Summary
Her beskriver vi en ny, enkel og rimelig enhet for å kunne utføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) analyser ved hjelp av todimensjonal HeLa-cellekultur og verteporfin som fotosensibilisator.
Abstract
Dette papiret beskriver en ny, enkel og rimelig enhet for å utføre in vitro fotodynamisk terapi (PDT) analyser, kalt PhotoACT. Enheten ble bygget ved hjelp av et sett med konvensjonelle programmerbare lysdioder (LED), en LCD-modul (Liquid Crystal Display) og en lyssensor koblet til et kommersielt mikrokontrollerkort. Den boksbaserte strukturen til prototypen ble laget med fiberplater med middels tetthet (MDF). Det indre rommet kan samtidig tildele fire cellekultur multiwell mikroplater.
Som et bevis på konseptet studerte vi den cytotoksiske effekten av fotosensibilisatoren (PS) verteporfin mot HeLa-cellelinjen i todimensjonal (2D) kultur. HeLa-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av verteporfin i 24 timer. Det medikamentholdige supernatantmediet ble kassert, de tilhørende cellene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), og medikamentfritt medium ble tilsatt. I denne studien ble effekten av verteporfin på celler undersøkt enten uten lyseksponering eller etter eksponering i 1 time for lys ved bruk av rød-grønn-blå (RGB) verdier på 255, 255 og 255 (gjennomsnittlig flyt på 49,1 ± 0,6 J / cm2). Etter 24 timer ble cellens levedyktighet vurdert ved 3-(4,5-dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse.
Eksperimentelle resultater viste at eksponering av celler behandlet med verteporfin til lyset fra enheten forbedrer stoffets cytotoksiske effekt via en mekanisme mediert av reaktive oksygenarter (ROS). I tillegg ble bruken av prototypen beskrevet i dette arbeidet validert ved å sammenligne resultatene med en kommersiell PDT-enhet. Dermed representerer denne LED-baserte fotodynamiske terapiprototypen et godt alternativ for in vitro-studier av PDT.
Introduction
Blant de mest dødelige ikke-smittsomme sykdommene representerer kreft en global ledende årsak til tidlig død. Den sto for nesten 10 millioner dødsfall i 2020, som representerer om lag ett av seks dødsfall på verdensbasis1. I tillegg representerer fenomenet multiresistens (MDR) en enorm folkehelsetrussel, da godkjente kjemoterapeutiske protokoller ikke når remisjonsstadier for denne kliniske tilstanden2. Kreftceller kan utvikle motstand mot kjemoterapi gjennom flere mekanismer; Imidlertid anses overekspresjonen av noen ATP-bindende kassetttransportører (ABC) - ATP-avhengige efflukspumper - som hovedårsaken til MDR-utvikling i et tumormikromiljø3. I tillegg til MDR forsterker andre kreftkomplikasjoner, som tilbakefall og metastase, det presserende behovet for å utvikle og forbedre terapeutiske tilnærminger for å overvinne denne onkologiske utfordringen.
Den kurative utnyttelsen av lys har blitt praktisert i århundrer4, og fotodynamisk terapi (PDT) representerer en klinisk godkjent terapeutisk tilnærming for solide svulster. PDT kombinerer administrering av en fotosensibilisator (PS) etterfulgt av lysbestråling for å generere reaktive oksygenarter (ROS) for å utøve selektiv cytotoksisitet i tumorceller. Denne terapeutiske tilnærmingen er bedre enn konvensjonelle metoder, inkludert kirurgi, stråling og kjemoterapi5; Det er en minimal invasiv teknikk som viser lavere cytotoksisitet i bindevev6. Lysapplikasjonen og PS-akkumuleringen direkte i svulsten eller dens mikromiljø sikrer presis målretting og følgelig mindre, uønskede systemiske bivirkninger7 og muligheten for gjentatt behandling på samme sted. Videre er kostnaden lavere enn for andre tilnærminger. På grunn av sine lovende egenskaper kan PDT betraktes som et passende alternativ for både enkelt, spesielt i tilfelle av inoperable svulster, eller adjuvant kreftbehandling7, og representerer et alternativ for MDR relatert til kjemoterapi 8,9.
