Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Трансдермальное измерение скорости клубочковой фильтрации у поросят с механической вентиляцией

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64413
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, College of Medicine University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) является идеальным маркером для оценки функции почек. Однако стандартный метод измерения с использованием инъекций инулина с серийным анализом крови и мочи нецелесообразен. В этой статье описан практический метод трансдермального измерения СКФ у поросят.

Abstract

Трансдермальное измерение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) использовалось для оценки функции почек у сознательных животных. Этот метод хорошо зарекомендовал себя у грызунов для изучения острого повреждения почек и хронического заболевания почек. Тем не менее, измерение СКФ с использованием трансдермальной системы не было проверено у свиней, видов с аналогичной почечной системой для людей. Следовательно, мы исследовали влияние сепсиса на трансдермальную СКФ у анестезируемых и механически вентилируемых неонатальных свиней. Полимикробный сепсис был вызван перевязкой и пункцией слепой кишки (CLP). Трансдермальная система измерения СКФ, состоящая из миниатюрного флуоресцентного датчика, была прикреплена к бритой коже свиньи для определения клиренса флуоресцеин-изотиоцианата (FITC) конъюгированного синистрина, внутривенно вводимого индикатора СКФ. Наши результаты показывают, что через 12 ч после CLP креатинин сыворотки увеличивался при снижении СКФ. Это исследование впервые демонстрирует полезность трансдермального подхода СКФ при определении функции почек у механически вентилируемых неонатальных свиней.

Introduction

Практической и количественной оценкой функции почек является измерение скорости клубочковой фильтрации (СКФ), которое показывает, насколько хорошо почки фильтруют кровь на основе принципа клиренса1. Более ранний метод измерения СКФ влечет за собой внутривенное введение экзогенных соединений, таких как инулин или синистрин, проведение серийных измерений уровней плазмы/мочи для выявления ихклиренса 2,3. Этот метод является громоздким, требующим последовательного сбора образцов плазмы и мочи4. Альтернативой является измерение эндогенных конечных продуктов метаболизма, таких как креатинин. Однако это отнимает много времени и, порой, неточно, так как не только фильтруется клубочком, но и секретируется канальцами 5,6. Кроме того, уровень креатинина зависит от пола, возраста, диеты и мышечной массы 7,8,9.

Более точным, минимально инвазивным и широко используемым показателем СКФ является использование трансдермальных мониторов СКФ, которые измеряют СКФ в режиме реального времени у животных 4,10. Синистрин, хорошо растворимый и свободно фильтруемый экзогенный почечный маркер, маркируется флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC). Это конъюгированное соединение вводят внутривенно, и функция почек в режиме реального времени может быть оценена без сбора образцов крови и мочи11. Использование трансдермального измерения СКФ было подтверждено у грызунов12, собак13 и кошек14, но не у свиней.

Виды свиней имеют несколько общих с человеком анатомических и физиологических характеристик, что делает их идеальными животными для изучения различных заболеваний человека15. Использование свиней в трансляционных биомедицинских исследованиях становится все более популярным и предпочтительным по сравнению с моделями грызунов, поскольку оно имитирует физиологию человека и патофизиологию16. Неонатальные свиньи представляют интерес к пониманию механизмов заболеваний, уникальных для педиатрических пациентов17. Более того, недавний прогресс в трансплантации органов от свиней к человеку вызывает желание расширить диагностические инструменты для доклинических и клинических испытаний 18,19,20,21. В этой статье впервые приводится руководство по использованию трансдермального устройства при измерении СКФ у неонатальных свиней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Процедуры написаны в соответствии с национальными стандартами по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Научного центра здравоохранения Университета Теннесси (UTHSC).

ПРИМЕЧАНИЕ: Поросята в экспериментальной группе подвергаются перевязке и пункции слепой кишки, в то время как фиктивная группа подвергается только вскрытию брюшка без перевязки слепой кишки или пункции. Поросят в обеих группах держат под наркозом в течение 12 часов после процедуры, чтобы дать достаточно времени для сепсиса и острого повреждения почек (ОКИ) в экспериментальной группе. Трансдермальное измерение СКФ будет проводиться через 8 ч после процедуры в общей сложности 12 ч.

