Summary
여기에서는 2차원 HeLa 세포 배양 및 베르테포르핀을 감광제로 사용하여 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 성공적으로 수행할 수 있는 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다.
Abstract
이 백서에서는 PhotoACT라는 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 수행하기 위한 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다. 이 장치는 기존의 프로그래밍 가능 발광 다이오드(LED), 액정 디스플레이(LCD) 모듈 및 상용 마이크로 컨트롤러 기판에 연결된 광 센서 세트를 사용하여 제작되었습니다. 프로토 타입의 박스 기반 구조는 중간 밀도 섬유판 (MDF)으로 만들어졌습니다. 내부 구획은 4개의 세포 배양 멀티웰 마이크로플레이트를 동시에 할당할 수 있습니다.
개념 증명으로 2차원(2D) 배양에서 HeLa 세포주에 대한 광민감제(PS) 베르테포르핀의 세포독성 효과를 연구했습니다. HeLa 세포를 24 시간 동안 증가하는 농도의 베르테 포르핀으로 처리했습니다. 약물-함유 상청액 배지를 버리고, 부착성 세포를 인산완충식염수(PBS)로 세척하고, 약물-없는 배지를 첨가하였다. 이 연구에서, 세포에 대한 베르테 포르 핀의 효과는 255, 255 및 255의 적색-녹색-청색 (RGB) 값 (평균 플루언스 49.1 ± 0.6 J / cm2)을 사용하여 빛에 노출되지 않거나 1 시간 동안 노출된 후 조사되었습니다. 24시간 후, 세포 생존율을 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 분석에 의해 평가하였다.
실험 결과는 베르테 포르 핀으로 처리 된 세포를 장치의 빛에 노출시키는 것이 활성 산소 종 (ROS)에 의해 매개되는 메커니즘을 통해 약물의 세포 독성 효과를 향상시키는 것으로 나타났습니다. 또한이 작업에 설명 된 프로토 타입의 사용은 결과를 상용 PDT 장치와 비교하여 검증되었습니다. 따라서이 LED 기반 광 역학 치료 프로토 타입은 PDT의 체외 연구를위한 좋은 대안을 나타냅니다.
Introduction
가장 치명적인 비전염성 질병 중 암은 조기 사망의 세계적인 주요 원인입니다. 2020년에는 거의 1,000만 명이 사망했으며, 이는 전 세계적으로 사망자 6명 중 1명에 해당합니다1. 또한 다제 내성(MDR) 현상은 승인된 화학 요법 프로토콜이 이임상 상태에 대한 완화 단계에 도달하지 못하기 때문에 엄청난 공중 보건 위협을 나타냅니다2. 암세포는 여러 메커니즘을 통해 화학 요법에 대한 내성을 개발할 수 있습니다. 그러나, 일부 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체(ATP-의존성 유출 펌프)의 과발현은 종양 미세환경 내에서 MDR 발달의 주요 원인으로 간주된다3. MDR 외에도 재발 및 전이와 같은 다른 암 합병증은 이러한 종양학적 문제를 극복하기 위한 치료 접근법을 개발하고 개선해야 하는 긴급한 요구를 강화합니다.
빛의 치료 적 활용은 수세기 동안 실행되어 왔으며 4 광역학 요법 (PDT)은 고형 종양에 대해 임상 적으로 승인 된 치료 접근법을 나타냅니다. PDT는 광감작제(PS) 투여 후 광 조사를 결합하여 활성 산소 종(ROS)을 생성하여 종양 세포에서 선택적 세포 독성을 발휘합니다. 이 치료 접근법은 수술, 방사선 및 화학 요법을 포함한 기존의 방법보다 우수합니다5; 결합 조직에서 더 낮은 세포 독성을 나타내는 최소 침습적 기술입니다6. 종양 또는 그 미세 환경에 직접 가벼운 적용과 PS 축적은 정확한 표적화를 보장하고, 결과적으로 경미하고 바람직하지 않은 전신 부작용7 및 동일한 부위에서의 반복 치료 가능성을 보장합니다. 또한 비용은 다른 접근 방식보다 저렴합니다. 그의 유망한 특징으로 인해, PDT는 단일, 특히 수술불가능한 종양의 경우 또는 보조 암 치료7 모두에 적합한 옵션으로 간주될 수 있으며, 화학요법 8,9와 관련된 MDR에 대한 대안을 나타낸다.