Den første rapporten som viste høy objektiv responsrate ved bruk av PDT ble beskrevet i 1975 i en muse- og rottemodell10. Siden da har studier blitt utført ved bruk av PDT med positive resultater7 både in vivo og in vitro med humane tumorcellelinjer i 2D-cellekultur11,12. Tatt i betraktning den brede anvendeligheten av klinisk godkjent PS, uavhengig av deres spesifikke akkumuleringsveier og bølgelengdeområder av absorpsjonstopper, er den generelle prosessen som følger: (i) PS-opptak, (ii) topping av PS-konsentrasjon ved svulsten eller dens mikromiljø, (iii) lysapplikasjon, (iv) PS-lysinteraksjon, (v) overføring av PS-opphisset tilstandsenergi til enten vevssubstrat eller omkringliggende oksygenmolekyler, (vi) ROS-produksjon som involverer singlet oksygen eller superoksidanion, (vii) tumorcelledød via hovedsakelig nekrose eller apoptose (direkte død), autofagi (cytobeskyttende mekanisme), vevsiskemi (vaskulær skade), immunmodulering eller overlapping av disse mekanismene7. I dette siste stadiet avhenger aktiveringen av en spesifikk celledødsvei av mange faktorer, for eksempel celleegenskaper, eksperimentell design og, viktigst, PS intracellulær lokalisering og PDT-relatert målrettet skade13.
Verteporfin er en andregenerasjons PS, godkjent av tilsynsorganer for klinisk bruk i Norge og Kina for å behandle aldersrelatert makuladegenerasjon7. Etter doselevering ble dette prodruget delvis akkumulert i mitokondrier14 og indusere cellulær proteintyrosinfosforylering og DNA-fragmentering, noe som førte til tumorcelleapoptose15,16. Etter 24 timers inkubasjon for verteporfin-internalisering anbefales en PDT-protokoll ved bruk av et 690 nm bølgelengdeoppsett for å oppnå effektive nivåer av elektromagnetisk strålingsoverføring til tilstøtende molekyler 7,17.
Når det gjelder lyskilden for PDT, er de klassiske diodelasersystemene vanligvis dyre, teknisk kompliserte, store og dermed ubærbare18,19. Som en konsekvens av sin enkeltbølgelengdeprofil, som også kan observeres i LED-basert PDT-utstyr, gjør etterspørselen etter uavhengige enheter for hver fotosensibiliseringsapplikasjon utnyttelsen av diodelasersystemer enda mer kompleks og økonomisk umulig20,21. Derfor anses bruken av LED-maskiner som det mest lovende alternativet for å løse ikke bare kostnader22 og vedlikeholdsproblemer, men også for å gi høy effekt og mindre skadelig 23 og bredere belysningsevne24,25,26,27.
Til tross for det potensielle bidraget som LED-basert utstyr kan tilby til PDT-eksperimenter28, har de fleste kommersielle alternativer fortsatt ulemper som mangel på bærbarhet, høye kostnader og komplekse byggeprosjekter og drift29. Hovedmålet med dette arbeidet var å tilby et enkelt og pålitelig verktøy for in vitro PDT-analyser. Dette papiret beskriver PhotoACT, en egenbygd LED-basert PDT-enhet, som er billig, brukervennlig og bærbar. Som et bevis på konseptet er denne enheten vist å forbedre cytotoksisiteten til verteporfin i en 2D-cellekulturmodell og kan derfor brukes som et forskningsverktøy i PDT-eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Enhetens konstruksjon
- Sag 3 mm tykke middels tetthet fiberplater (MDF) for å oppnå stykker med dimensjonene vist i figur 1A.
MERK: Bruk vektorfilen (tilleggsfil 1) til cnc-skjæring (numerisk kontroll). - Bygg to bokser med følgende dimensjoner (lengde x bredde x høyde): 330 mm x 235 mm x 225 mm for de større boksene, og 300 mm x 220 mm x 150 m for de mindre boksene (figur 1B).
- Bor baksiden av den større boksen for å installere en tønnekontaktkontakt. Bor toppen av den større boksen og k toppen og bunnen av den mindre boksen for å gi en passasje for elektriske kabler (figur 1C).
- Mal alle de indre overflatene med svart blekk for å fremme homogen lysforekomst (figur 1D).
