعة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية بعد التنشيط الضوئي ل verteporfin (D). الاختصارات: ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية ؛ DCF = 2',7'-ثنائي كلورو فلوريسين; DCFDA = 2',7'-ثنائي كلورو هيدروفلوريسئين ثنائي الأسيتات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: المخطط الانسيابي لقرار الجهاز: الإعداد الأولي واستكشاف أخطاء العملية وإصلاحها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي S1: التداخل بين منحنى امتصاص فيرتيبورفين وطيف انبعاث LED للجهاز. طيف امتصاص فيرتيبورفين مع قمم الامتصاص المحددة (x ، y ') وطيف انبعاث LED من RGB 255 ، 255 ، 255-اللون الأبيض (3,700K-5,000K CCT) المستخدمة لتنشيط ضوئي المحسس الضوئي (x ، y ''). يؤكد التداخل بين قمم الامتصاص المختلفة للفيرتيبورفين والضوء المشع الأبيض التنشيط الضوئي للمحسس الضوئي ، وهو ما أكدته أيضا النتائج البيولوجية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي S1: اختبارات توحيد التشعيع. لمعان فوري (تجويف) يقاس بواسطة مستشعر السطوع في نقاط مختلفة من المنطقة المشععة. لا تظهر النتائج المقدمة أي اختلاف تعبيري ، مما يشهد على التشعيع المنتظم للجهاز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: ملف متجه للقطع. ملف الرسم (DWG) لقطع لوح MDF. يجب استخدام الملف لقطع التحكم العددي بالكمبيوتر (CNC). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: ملف الطباعة 3D من وحدة التحكم. طباعة حجرية مجسمة (STL) إلى 3D طباعة وحدة التحكم في الجهاز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: كود برمجة C. تم تطوير رمز البرمجة بلغة C لتكوين وحدة التحكم في الجهاز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 4: كود برمجة INO. تم تطوير رمز البرمجة بلغة INO لتكوين وحدة التحكم في الجهاز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 5: تعليمات التجميع. Markdown (MD) ملف "Read ME" مع إرشادات إضافية لتجميع كود البرمجة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 6: نموذج تصميم الجهاز. معاينة ملف النموذج ثلاثي الأبعاد لمعيار تبادل بيانات المنتج (STEP) للتصور العام للنموذج الأولي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كان جهاز PhotoACT النهائي مناسبا للبناء بمكونات منخفضة التكلفة متاحة تجاريا بتكلفة إجمالية تقل عن 50 دولارا. وتشمل المزايا الإضافية انخفاض متطلبات الصيانة، والقدرة على تشعيع أنواع متعددة من ألواح الاستزراع، والاستخدام المتزامن لما يصل إلى أربع وحدات لكل فحص، والوزن المنخفض (2 كجم)/الحجم (44سم3) الذي يسمح بقابلية النقل، والإشعاع الدقيق والقابل للتكرار (البيانات غير معروضة)، وواجهة إعداد سهلة الاستخدام وبسيطة لا تتطلب الاتصال بالحواسيب أو الآلات الأخرى.
أدت بعض الخطوات الحاسمة لكل من بروتوكولات البناء والتشغيل إلى ظهور فرص التحسين أثناء تصور المشروع. نظرا لأن غرفة PDT تتطلب انبعاثا متجانسا للضوء وقياسا ثابتا للطاقة ، فقد تم إغلاق الصناديق الداخلية والخارجية لتجنب تداخل الضوء الخارجي وفقدان الضوء المنبعث. تم تثبيت أشرطة فيلكرو إضافية جانبية على الباب الأمامي لتعزيز إغلاق الغرفة وضمان التجارب دون انقطاع. تم تركيب مؤشر LED تمثيلي في وحدة التحكم للمصادقة على تكوين RGB المطلوب ، مما يشير إلى لون وشدة الضوء المنبعث أثناء الفحص. أخيرا ، خضع رمز البرمجة لعدة ترقيات لتحسين قياسات الكثافة الفورية والكميات النهائية لتقييمات الطاقة ، وتأييد قابلية التكرار والاتساق الرياضي. تتضمن بعض التفاصيل الرئيسية الأخرى التي تتطلب مزيدا من الاهتمام ما يلي: (i) التوزيع المتجانس لمصابيح LED وتحديد المواقع المركزية لمستشعر السطوع للحصول على نتائج تمثيلية ومتوازنة ، (ii) تركيب جميع المكونات وفقا للمخطط الإلكتروني (الشكل 2) ورمز البرمجة (الملف التكميلي 3 ، الملف التكميلي 4 ، والملف التكميلي 5 ) لضمان التشغيل الصحيح ، و (iii) الإعداد (مع الاحتفاظ بنفس تكوين RGB والوقت) قبل إجراء تجربة لضمان تكرار متسق مع نتائج موثوقة. على الرغم من أن نظام RGB يوفر تركيبات ألوان مرئية متعددة بأطوال موجية محددة ، إلا أن تجارب الضوء غير المرئي تتطلب ترقيات بروتوكول محددة. يتم تقديم مخطط انسيابي للقرار في الشكل 5 لتوفير نهج منهجي لحل المشكلات للعثور على المشكلات أو الأخطاء وتصحيحها أثناء العملية.
تم تصميم PhotoACT لتلبية متطلبات التجارب في المختبر مع النتائج التي تم التحقق من صحتها والتي تم الحصول عليها من خلال التنشيط العلاجي ل verteporfin للحث على السمية الخلوية في خلايا 2D HeLa (الشكل 4) ، ويمكن التوصية ب PhotoACT للجامعات والمدارس والصناعات ومراكز الأبحاث الأخرى. يجب أن يوسع هذا الجهاز فوائد PDT للبحث العلمي الذي يستكشف آلية عمل المحسسات الضوئية وتطبيقاتها السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر آرثر هنريكي غوميز دي أوليفيرا ولوكاس جوليان كروز غوميز للمساعدة في عملية التصوير. تم دعم هذا المشروع من قبل مجلس البحوث البرازيلي (CNPq ، أرقام المنح 400953 / 2016-1-404286 / 2021-6) و Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). تم تمويل هذه الدراسة جزئيا أيضا من قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - قانون المالية 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).