1. Снабжение и содержание поросят

  1. Определите местную свиноферму, которая может обеспечить неонатальных поросят в возрасте 3-5 дней. Запланируйте роды в начале недели, чтобы завершить эксперименты до того, как поросят станут старше 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поставщик предоставил от трех до пяти поросят по понедельникам для этого эксперимента; к пятнице поросята должны были пройти эксперимент. Использование того же пола и близкого к схожему возрасту имеет важное значение, чтобы избежать смешанных факторов.
  2. По прибытии поросенка убедитесь, что у него есть индивидуальная идентификация (например, ушная бирка и запись, которая включает вес и возраст).
  3. Разместите поросят в лабораторном отделении по уходу за животными (LACU) под присмотром лицензированного ветеринара. Животные размещаются группой в просторном загоне с твердым бетонным полом, который легко мыть водой для поддержания хорошей санитарии.
  4. Добавьте предмет мебели, такой как тяжелый шар, чтобы обеспечить обогащение и стимуляцию окружающей среды.
  5. Убедитесь, что LACU обеспечивает оптимальные условия окружающей среды, включая следующие ключевые элементы: санитария, питание, контроль температуры, вентиляция и цикл день-ночь путем управления освещением.
  6. Попросите ветеринара ежедневно проверять поросенка, включая измерение веса, чтобы сообщить исследователю, если какой-либо поросенок окажется больным, что может потребовать исключения из эксперимента.
  7. Оставьте поросят как минимум на 1 день, чтобы акклиматизироваться к окружающей среде, что помогает минимизировать стресс.

2. Предоперационная подготовка

  1. Подготовьте хирургическую станцию перед началом эксперимента. Это включает в себя грелку, катетеры, вентилятор, эндотрахеальную трубку, гепаринизированный физиологический раствор и мешок с жидкостью лактата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поросята имеют плохую терморегуляторную емкость и склонны к переохлаждению, которое изменяет гемодинамику22,23. Поэтому важно дать достаточно времени для прогрева грелки.
  2. Приготовьте 10 мг/мл α-хлоралозы, смешав ее с физиологическим раствором при 60 °C до тех пор, пока смесь не станет прозрачной. Не перегревайте раствор, чтобы избежать кристаллизации лекарства при охлаждении. Фильтровать шприцевым фильтром (размер 0,22 мкм) перед введением поросят.
  3. Составляйте обезболивающий препарат на основе веса животного - кетамин: 20 мг/кг и ксилазин: 2,2 мг/кг. Используйте α хлоралозу (5 мл/кг) для поддержания анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: α-хлоралоза используется из-за простоты внутривенного введения по сравнению с ингаляционным
    анестетики, поскольку последние требуют анестезирующей машины и соответствующей системы очистки, которые должны быть доставлены через эндотрахеальную трубку.

3. Анестезия

  1. Выполните индукцию анестезии в загоне для свиней, среде, знакомой для поросят, чтобы избежать чрезмерного стресса.
  2. Осторожно подберите поросенка за задние ноги и введите кетамин: 20 мг / кг и ксилазин: 2,2 мг / кг в заднюю ногу в полумембранозной / полутендинозной мышце, используя иглу 23 г 3/4.
  3. Дайте несколько минут, чтобы лекарства вступили в силу. Проверьте адекватный уровень анестезии, убедившись, что животное достаточно расслаблено, чтобы быть неподвижным, с потерей пальпебрального рефлекса и тонуса челюсти, чтобы обеспечить легкость и безопасную транспортировку на хирургическую станцию. Оцените пальпебральный рефлекс, коснувшись внутреннего уголка глаза; отсутствие моргания свидетельствует об адекватной анестезии.