- Fest parallelt tre LED-bånd med 10 lysdioder hver på den øvre indre overflaten av den mindre boksen (figur 1E).
- Installer en lysstyrkesensor i midten av den nederste indre overflaten av den mindre boksen (figur 1F).
- Skriv ut strukturen til kontrollenheten (figur 1G) ved hjelp av 3D-utskriftsfilen (tilleggsfil 2).
- Installer alle komponentene (strømknapp, potensiometre, tid / start-berøringsplate, lysdioder, lysstyrkesensor, LCD, summer og strømforsyning) ved portene på et ESP32-kontrollkort montert på kontrollenhetens interiør (figur 2).
- Last opp programmeringskoden (tilleggsfil 3, tilleggsfil 4 og tilleggsfil 5) og kjør en test for å kontrollere at alle tilkoblingene fungerer (figur 1H).
- Monter boksene og fest dem sammen for å unngå hull, og dermed ekstern lysinterferens og utsendt lystap. Fest den monterte kontrollenheten til det borede området øverst på prototypen (figur 1I).
- Fest en inngangsdør av samme materiale og 330 mm x 225 mm (lengde x bredde) dimensjoner på den større boksen med to små hengsler. Fest også borrelåsbånd sidelengs til den større boksen for å forsterke prototypens lukking (figur 1J). Installer et håndtak for å manipulere inngangsdøren til utstyret.
- Fest fire gummifotputer nederst på prototypen for å sikre mer stabilitet under operasjonene (figur 1K).
2. Cellelinjer: dyrking, såing og behandling
- Kjemikalier
- Løs opp porfyrinet i dimetylsulfoksid (DMSO) for å oppnå en konsentrasjon på 100 mM.
FORSIKTIG: DMSO må manipuleres forsiktig (håndtering ved bruk av personlig verneutstyr og i et ventilert område). Manipuler både lager og fortynnede oppløsninger nøye for å unngå overdreven lyseksponering.
- Løs opp porfyrinet i dimetylsulfoksid (DMSO) for å oppnå en konsentrasjon på 100 mM.
- Cellelinjer
- Dyrk HeLa-cellelinjen i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) lavglukosemedium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% gentamicin.
- Oppbevar kulturkolber i en 5% CO2 cellekulturinkubator ved 37 °C.
- Administrer og inspiser cellene til de når 80% -90% sammenløp.
- Såing prosess
- Fjern kulturmediet fra kolben.
- Vask cellemonolaget med PBS.
- Løsne den konfluente cellekulturen med trypsin-EDTA (0,5 %) 1x i 5 minutter ved 37 °C. Stopp virkningen av trypsin ved å resuspendere cellene med kulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% gentamicin.
- Tell de resuspenderte cellene med et hemocytometer og frø dem i en 96-brønnplate ved 2,0 × 104 celler / brønn.
- Forbered to plater for mørke og lyse forhold.
- Inkuber platene i 24 timer for cellefesting.
- Behandlingsprosess
- Fjern mediet fra begge 96-brønnsplatene.
- Behandle cellene med 100 μL økende konsentrasjoner av verteporfin (0,045 til 24 μM, seriell fortynning).
- Inkuber cellene med narkotikabehandling i 24 timer for å tillate verteporfin internalisering.
- Etter 24 timer, kast mediet som inneholder stoffet, vask monolaget av celler med PBS (100 μL), og tilsett stofffritt medium (100 μL).
- Dekk en mikroplate med aluminiumsfolie for å beskytte den mot lyseksponering og inkuber den i 24 timer. Denne platen vil gi kontrolldata for PDT-resultater (mørk tilstand). Den andre mikroplaten vil bli brukt på lyseksponeringstilstanden i enheten.
3. Enhetens drift
- Koble PDT-enheten til stikkontakten og slå den på ved å trykke på strømknappen .
- Plasser den andre mikroplaten (lystilstanden) i PDT-enheten og lukk utstyret ved å feste inngangsdøren med borrelåsbåndene.
- Bruk potensiometrene til å justere RGB-konfigurasjonen (et RGB 255, 255 , 255-eksperiment her) og angi fargen på lysutslipp.