PDT를 사용하여 높은 객관적 반응률을 보여주는 첫 번째 보고서는 1975 년 마우스 및 래트 모델10에서 설명되었습니다. 그 이후로, 2D 세포 배양11,12에서 인간 종양 세포주와 함께 생체 내 및 시험관 내 모두에서 긍정적 인 결과7를 가진 PDT를 사용하여 연구가 수행되었습니다. 임상 적으로 승인 된 PS의 광범위한 적용 가능성을 고려할 때, 특정 축적 경로 및 흡수 피크의 파장 범위에 관계없이 일반적인 프로세스는 다음과 같습니다 : (i) PS 흡수, (ii) 종양 또는 미세 환경에서 PS 농도의 피크, (iii) 광 적용, (iv) PS- 광 상호 작용, (v) PS 여기 상태 에너지를 조직 기질 또는 주변 산소 분자로 전달, (vi) 일중항 산소 또는 슈퍼옥사이드 음이온을 수반하는 ROS 생산, (vii) 본질적으로 괴사 또는 세포자멸사멸(직접 사망), 자가포식(세포 보호 메커니즘), 조직 허혈(혈관 손상), 면역 조절 또는 이러한 메커니즘의 중첩을 통한 종양 세포 사멸7. 이 마지막 단계에서, 특정 세포 사멸 경로의 활성화는 세포 특성, 실험 설계 및 가장 중요하게는 PS 세포 내 국소화 및 PDT 관련 표적 손상과 같은 많은 인자에 의존한다13.
Verteporfin은 연령 관련 황반 변성을 치료하기 위해 노르웨이와 중국에서 임상 사용을 위해 규제 기관의 승인을 받은 2세대 PS입니다7. 용량 전달 후, 이 전구약물은 미토콘드리아14에 부분적으로 축적되고 세포 단백질 티로신 인산화 및 DNA 단편화를 유도하여 종양 세포 세포사멸15,16을 유도하는 것으로 보고되었습니다. 베르테포르핀 내재화를 위한 24시간 배양 후, 인접한 분자 7,17로의 전자기 방사선 전달의 효과적인 수준을 달성하기 위해 690nm 파장 셋업을 사용하는 PDT 프로토콜이 권장됩니다.
PDT의 광원과 관련하여 클래식 다이오드 레이저 시스템은 일반적으로 비싸고 기술적으로 복잡하며 크기가 커서 휴대 할 수 없습니다18,19. LED 기반 PDT 장비에서도 관찰할 수 있는 단일 파장 프로파일의 결과로 각 감광제 응용 분야에 대한 독립적인 장치에 대한 요구로 인해 다이오드 레이저 시스템의 활용이 훨씬 더 복잡하고 경제적으로 실현 불가능해집니다20,21. 따라서 LED 기계의 활용은 비용(22) 및 유지 보수 문제뿐만 아니라 높은 전력 출력과 덜 유해한 23 및 더 넓은 조명 기능(24,25,26,27)을 제공하는 가장 유망한 대안으로 간주됩니다.
LED 기반 장비가 PDT 실험(28)에 제공할 수 있는 잠재적인 기여에도 불구하고, 대부분의 상업적 옵션은 여전히 휴대성 부족, 높은 비용, 및 복잡한 건설 프로젝트 및 운영(29)과 같은 단점을 가지고 있다. 이 연구의 주요 목적은 체외 PDT 분석을 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 도구를 제공하는 것이었습니다. 이 백서에서는 저렴하고 사용자 친화적이며 휴대가 가능한 자체 내장 LED 기반 PDT 장치인 PhotoACT에 대해 설명합니다. 개념 증명으로이 장치는 2D 세포 배양 모델에서 베르테 포르 핀의 세포 독성을 향상시키는 것으로 나타 났으므로 PDT 실험에서 연구 도구로 사용할 수 있습니다.