4. Трахеостомия

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент не является выживаемым, поэтому трахеотомия выполняется для установления дыхательных путей для механической вентиляции. Трахеостомия является быстрой и простой процедурой, в отличие от эндотрахеальной интубации, которая является сложной задачей у поросят, учитывая их анатомию головы и верхних дыхательных путей24,25. Кроме того, ларингоспазм обычно сообщается во время интубации, что приводит к длительному периоду гипоксии и гиперкарбии, которые могутпоставить под угрозу результаты 26.

  1. Расположите поросенка в спинном лежачем состоянии. Определите крикотиреоидный хрящ, пальпируя протуберанец щитовидного хряща, который чувствует себя твердым. Стерилизуют область, используя повидон-йод и 70% этанол перед нанесением стерильной драпировки.
  2. Используя хирургический клинок, сделайте 2-3 см вентральный разрез средней линии, уступающий каудальному концу щитовидного хряща.
  3. Используя изогнутый гемостат комара, тупо рассекают вышележащие подкожные ткани и мышцы (sternohyoideus и кожную палочку) до тех пор, пока не визуализируются крикотиреоидная оболочка и первые несколько колец трахеи. При рассечении будьте осторожны, чтобы избежать повреждения кровеносных сосудов.
  4. Получите четкое представление о крикотиреоидной мембране и трахеальных кольцах24, затем используйте пару длинных миксеров под прямым углом щипцов для поднятия структур.
    1. С помощью небольших ножниц сделайте небольшой разрез на крикотиреоидной мембране или первом трахеальном кольце. Вытяните разрез горизонтально до ~0,5 см, чтобы пройти эндотрахеальную трубку толщиной 3,0 мм.
    2. Вставьте трубку на отметку 5 см. Обеспечьте двустороннее расширение грудной клетки и звуки дыхания перед закреплением трубки.
  5. Пропустите пуповинную ленту вокруг трахеи, чтобы закрепить ее на месте. Дополнительная лента используется для крепления трубки к основанию челюсти.
  6. Включите вентилятор, подключите эндотрахеальную трубку и сверните определенные ручки (например. Ручки SIMV, ручки PEEP и т. Д.), Чтобы выбрать следующие базовые настройки. Режим контроля давления: синхронизированная прерывистая механическая вентиляция (SIMV); пиковое давление вдоха (ПИП) - 15; положительное давление конечного выдоха (PEEP) - 5; Ставка - 20; I-время - 0,6. После первого анализа газов крови отрегулируйте настройки вентилятора в соответствии с результатами анализа газов крови с целью поддержания адекватной оксигенации и вентиляции.

5. Канюляция бедренного сосуда

  1. Установите дыхательные пути и вентиляцию, прежде чем переключить внимание на бедренные сосуды для венозного доступа и инвазивного мониторинга артериального давления. Бедренная артерия идентифицируется по ощущению пульса в бороздке между мышцами сарториуса и грацилиса, а вена может быть найдена только медиальной к артерии.
  2. Пока поросенок лежит в спинном лежачем положении, стерилизуйте область паха с помощью повидона-йода и этанола и нанесите драпировку соответствующего размера.
  3. Используйте хирургический клинок для создания продольного разреза 3-4 см, начинающегося в паховой складке и распространяющегося дистально вдоль бедренного канала.
  4. Применяют тупое и острое рассечение, используя комариные изогнутые щипцы и ножницы, соответственно, для рассечения до уровня бедренного нервно-сосудистого пучка. Пучок можно найти глубоко в теле мышцы грациллы27. По окружности рассекайте бедренную артерию и вену в течение 2-3 см, чтобы обеспечить канюляцию. При необходимости сажайте небольшие боковые ветви.
  5. Нанесите шелковый галстук 3.0 как на артерию, так и на проксимальный и дистальный концы вены, чтобы применить тракцию. Завяжите дистальный шелковый шов как на вене, так и на артерии, перевязав сосуды.
  6. Начиная с бедренной вены, поддерживайте дистальное и проксимальное вытяжение на шелковых стяжках, а затем используйте пару микроножек для создания венотомии.
  7. Затем используйте венозный катетер для вскрытия сосуда, вставляя предварительно измеренный полиуретановый катетер с внутренним диаметром х наружным диаметром 0,86 мм х 1,32 мм. После введения завяжите проксимальный шелковый шов 3.0, чтобы закрепить катетер. Промыть катетер 3 мл гепаринизированного солевого раствора (1 Ед/мл). Этот раствор может быть получен путем добавления 0,5 мл гепарина к 50 мл обычного физиологического раствора.
  8. Вставьте инвазивный катетер артериального давления, используя тот же подход, что и выше, чтобы создать артериотомию и передать катетер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание дистального и проксимального вытяжения имеет важное значение для минимизации кровопотери при доступе к артерии.
  9. После того, как катетеры закреплены, накройте участок пропитанной физиологическим раствором марлей, и при необходимости кожу можно зашить с помощью шелкового шва 3.0 для предотвращения инфекции.