MERK: Hver RGB-kombinasjon har et spesifikt utslippsspekter, som må justeres for eksperimenter med forskjellige fotosensibilisatorer og følgelig forskjellige absorbanskurver. - Trykk på ( +)/(-) pekeplaten for å justere tidskonfigurasjonen (et 60 minutters eksperiment her) og angi varigheten av analysen.
MERK: Tidskonfigurasjonen, i tilknytning til bestrålingsverdien, vil bestemme fluensen av prosessen - lysdosen som brukes i analysen. - Sjekk oppsettinformasjonen på displayet.
- Trykk på Start-knappen for å starte analysen. Forsikre deg om at en buzzer med ett pip høres i begynnelsen av analysen.
- I løpet av eksperimentet observerer du sanntidsinformasjon på skjermen, for eksempel bestråling og tid igjen.
- Ikke åpne inngangsdøren eller endre noen konfigurasjon under PDT-analysen.
- På slutten av analysen, vent på en fire-pip buzzer og for det elektroniske systemet å slå av alle lysdiodene. Observer en Ferdig-melding og den endelige mengden energi brukt under eksperimentet i displayet.
MERK: Den endelige flytverdien beregnes ved hjelp av ligning (1):
(1)
Der F er lik J/cm 2 og I er lik mW/cm 2 eller mJ/s·cm 2. Bestrålingsverdien vurderer styrken til lysdiodene (emitterende kilde) og det jevnt bestrålte området i det mørke kammeret (660 cm 2) (ligning [2]):
(2)
Den teoretiske bestrålingsverdien vises på enhetsdisplayet gjennom hele PDT-analysen. På slutten av operasjonen, bruk ligning (3) for å beregne flyt:
Fluens (F) = bestråling (I, konstant verdi) × driftstid (er) (3)
(1)
(2)4. Cell levedyktighet analyse
- Etter PDT-analysen, dekk mikroplaten som ble utsatt for lys og inkuber i 24 timer.
- Etter inkubasjonsperioden, fjern kulturmediet fra begge platene, vask monolaget av celler med PBS (100 μL), og tilsett MTT-løsning (0,5 mg / ml, 100 μL). Inkuber begge platene - mørke og lyse forhold - i 4 timer for å tillate formazankrystalldannelse.
- Fjern MTT-oppløsningen forsiktig og løs opp de lilla krystallene med en DMSO/etanol (1:1)-løsning.
- Etter fullstendig oppløsning av krystallene, utfør absorbansmålingen ved hjelp av en mikroplateleser ved 595 nm.
MERK: Enheten kan brukes i andre viktige eksperimenter som ROS-mediert celledød utløst av fotosensibilisatorer etter lyseksponering ved flowcytometri30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den endelige PDT-enheten, kalt PhotoACT, inkluderte et mørkt kammer for å tildele opptil fire multiwell mikroplater, med sin øvre indre overflate utstyrt med et sett med 30 spredte lysdioder programmert til å avgi forskjellige spektrum av synlig lys (figur 3 og tilleggsfil 6). Enheten ble bygget ved hjelp av to tilhørende bokser: en intern boks designet som et mørkt kammer for PDT-analysene, og en ekstern boks for å dekke det indre kammeret og holde kontrollenheten (figur 1B). Den interne boksen ble malt svart (figur 1D) og sammensatt av en tapemodell av LED RGB WS2812 (eller WS281B) med 30 lysdioder og 1 m lengde (som senere ble kuttet i tre stykker) og 9 watt, som har en innebygd prosessor. Dette apparatet tillot en mer kontrollert utnyttelse og følgelig mer nøyaktig fargeutslipp. De 30 lysdiodene ble likt fordelt over hele den øvre indre overflaten av PDT-kammeret med tre parallelle bånd med 10 lysdioder hver (figur 1E). En homogen lysforekomst ble etablert på grunn av den lave reflektiviteten til de svarte innvendige overflatene og den ensartede fordelingen av LED-konfigurasjon. En TSL2561 lysstyrkesensor ble også innlemmet i bunnen av midten av den interne boksen for å indikere lysinnfallet og tjene som et kvalitetskontrollverktøy, som garanterer bestrålingsuniformitet inne i det mørke kammeret (tilleggstabell S1) og overvåker strømmen til LED-systemet, som er kjent for å ha et visst antall timers levetid (figur 1F ). Den eksterne boksen er en struktur som dekker den indre boksen, sammensatt av seks MDF-deler, malt grå og laserskåret for perfekt passform (figur 1A, B). Kontrollenheten ble designet ved hjelp av online programvare31, 3D-printet med polymelkesyre som en enkelt del ved hjelp av en 3D-skriver og malt grå. Den inneholder alle elektronikkkomponentene, inkludert en skjerm, potensiometre, knapper og en summer (figur 1I og figur 2).