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Protocol
참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 장치 구성
- 3mm 두께의 중밀도 섬유판(MDF)을 톱질하여 그림 1A에 표시된 치수의 조각을 얻었습니다.
알림: 컴퓨터 수치 제어(CNC) 절단을 위해 벡터 파일(보충 파일 1)을 사용하십시오. - 큰 상자의 경우 330mm x 235mm x 225mm, 작은 상자의 경우 300mm x 220mm x 150m의 치수(길이 x 너비 x 높이)로 두 개의 상자를 만듭니다(그림 1B).
- 더 큰 상자의 뒷면을 뚫어 배럴 잭 커넥터를 설치합니다. 큰 상자의 상단과 작은 상자의 상단과 하단을 뚫어 전기 케이블을 위한 통로를 제공합니다(그림 1C).
- 균일한 광 입사를 촉진하기 위해 모든 내부 표면을 검은색 잉크로 칠합니다(그림 1D).
- 작은 상자의 내부 상단 표면에 각각 10개의 LED가 있는 3개의 LED 테이프를 병렬로 연결합니다(그림 1E).
- 작은 상자의 내부 바닥 표면 중앙에 밝기 센서를 설치합니다(그림 1F).
- 3D 프린팅 파일(보충 파일 2)을 사용하여 제어 장치(그림 1G)의 구조를 인쇄합니다.
- 제어 장치 내부에 장착된 ESP32 제어 보드의 포트에 모든 구성 요소(전원 단추, 전위차계, 시간/시작 터치패드, LED, 밝기 센서, LCD, 부저 및 전원 공급 장치)를 설치합니다(그림 2).
- 프로그래밍 코드(보충 파일 3, 보충 파일 4 및 보충 파일 5)를 업로드하고 테스트를 실행하여 모든 연결이 작동하는지 확인합니다(그림 1H).
- 상자를 조립하고 함께 고정하여 틈을 방지하고 결과적으로 외부 광 간섭 및 방출되는 광 손실을 방지하십시오. 장착된 제어 장치를 프로토타입 상단의 드릴 영역에 부착합니다(그림 1I).
- 동일한 재질과 330mm x 225mm(길이 x 너비) 치수의 전면 도어를 두 개의 작은 경첩이 있는 더 큰 상자에 고정합니다. 또한 벨크로 테이프를 더 큰 상자에 옆으로 부착하여 프로토타입 폐쇄를 강화합니다(그림 1J). 장비의 전면 도어를 조작하기 위해 핸들을 설치하십시오.
- 프로토타입 하단에 고무 풋 패드 4개를 부착하여 작업 중 안정성을 높입니다(그림 1K).
2. 세포주 : 재배, 파종 및 처리
- 화학 물질
- 포르피린을 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 용해시켜 100 mM의 농도를 달성한다.
주의 : DMSO는 조심스럽게 조작해야합니다 (개인 보호 장비를 사용하고 통풍이 잘되는 곳에서 취급). 과도한 빛 노출을 피하기 위해 스톡 용액과 희석 용액을 조심스럽게 조작하십시오.
- 포르피린을 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 용해시켜 100 mM의 농도를 달성한다.
- 세포주
- Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM) 저혈당 배지에서 10 % 태아 소 혈청과 1 % 겐타 마이신이 보충 된 HeLa 세포주를 배양하십시오.
- 배양 플라스크를 37°C의 5%CO2 세포 배양 배양기에 보관한다.
- 80%-90% 합류에 도달할 때까지 세포를 관리하고 검사합니다.
- 시드 과정
- 플라스크로부터 배양 배지를 제거한다.