6. Поддержание анестезии, жидкости и газов крови

  1. Контролируйте глубину анестезии на протяжении всего эксперимента, используя тонус челюсти и пальпебральный рефлекс, и вводите α-хлоралозу внутривенно, по мере необходимости для поддержания животного под глубоким наркозом. Используйте начальную нагрузочную дозу 50 мг/кг и 20 мг/кг для дальнейших болюсов.
  2. Вводят лактат рингера со скоростью 4 мл/кг/ч на протяжении всего эксперимента в качестве поддерживающей жидкости. Например, если вес поросенка составляет 3 кг, то скорость инфузии жидкости составляет 12 мл/ч.
  3. Для анализа прикроватного газа возьмите образец артериальной крови в гепаринизированном газовом шприце крови и представьте образец анализатору. Выберите вариант газообразной артериальной крови и подождите ~ 2-3 с, пока анализатор представит иглу для забора крови.
    1. Осторожно вставьте иглу в конец шприца, содержащего образец крови. Подождите, пока анализатор аспирирует необходимый образец и вытащит шприц. Позвольте машине проанализировать газ крови и представить результаты.
    2. Основываясь на результатах, отрегулируйте вентилятор для поддержания рН между 7,35--7,45, парциальное давление углекислого газа (PCO2) между 35-45 мм рт.ст. и парциальное давление кислорода (PaO2) между 80-150 мм рт.ст. Настройки различаются в зависимости от типа вентилятора, но в значительной степени включают увеличение или снижение частоты дыхания с использованием соответствующих ручек для компенсации гипоксии и / или гиперкапнии.
  4. Втяните 3 мл крови в светло-зеленую трубку (литий-гепарин). Центрифугируют образец при 2000 хг в течение 15 мин, выдерживают при 4 °C для извлечения плазмы. После завершения плазма может быть немедленно проанализирована на уровень креатинина в сыворотке крови с помощью прикроватного химического анализатора или сохранена при -80 °C для последующего анализа.
  5. Непрерывно контролируйте температуру с помощью ректального зондового термометра и регулируйте температуру грелки для поддержания температуры поросят от 101 до 103 ° F.

7. Экспериментальная группа; перевязка и перфорация слепой кишки (CLP) 25,28,29

ПРИМЕЧАНИЕ: Для поросят в экспериментальной группе выполните CLP, чтобы вызвать полимикробный сепсис28 и наблюдайте за животным в течение 12 часов после операции, чтобы дать достаточно времени для тяжелого сепсиса. Трансдермальная запись СКФ начинается через 8 ч после перевязки цекаля, чтобы обеспечить 4 ч записи.