For å muliggjøre uavhengige lysinsidensjusteringer ble ESP32-styrekortet valgt for å integrere kontrollenheten (figur 2). Denne konfigurasjonen skal tillate et USB-grensesnitt for programmering, Bluetooth, Wi-Fi, dual core prosessor, mange porter, og muligheten til å kommunisere med en interintegrert krets (I2C), et serielt perifert grensesnitt (SPI) og andre grensesnitt. For å betjene systemet ble et program skrevet på C-språk gjennom et integrert utviklingsmiljø (IDE). Kodestrukturen32 er basert på FreeRTOS, et gratis sanntids operativt system støttet av ESP32 kontrollerkort. Den refererte logikken tillater uavhengig applikasjonsprogrammering, som kan behandles av ESP32 i echeloned eller parallelle tilnærminger, noe som gjør prosjektet og dets vedlikeholds-, forbedrings- og oppdateringsprosesser mye mer allsidig og sikker.
Grensesnittet mellom maskinen og operatøren er brukervennlig og besto av en LCD-skjerm (Liquid Crystal Display), potensiometre, knapper og en summer (figur 3 og tilleggsfil 6). Den lille, 16 mm x 2 mm (kolonner vs. linjer) LCD hadde en innebygd HD44780-kontroller med en I2C kommunikasjonsprotokoll, som gir enkel installasjon og overføring allsidighet, henholdsvis. Det foreløpige oppsettet inkluderer RGB og tidsjusteringer av operatøren. Lysstørrelsen og fargekonfigurasjonen kan justeres ved hjelp av potensiometrene, som endrer intensiteten (0 til 255) til de tre grunnleggende fargekomponentene - RGB. Disse justeringene kan resultere i flere fargekomposisjoner adressert i den internasjonale RGB-fargetabellen33. Hver RGB-sammensetning eier en bestemt bølgelengde, som må justeres i henhold til PS som brukes i PDT-eksperimentet; absorbanskurven til PS og bølgelengden til bestrålingen må overlappes for at fotoaktiveringen skal skje tilfredsstillende (supplerende figur S1). Underveis i prosessen kan du få tilgang til driftsstatus med gjenværende tid og informasjon om lysforekomst på LCD-skjermen.
På slutten av den programmerte tiden slo elektronikksystemet av alle lysdiodene, sendte ut en hørbar advarsel og viste på displayet den totale mengden energi per område (J / cm²), som ble beregnet ved å multiplisere den konstante verdien av bestråling med driftstiden i sekunder. Denne digitale modellen presenterte et bredt spekter av deteksjonsnivåer (grenser mellom 0,1 og 40 000+ lux), et I2C-grensesnitt og en lav intensitet av elektrisk strøm (henholdsvis 0,5 mA og 15 μA i drifts- og standbystatus).
Som et bevis på konseptet ble enheten brukt til å forbedre den cytotoksiske effekten av verteporfin i 2D HeLa-cellekultur etter lyseksponering på 1 time (49,1 ± 0,6 J / cm2). Som vist i figur 4A var GI50-verdien 3,1 μM for lystilstanden og 13,8 μM for mørk tilstand. Dermed validerte det 4,4 ganger skiftet som sammenlignet betingelsene bruken av verteporfin som PS og anvendeligheten av PhotoACT til PDT-analyser. For å validere bruken av prototypen beskrevet i dette arbeidet, ble en kommersiell PDT-enhet brukt under de samme eksperimentelle forholdene, inkludert en PS, celler og flyt, og resultatene sammenlignet. Som vist i figur 4B, fotoaktiverte begge enhetene verteporfin likt, noe som forbedret den cytotoksiske effekten. Disse resultatene bekreftet anvendeligheten av dette i husbygget PDT-enhet (figur 4A, B). Endelig ble ROS-mediert celledød utløst av verteporfin etter lyseksponering bekreftet ved flowcytometri ved bruk av DCFDA-analyse (figur 4C, D).