- 세포 단층을 PBS로 세척하십시오.
- 융합 세포 배양물을 트립신-EDTA(0.5%) 1x로 37°C에서 5분 동안 분리합니다. 10% 태아 소 혈청과 1% 겐타마이신이 보충된 배양 배지로 세포를 재현탁시켜 트립신의 작용을 중지시킨다.
- 혈구계로 재현 된 세포를 세고 2.0 × 104 세포 / 웰에서 96 웰 플레이트에 시드합니다.
- 어둡고 밝은 조건을 위해 두 개의 판을 준비하십시오.
- 세포 부착을 위해 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.
- 치료 과정
- 두 96웰 플레이트에서 배지를 제거합니다.
- 세포를 100 μL의 증가하는 농도의 베르테포르핀(0.045 내지 24 μM, 연속 희석)으로 처리한다.
- 베르테포르핀 내재화를 허용하기 위해 24시간 동안 약물 치료로 세포를 배양합니다.
- 24시간 후, 약물을 함유하는 배지를 버리고, 세포의 단층을 PBS(100 μL)로 세척하고, 약물이 없는 배지(100 μL)를 첨가한다.
- 하나의 마이크로 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛 노출로부터 보호하고 24 시간 동안 배양하십시오. 이 플레이트는 PDT 결과(어두운 상태)에 대한 제어 데이터를 제공합니다. 다른 마이크로플레이트는 장치 내의 광 노출 조건에서 활용될 것이다.
3. 장치 작동
- PDT 장치를 전기 콘센트에 꽂고 전원 단추를 눌러 켭니다.
- 다른 마이크로플레이트(조명 상태)를 PDT 장치에 넣고 전면 도어를 벨크로 테이프로 고정하여 장비를 닫습니다.
- 전위차계를 사용하여 RGB 구성을 조정하고(RGB 255 , 255, 255 실험) 발광 색상을 설정합니다.
참고: 각 RGB 조합에는 특정 방출 스펙트럼이 있으며, 이는 다른 감광제 및 결과적으로 다른 흡광도 곡선을 사용한 실험을 위해 조정되어야 합니다. - (+)/(-) 터치패드를 눌러 시간 구성(여기서는 60분 실험)을 조정하고 분석 기간을 설정합니다.
참고: 시간 구성은 방사 조도 값과 관련하여 공정의 플루언스(분석에 적용된 광량)를 결정합니다. - 디스플레이에서 설정 정보를 확인하십시오.
- 시작 버튼을 눌러 분석을 시작합니다. 분석 시작 시 한 번의 비프음 부저가 들리는지 확인합니다.
- 실험 과정에서 방사 조도 및 남은 시간과 같은 디스플레이의 실시간 정보를 관찰하십시오.
- PDT 분석 중에 전면 도어를 열거나 구성을 변경하지 마십시오.
- 분석이 끝나면 4 번의 경고음이 울리고 전자 시스템이 모든 LED를 끌 때까지 기다립니다. 디스플레이에서 실험 중에 Finished 메시지와 소비된 에너지의 최종 양(플루언스)을 관찰합니다.
참고: 플루언스 최종 값은 방정식 (1)을 사용하여 계산됩니다.
(1)
여기서 F는 J/cm2이고 I는 mW/cm2 또는 mJ/s·cm2와 같습니다. 방사 조도 값은 LED (방출원)의 효능과 어두운 챔버 (660cm 2)의 균일하게 조사 된 영역을 고려합니다 (식 [2]).
(2)
이론적 방사 조도 값은 전체 PDT 분석에 걸쳐 장치 디스플레이에 표시됩니다. 작업이 끝나면 방정식 (3)을 사용하여 플루언스를 계산하십시오.
플루언스 (F) = 방사 조도 (I, 상수 값) × 작동 시간 (s ) (3)
(1)
(2)4. 세포 생존율 분석
- PDT 분석 후, 빛에 노출된 마이크로플레이트를 덮고 24시간 동안 배양한다.