  1. Используйте хирургическое лезвие для создания 5-6 см левого парамедианного вертикального разреза, так как слепая кишка у свиней лежит в левой паралюмбальной ямке30. Рассекайте слои брюшной стенки, избегая травмирования поверхностных эпигастральных сосудов.
  2. Как только брюшиный слой разрезан, используйте втягивающее устройство для улучшения доступа к внутрибрюшным структурам.
  3. Определите спиральную толстую кишку в верхнем левом квадранте живота. Проследите спиральную толстую кишку, каудально и дорсально, чтобы найти слепую кишку. Подвздошная кишка соединяется со спиральной толстой кишкой у основания слепой кишки.
  4. Вживите слепую кишку только дистальнее илеоцекального соединения (рисунок 1).
  5. Используя иглу 18 г, сделайте семь проколов в слепой кишке и выдавите кал в область брюшины.
  6. Закройте живот слоями шелковым швом 3,0, используя либо простые прерванные, либо непрерывные швы. Степлер также может быть использован для закрытия слоя кожи, если таковой имеется.

8. Фиктивная группа

  1. Выполните действия 7.2-7.4, как описано выше. После идентификации слепой кишки поместите ее обратно нетронутой и аналогичным образом закройте брюшную стенку.
  2. Контролируйте поросят в фиктивной группе в течение 12 ч, чтобы устранить любую путаницу, связанную с длительным воздействием анестезии.

9. Настройка трансдермального устройства СКФ

  1. После 8 ч перевязки слепой кишки приготовьтесь начать трансдермальное измерение СКФ.
  2. Используйте программное обеспечение службы MB версии 3.0 для настройки частоты дискретизации на устройстве GFR. Вкратце, подключите трансдермальное устройство GFR к программному обеспечению компьютера с помощью разъема USB. Откройте программное обеспечение, нажмите кнопку «Подключить» и установите время на 4000 мс. Нажмите кнопку Записать , чтобы сохранить настройки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это дает до 6 ч общего времени выборки. У свиней трансдермальная СКФ завершается через 4 ч. Для экспериментов, требующих отбора проб продолжительностью до 12 ч, выберите параметр 8000 мс.
  3. Прикрепите к устройству двухсторонние клеевые пластыри с прозрачным окном. Прикрепите устройство к одной стороне, гарантируя, что светодиод перекрывает прозрачное окно, чтобы обеспечить обнаружение индикатора.
  4. Сбрить область, покрывающую боковую грудную стенку. Прикрепите батарею к устройству и немедленно приклейте клейкий пластырь к устройству на месте и убедитесь, что оно хорошо закреплено (рисунок 2). Поскольку поросята глубоко обезболены, лента может быть ненужной для удержания устройства на месте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одного клеевого пластыря достаточно для закрепления. Тем не менее, в процедурах, где животное будет манипулироваться, становиться активным или где анестезия может быть нарушена, может быть важно применить ленту. Повязка также может быть альтернативным подходом31.
  5. Базовая запись за 3-5 мин требуется перед введением FITC-синистрина.

10. FitC-синистрин препарат и инъекции

  1. Приготовьте смесь FITC-синистрина с физиологическим раствором до конечной концентрации 50 мг/мл. Доза, вводимая поросенку, составляет 20 мг/кг. FITC-синистрин поставляется в виде порошка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: FITC-синистрин также может вводиться через периферический венозный катетер, вставленный в ушную вену. Важно достичь высокого пикового уровня путем введения FITC-синистрина в виде толчкового болюса через венозный катетер бедренной вены.
  2. Прикрепите шприц с лекарством к одной стороне трехстороннего стоп-петуха и солевым смывом с другой стороны стоп-петуха. Нажмите FITC-синистрин и сразу же нанесите болюс из 5 мл физиологического раствора, прежде чем закрыть трехсторонний стоп-петух к вене поросенка.

11. Трансдермальная запись СКФ

  1. Держите устройство прикрепленным к поросенку в течение 4 ч. В течение этого времени держите поросенка под наркозом, используя прерывистые дозы α-хлоралозы в концентрации 20 мг / кг, чтобы избежать каких-либо артефактов движения.
  2. По истечении 4 часов извлеките устройство и немедленно отсоедините аккумулятор.