Figur 1: PhotoACT konstruksjons- og monteringsanvisninger. Detaljert illustrasjon av konstruksjon av, boring, maling, montering og tilbehør komponenter i enheten. Panelet viser en trinn-for-trinn-guide for å bygge enheten. Forkortelse: LED = lysemitterende diode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kontrollenhetens konstruksjon og elektroniske installasjonsinstruksjoner. Innzoomet visningstegning av eksplodert kontrollenhet og detaljert skjema for elektroniske tilkoblinger ved ESP32-kontrollerkortporter med tilkoblinger og komponenter som brukes i prototypen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: PhotoACT-representasjon. Monteringstegning av det endelige produktdesignet med stykkliste, merkeballonger og detaljert visning av de øvre innvendige lysdiodene. Figuren gjør det mulig å identifisere deler og komponenter i prototypen. Forkortelser: MDF = fiberplate med middels tetthet; LED = lysemitterende diode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: In vitro fototoksisitet av verteporfin og ROS generasjon. (A,B) Celle levedyktighetsanalyse utført ved bruk av MTT-metoden: analysene ble utført for å evaluere den cytotoksiske profilen til fotosensibilisatorverteporfin ved forskjellige konsentrasjoner. HeLa-celler ble behandlet i 24 timer med forskjellige konsentrasjoner av verteporfin (0,045-24 μM), utsatt for lys (PhotoACT (A) eller kommersielt PDT-utstyr (B)) eller mørke forhold, og deretter utsatt for MTT-analysen. Begge forholdene viste redusert celle levedyktighet ved høyere konsentrasjoner av verteporfin, men lyseksponeringen - oppnådd fra PDT-analyser - forbedret den cytotoksiske profilen til PS, noe som innebærer at PDT øker cytotoksisiteten til verteporfin. Levedyktighetskurvene ble montert ved hjelp av GraphPad Prism 6-programvare. (C,D) HeLa-celler ble behandlet i 24 timer med lave og høye konsentrasjoner av verteporfin (0,187 μM og 6 μM) og deretter utsatt for lys (PhotoACT) eller mørke forhold. Intracellulære ROS-verdier ble målt etter bestråling ved flowcytometri ved bruk av DCFDA-sonde (inkubasjon i 30 minutter ved 1 μM). Et høyre skifte mellom histogrammene innebar høyere fluorescensintensitet på grunn av høyere intracellulær akkumulering av DCF, og dermed større ROS-nivåer. Resultatene viste ingen relevant forskjell i ROS-nivåer i mørk tilstand (C), men viste en dose-respons-økning i ROS-nivåer etter verteporfinfotoaktivering (D). Forkortelser: ROS = reaktive oksygenarter; DCF = 2',7'-diklorfluorescein; DCFDA = 2',7'-diklorhydrofluoresceindiacetat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Enhetens beslutningsflytskjema: foreløpig feilsøking av oppsett og drift. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Overlapping mellom absorbanskurven til verteporfin og LED-utslippsspekteret til enheten. Absorpsjonsspektrum av verteporfin med dets spesifikke absorbanstopper (x, y ') og LED-utslippsspektrum av RGB 255, 255, 255-hvit farge (3,700K-5,000K CCT) som brukes til å fotoaktivere fotosensibilisatoren (x, y''). Overlappingen mellom de forskjellige absorberende toppene av verteporfin og det hvite bestrålingslyset bekrefter fotoaktiveringen av fotosensibilisatoren, som også ble bekreftet av de biologiske resultatene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Bestrålingsuniformitetstester. Øyeblikkelig lysstyrke (lumen) målt av lysstyrkesensoren på forskjellige punkter i det bestrålte området. De presenterte resultatene viser ingen ekspressiv variasjon, noe som vitner om den ensartede bestrålingen av enheten. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Vektorfil for kutting. Tegning (DWG) fil for MDF bord skjæring. Filen må brukes til datamaskin numerisk kontroll (CNC) skjæring. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: 3D-utskriftsfil for enhetskontrollen. Stereolitografi (STL) fil for å 3D-printe kontrollenheten til enheten. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: C-programmeringskode. Programmeringskode utviklet i C-språk for konfigurering av kontrollenheten til utstyret. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: INO-programmeringskode. Programmeringskode utviklet i INO-språk for konfigurering av kontrollenheten til utstyret. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 5: Instruksjoner for kompilering. Markdown (MD) "READ ME" -fil med tilleggsinstruksjoner for programmering av kodekompilering. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 6: Designmodell av enheten. Forhåndsvisning av den tredimensjonale modellfilen Standard for utveksling av produktdata (STEP) for generell visualisering av prototypen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den endelige PhotoACT-enheten var praktisk å konstruere med kommersielt tilgjengelige, rimelige komponenter til en total kostnad på mindre enn $ 50. Ytterligere fordeler inkluderer lave vedlikeholdsbehov, kapasitet til å bestråle flere typer kulturplater, samtidig bruk av opptil fire enheter per analyse, lav vekt (2 kg) / størrelse (44 cm3) som tillater bærbarhet, nøyaktig og reproduserbar bestråling (data ikke vist), og et brukervennlig og enkelt oppsettgrensesnitt som ikke krever tilkobling til datamaskiner eller andre maskiner.
Visse kritiske trinn i både konstruksjons- og driftsprotokoller ga opphav til forbedringsmuligheter under prosjektunnfangelsen. Siden et PDT-kammer krever homogen lysutslipp og konsekvent energimåling, ble de interne og eksterne boksene forseglet for å unngå både utvendig lysinterferens og tap av lys. Ytterligere borrelåsbånd ble festet sidelengs på frontdøren for å forsterke kammerlukningen og sikre uavbrutte eksperimenter. En representativ LED ble installert på kontrollenheten for å sertifisere den nødvendige RGB-konfigurasjonen, som indikerer fargen og intensiteten til det utsendte lyset under analysen. Til slutt gjennomgikk programmeringskoden flere oppgraderinger for å avgrense øyeblikkelige tetthetsmålinger og endelige mengder energievalueringer, godkjenne reproduserbarhet og matematisk konsistens. Noen andre viktige detaljer som krever ekstra oppmerksomhet inkluderer: (i) homogen fordeling av lysdioder og sentral posisjonering av lysstyrkesensoren for å oppnå representative og balanserte resultater, (ii) installasjon av alle komponenter i henhold til det elektroniske diagrammet (figur 2) og programmeringskode (tilleggsfil 3, tilleggsfil 4 og tilleggsfil 5 ) for å sikre riktig drift og (iii) oppsettet (beholde samme RGB- og tidskonfigurasjon) før du kjører et eksperiment for å sikre konsekvente repliker med pålitelige resultater. Selv om RGB-systemet gir flere synlige fargekomposisjoner med spesifikke bølgelengder, vil eksperimenter med ikke-synlig lys kreve spesifikke protokolloppgraderinger. Et beslutningsflytskjema er presentert i figur 5 for å gi en systematisk problemløsende tilnærming for å finne og rette opp problemer eller feil under operasjonen.
Designet for å møte kravene til in vitro-eksperimentering med validerte resultater oppnådd med terapeutisk aktivering av verteporfin for å indusere cytotoksisitet i 2D HeLa-celler (figur 4), kan PhotoACT anbefales for universiteter, skoler, næringer og andre forskningssentre. Denne enheten skal utvide fordelene med PDT til vitenskapelig forskning som utforsker virkningsmekanismen til fotosensibilisatorer og deres kliniske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Arthur Henrique Gomes de Oliveira og Lucas Julian Cruz Gomes for hjelpen med filmprosessen. Dette prosjektet ble støttet av det brasilianske forskningsrådet (CNPq, tilskuddsnummer 400953/2016-1-404286/2021-6) og Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). Denne studien ble også delvis finansiert av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), https://gco.iarc.fr/today/home 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A.
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what's past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two - cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R.
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- T. SketchUp. , Available from: https://www.sketchup.com/ (2022).
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc. , Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022).
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc. , Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022).