- 배양 기간 후, 양쪽 플레이트로부터 배양 배지를 제거하고, 세포의 단층을 PBS(100 μL)로 세척하고, MTT 용액(0.5 mg/ml, 100 μL)을 첨가한다. 포르마잔 결정 형성을 허용하기 위해 두 플레이트(어두운 조건과 밝은 조건)를 4시간 동안 배양합니다.
- MTT 용액을 조심스럽게 제거하고 DMSO / 에탄올 (1 : 1) 용액으로 보라색 결정을 녹입니다.
- 결정의 완전 용해 후, 595 nm에서 마이크로플레이트 리더를 이용하여 흡광도 측정을 수행한다.
참고: 이 장치는 유세포분석법30에 의한 광 노출 후 광감작제에 의해 유발된 ROS-매개 세포 사멸과 같은 다른 중요한 실험에 사용될 수 있다.
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Representative Results
PhotoACT라는 이름의 최종 PDT 장치에는 최대 4개의 멀티웰 마이크로플레이트를 할당할 수 있는 암실이 포함되어 있으며, 상부 내부 표면에는 가시광선의 뚜렷한 스펙트럼을 방출하도록 프로그래밍된 30개의 산란된 LED 세트가 장착되어 있습니다(그림 3 및 보충 파일 6). 이 장치는 PDT 분석을 위한 어두운 챔버로 설계된 내부 상자와 내부 챔버를 덮고 제어 장치를 고정하는 외부 상자의 두 가지 관련 상자를 사용하여 제작되었습니다(그림 1B). 내부 상자는 검은색으로 칠해졌고(그림 1D) 30개의 LED와 1m 길이(나중에 3개로 절단됨) 및 내장 프로세서가 있는 9와트의 LED RGB WS2812(또는 WS281B)의 테이프 모델로 구성되었습니다. 이 장치는보다 제어 된 활용도를 허용하고 결과적으로 더 정확한 색상 방출을 허용했습니다. 30개의 LED는 각각 10개의 LED가 있는 3개의 병렬 테이프로 PDT 챔버의 전체 상부 내부 표면에 균등하게 분배되었습니다(그림 1E). 검은 색 내부 표면의 낮은 반사율과 LED 구성의 균일 한 분포로 인해 균일 한 광 입사가 설정되었습니다. TSL2561 밝기 센서는 또한 내부 상자의 하단 중앙에 통합되어 광 입사를 표시하고 품질 관리 도구 역할을 하여 어두운 챔버 내부의 조사 균일성을 보장하고(보충 표 S1) 일정 시간의 유효 수명을 갖는 것으로 알려진 LED 시스템의 전력을 모니터링합니다(그림 1F ). 외부 상자는 내부 상자를 덮는 구조로, 6개의 MDF 부품으로 구성되어 회색으로 칠해져 있으며 완벽하게 맞도록 레이저 절단되었습니다(그림 1A,B). 제어 장치는 온라인 소프트웨어(31)를 사용하여 설계되었으며, 3D 프린터를 사용하여 단일 부품으로 폴리 락트산으로 3D 인쇄되고 회색으로 칠해졌습니다. 디스플레이, 전위차계, 버튼 및 부저를 포함한 모든 전자 부품을 보유합니다(그림 1I 및 그림 2).
독립적인 광 입사 조정을 가능하게 하기 위해 ESP32 컨트롤러 기판을 선택하여 제어 장치를 통합했습니다(그림 2). 이 구성은 프로그래밍, 블루투스, Wi-Fi, 듀얼 코어 프로세서, 수많은 포트 및 I2C(내부 집적 회로), 직렬 주변 장치 인터페이스(SPI) 및 기타 인터페이스와 통신하는 기능을 위한 USB 인터페이스를 허용해야 합니다. 시스템을 운영하기 위해 프로그램은 통합 개발 환경 (IDE)을 통해 C 언어로 작성되었습니다. 코드 구조(32 )는 ESP32 컨트롤러 보드에 의해 지원되는 무료, 실시간 운영 시스템인 FreeRTOS를 기반으로 한다. 참조된 논리는 ESP32에서 단계적 또는 병렬 접근 방식으로 처리할 수 있는 독립적인 애플리케이션 프로그래밍을 허용하여 프로젝트와 유지 관리, 개선 및 업데이트 프로세스를 훨씬 더 다양하고 안전하게 만듭니다.