12. Измерение СКФ

  1. Подключите трансдермальное устройство GFR к компьютеру с помощью разъема USB, предоставленного поставщиком.
  2. Откройте программное обеспечение для чтения, чтобы получить данные с устройства. Сохраните необработанные данные, щелкнув последовательность: подключение, чтение, переименование и сохранение. В соответствии с инструкциями в руководстве, обработайте и оцените сохраненные данные в программном обеспечении для анализа.
  3. Вкратце, откройте программное обеспечение версии 3.0 и импортируйте данные. Отрегулируйте смещение, начальную и конечную позиции с помощью автоматических маркеров. При необходимости удалите артефакты и нажмите кнопку «Подгонка». Это дает показания, которые показывают клиренс FITC-синистрина в минутах (t1/2). T1/2 впоследствии используется для расчета ТРК32,33 следующим образом:
    Equation 1
    ПРИМЕЧАНИЕ: В консультации с производителем коэффициент преобразования, используемый для свиней, составляет 20 (что указывает на то, что 20% массы тела составляет внеклеточное пространство), в отличие от 21,33 у крыс (т СКФ в мл/мин) и 14 616,8 у мышей (тГФ в мкл/мин). Это связано с тем, что СКФ точно измеряется как функция внеклеточной жидкости34,35, которая, в свою очередь, зависит от массы тела36.

13. Эвтаназия поросят

  1. Собрать 3 мл крови через 12 ч CLP для дальнейшего биохимического анализа.
  2. Усыпляют поросенка путем введения 0,2 мл/кг предварительно смешанной смеси 20% пентобарбитала натрия и фенитоина натрия внутривенно.
  3. Заготовьте правую почку для гистопатологического исследования, прежде чем отвезти поросенка в морг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом разделе мы впервые представляем репрезентативные данные применения трансдермальной СКФ у неонатальных свиней. Мы использовали модель перевязки и пункции слепой кишки, которая, как было ранее показано, снижает функцию почек28. Соответственно, мы предположили, что у наших свиней CLP должно быть острое падение СКФ, соответствующее ОКИ, и это должно быть обнаружено на трансдермальном устройстве СКФ как увеличение времени клиренса (t1/2), тем самым подтверждая его использование у свиней. Было включено семь самцов поросят, три стычка и четыре сепсиса. Обе группы имели сопоставимые веса (рисунок 3А). Как и ожидалось, через 28, 12 ч сепсиса повысились сывороточные уровни С-реактивного белка (СРБ), маркера бактериемии и сепсиса (рисунок 3В). Показаны репрезентативные кривые клиренса FITC-синистрина у фиктивных и септических поросят (рисунок 4 A, B), причем AKI показан путем наложения кривых фикции и сепсиса (рисунок 4C). AKI показан увеличенной площадью под кривой для свиней CLP. Это можно увидеть, когда фиктивная кривая заложена на кривую CLP. Средний период полувыведения FITC-синистрина в группах фиктивного и сепсиса составил 114 и 537 минут соответственно (рисунок 5A). Средний СКФ в фиктивной группе составлял 5,1 мл/мин/100 г массы тела, в то время как в группе сепсиса он составлял 1,06 мл/мин/100 г массы тела (рисунок 5В). Дополнительное животное было исключено, поскольку зонд был смещен, что нарушило кривую зазора и время. В то время как 12 ч креатинина сыворотки (биомаркер острого повреждения почек) не изменялся в фиктивной группе, он был увеличен с ~ 0,6 до 1,08 мг / дл у септических свиней (рисунок 6).