기계와 작업자 간의 인터페이스는 사용자 친화적이며 액정 디스플레이(LCD), 전위차계, 버튼 및 부저로 구성됩니다(그림 3 및 보충 파일 6). 소형 16mm x 2mm(컬럼 대 라인) LCD에는 I2C 통신 프로토콜이 있는 HD44780 컨트롤러가 내장되어 있어 설치가 쉽고 다양한 전송을 제공합니다. 예비 설정에는 운영자의 RGB 및 시간 조정이 포함됩니다. 조명 크기 및 색상 구성은 세 가지 기본 색상 구성 요소인 RGB의 강도(0에서 255)를 수정하는 전위차계를 사용하여 조정할 수 있습니다. 이러한 조정은 국제 RGB 색상 표33에서 다루어지는 여러 색상 구성을 초래할 수 있습니다. 각 RGB 구성은 특정 파장을 소유하며 PDT 실험에 사용 된 PS에 따라 조정해야합니다. PS의 흡광도 곡선과 조사 파장이 겹쳐야 광활성화가 만족스럽게 발생합니다(보충 그림 S1). 이 과정에서 남은 시간과 입사 정보가 포함된 작동 상태를 LCD에서 액세스할 수 있습니다.
프로그래밍 된 시간이 끝나면 전자 시스템은 모든 LED를 끄고 경고음을 내며 디스플레이에 면적당 총 에너지량 (J / cm²)을 표시했으며, 이는 방사 조도의 상수 값에 작동 시간을 초 단위로 곱하여 계산되었습니다. 이 디지털 모델은 광범위한 감지 수준(0.1에서 40,000+ lux 사이의 한계), I2C 인터페이스 및 낮은 전류 강도(작동 및 대기 상태에서 각각 0.5mA 및 15μA)를 제공했습니다.
개념 증명으로, 이 장치는 1시간(49.1 ± 0.6 J/cm2)의 광 노출 후 2D HeLa 세포 배양에서 베르테포르핀의 세포독성 효과를 향상시키는 데 사용되었습니다. 도 4A에 도시된 바와 같이,GI50 값은 광 조건의 경우 3.1μM이고 어두운 조건의 경우 13.8μM이었다. 따라서, 조건을 비교하는 4.4배 시프트는 PS로서 베르테포르핀의 사용 및 PDT 분석에 대한 PhotoACT의 적용 가능성을 검증하였다. 이 작업에 설명된 프로토타입의 사용을 검증하기 위해 PS, 세포 및 플루언스를 포함한 동일한 실험 조건에서 상용 PDT 장치를 사용하고 결과를 비교했습니다. 도 4B에 도시된 바와 같이, 두 소자 모두 베르테포르핀을 동등하게 광활성화하여, 세포독성 효과를 증강시켰다. 이러한 결과는 자체 제작 PDT 장치에서이 적용 가능성을 확인했습니다 (그림 4A, B). 마지막으로, 광 노출 후 베르테포르핀에 의해 촉발된 ROS-매개 세포 사멸을 DCFDA 분석을 사용한 유세포분석에 의해 확인하였다(도 4C, D).
그림 1: PhotoACT 구성 및 조립 지침. 구성 요소의 구성, 드릴링, 페인팅, 장착 및 액세서리 구성 요소에 대한 자세한 그림입니다. 패널에는 장치를 빌드하기 위한 단계별 가이드가 표시됩니다. 약어 : LED = 발광 다이오드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 제어 장치 구성 및 전자 설치 지침. 분해 제어 장치의 확대 도면과 프로토타입에 사용된 연결 및 구성 요소가 있는 ESP32 컨트롤러 보드 포트의 전자 연결에 대한 자세한 구성표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 포토액트 표현. BOM, 라벨링 풍선 및 상부 내부 LED의 상세 보기가 있는 최종 제품 설계의 조립 도면. 이 그림을 통해 프로토 타입의 부품 및 구성 요소를 식별 할 수 있습니다. 약어 : MDF = 중간 밀도 섬유판; LED = 발광 다이오드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 베르테포르핀의 시험관내 광독성 및 ROS 생성. (A,B) MTT 방법을 사용하여 수행된 세포 생존율 분석: 상기 분석은 상이한 농도에서 광감작제 베르테포르핀의 세포독성 프로파일을 평가하기 위해 수행되었다. HeLa 세포를 다양한 농도의 베르테포르핀(0.045-24μM)으로 24시간 동안 처리하고, 빛(PhotoACT (A) 또는 상업용 PDT 장비(B)) 또는 어두운 조건에 노출시킨 다음, MTT 분석을 실시하였다. 두 조건 모두 더 높은 농도의 베르테포르핀에서 감소된 세포 생존율을 나타냈지만, PDT 분석으로부터 얻은 광 노출은 PS의 세포독성 프로파일을 향상시켰으며, 이는 PDT가 베르테포르핀의 세포독성을 향상시킨다는 것을 의미한다. 생존력 곡선은 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 장착되었습니다. (씨,디) HeLa 세포를 저농도 및 고농도의 베르테포르핀(0.187μM 및 6μM)으로 24시간 동안 처리한 후 빛(PhotoACT) 또는 어두운 조건에 노출시켰습니다. 세포내 ROS 수준은 DCFDA 프로브를 사용하여 유세포분석에 의해 조사한 후 측정하였다(1 μM에서 30분 동안 인큐베이션). 히스토그램 사이의 오른쪽 이동은 DCF의 더 높은 세포 내 축적 및 따라서 더 큰 ROS 수준으로 인해 더 높은 형광 강도를 의미했습니다. 결과는 어두운 조건(C)에서 ROS 수준에는 관련 차이가 없었지만 베르테포르핀 광활성화 후(D) ROS 수준의 용량-반응 증가를 보여주었습니다. 약어 : ROS = 활성 산소 종; DCF = 2',7'-디클로로플루오레세인; DCFDA = 2',7'-디클로로하이드로플루오레세인 디아세테이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 장치의 결정 순서도: 예비 설정 및 작동 문제 해결. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 베르테포르핀의 흡광도 곡선과 장치의 LED 방출 스펙트럼 사이의 중첩. 특정 흡광도 피크 (x, y ')가있는 베르테 포르 핀의 흡수 스펙트럼과 RGB 255, 255, 255- 화이트 컬러 (3,700K-5,000K CCT)의 LED 방출 스펙트럼은 광감작제 (x, y '')를 광활성화하는 데 사용됩니다. verteporfin의 다른 흡광도 피크와 백색 조사 광 사이의 중첩은 감광제의 광 활성화를 확증하며, 이는 생물학적 결과로도 확인되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1 : 조사 균일 성 시험. 조사 영역의 다른 지점에서 밝기 센서로 측정되는 순간 광도(루멘). 제시된 결과는 장치의 균일 한 조사를 증명하는 표현 변화를 보여주지 않습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 절단용 벡터 파일. MDF 보드 절단을위한 도면 (DWG) 파일. 이 파일은 컴퓨터 수치 제어(CNC) 절단에 사용해야 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 단위 컨트롤의 3D 인쇄 파일. 광 조형 (STL) 파일을 3D 인쇄하여 장치의 제어 장치를 인쇄합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3 : C 프로그래밍 코드. 장비의 제어 장치를 구성하기 위해 C 언어로 개발 된 프로그래밍 코드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: INO 프로그래밍 코드. 장비의 제어 장치를 구성하기 위해 INO 언어로 개발 된 프로그래밍 코드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5: 컴파일 지침. Markdown(MD) "READ ME" 파일에 프로그래밍 코드 컴파일을 위한 추가 지침이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6 : 장치의 설계 모델. 프로토타입의 일반적인 시각화를 위한 제품 데이터 교환(STEP) 삼차원 모델 파일 미리보기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최종 PhotoACT 장치는 총 50달러 미만의 비용으로 상업적으로 이용 가능한 저렴한 구성 요소로 구성하기에 편리했습니다. 추가적인 장점으로는 낮은 유지보수 요구, 여러 유형의 배양 플레이트를 조사할 수 있는 용량, 분석당 최대 4개의 장치를 동시에 사용할 수 있는 경량(2kg)/크기(44cm3), 휴대성, 정확하고 재현 가능한 조사(데이터는 표시되지 않음), 컴퓨터 또는 다른 기계에 연결할 필요가 없는 사용자 친화적이고 간단한 설정 인터페이스 등이 있습니다.
건설 및 운영 프로토콜의 특정 중요한 단계는 프로젝트 개념 중에 개선 기회를 야기했습니다. PDT 챔버는 균일한 발광과 일관된 에너지 측정이 필요하기 때문에 내부 및 외부 박스는 외부 광 간섭과 방출되는 광 손실을 모두 방지하기 위해 밀봉되었습니다. 추가 벨크로 테이프는 챔버 폐쇄를 강화하고 중단없는 실험을 보장하기 위해 전면 도어에 옆으로 고정되었습니다. 필요한 RGB 구성을 인증하기 위해 제어 장치에 대표적인 LED가 설치되어 분석 중에 방출되는 빛의 색상과 강도를 나타냅니다. 마지막으로, 프로그래밍 코드는 즉각적인 밀도 측정 및 최종 에너지 평가를 개선하기 위해 몇 가지 업그레이드를 거쳐 재현성과 수학적 일관성을 보증했습니다. 특별한주의가 필요한 다른 주요 세부 사항에는 (i) LED의 균일 한 분포 및 대표적이고 균형 잡힌 결과를 얻기위한 밝기 센서의 중앙 위치, (ii) 전자 다이어그램 (그림 2) 및 프로그래밍 코드 (보충 파일 3, 보충 파일 4 및 보충 파일 5)에 따라 모든 구성 요소를 설치하는 것이 포함됩니다. )을 사용하여 올바른 작동을 보장하고 (iii) 실험을 실행하기 전에 설정(동일한 RGB 및 시간 구성 유지)하여 신뢰할 수 있는 결과로 일관된 복제를 보장합니다. RGB 시스템은 특정 파장의 여러 가시 색상 구성을 제공하지만 비가시광 실험에는 특정 프로토콜 업그레이드가 필요합니다. 의사 결정 순서도는 그림 5 에 표시되어 작업 중에 문제 또는 오류를 찾아 수정하기 위한 체계적인 문제 해결 접근 방식을 제공합니다.
2D HeLa 세포에서 세포 독성을 유도하기 위해 베르테포르핀의 치료적 활성화로 얻은 검증된 결과를 통해 시험관 내 실험의 요구를 충족하도록 설계된 PhotoACT는 대학, 학교, 산업 및 기타 연구 센터에 권장될 수 있습니다. 이 장치는 PDT의 이점을 감광제의 작용 메커니즘과 임상 적용을 탐구하는 과학 연구로 확장해야합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
촬영 과정을 도와준 Arthur Henrique Gomes de Oliveira와 Lucas Julian Cruz Gomes에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 브라질 연구 위원회(CNPq, 보조금 번호 400953/2016-1-404286/2021-6) 및 Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021(SUS2020131000003)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001에 의해 부분적으로 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
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