Figure 1
Рисунок 1: Операция по перевязке слепой кишки. (A) Цекум идентифицирован и выведен наружу. (B) Слепую кишку перевязывают у основания шелковым галстуком перед прокалыванием иглой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Прикрепление трансдермального устройства к коже. (A) Кожа, выбритая перед нанесением адгезивного пластыря. (B) Трансдермальное устройство СКФ, прикрепленное к клейкому пластырю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные результаты. (A) Вес поросят, использованных в этом исследовании, и (B) уровни С-реактивного белка сыворотки (СРБ) в механически вентилируемых фиктивных и септических самцах поросят (непарный Т-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативные кривые клиренса FITC-синистрина у механически вентилируемых фиктивных и септических самцов поросят. (A) 12 ч бутафории, (В) 12 ч сепсис. Септические свиньи присутствуют с нарушением функции почек, о чем свидетельствует увеличенная площадь под кривой. Черные точки данных представляют собой необработанные данные, синие линии - трехкамерную посадку, зеленые линии - 95% доверительных интервалов, а красная линия - отфильтрованные данные. (C) Наложение репрезентативных кривых для отражения степени расхождения с исходным уровнем у септических свиней. Кривая сепсиса (красный) показала минимальный клиренс FITC-синистрина, что указывает на ОКИ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные результаты. (A) Период полураспада FITC-sinistrin и (B) участки СКФ в механически вентилируемых фиктивных и септических самцах поросят (непарный Т-тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Креатинин сыворотки в механически вентилируемых фиктивных и септических самцах поросят. (Односторонний тест ANOVA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье описываются практические шаги по определению функции почек у свиней с использованием миниатюрных трансдермальных мониторов СКФ и FITC-синистрина в механически вентилируемой, анестезированной модели неонатальной свиньи. Предыдущие работы установили экспериментальные трансдермальные протоколы СКФ у грызунов 11,12,14, но никаких протоколов не существует у свиней.

В последнее время наблюдается стремление исследовать альтернативные модели животных для решения трудноизлечимых заболеваний и облегчения бремени заболеваний почек у людей. К сожалению, многие из этих подходов имели трансляционные ограничения из-за размерных, анатомических и физиологических различий. Почечная анатомия и патофизиология грызунов имеют серьезные различия по сравнению с людьми37. Поскольку системы человека и свиньи имеют сходные анатомические и функциональные характеристики, модель свиней может быть более реалистичной патофизиологической моделью заболеваний человека38,39. Свиньи в настоящее время широко используются для очерчивания патофизиологии и в разработке лекарств. С публикацией генома свиньи, наряду с успешным трансгенным производством моделей, специфичных для заболевания, модель свиней играет более важную роль в трансляционных исследованиях40,41.

Клиренс инулина остается наиболее приемлемым средством определения СКФ, но непрактичен на крупных животных моделях из-за необходимости непрерывной инфузии инулина, катетеризации мочевого пузыря и его трудоемкого и громоздкого характера42. Креатинин сыворотки и азот мочевины крови (BUN) обычно используются для измерения функции почек в доклинических исследованиях, но поскольку креатинин секретируется в канальцах, а мочевина все чаще реабсорбируется при обезвоживании, эти маркеры оказались плохими при оценке функции почек 5,43. Важно отметить, что секреция канальцевого креатинина вызывает завышение СКФ при использовании в качестве маркера функции почек у свиней6. Кроме того, из-за их габитатуса в организме повышение креатинина с большей вероятностью будет наблюдаться у крупных животных моделей по сравнению с грызунами. Исследование на мышах выявило 1,5-кратное повышение креатинина сыворотки через 6 ч после перевязки сечения44. Ранее мы показали рост креатинина у неонатальных свиней через 6 часов после CLP28. В этом исследовании мы держали животных в течение более длительного времени, ~ 12 часов после перевязки цекальных костей, чтобы дать достаточно времени для значительного ОПН и последующего повышения креатинина. Как и в нашем предыдущем исследовании, мы подтвердили индукцию сепсиса повышением уровня СРБ в сыворотке крови, маркера воспаления и сепсиса. В этом исследовании, как показывают предыдущие статьи, тяжесть сепсиса после CLP зависит от продолжительности перевязки и количества проколов44.

Протокол измерения СКФ у свиней с использованием Iohexol ранее был валидирован у свиней37, но, напротив, трансдермальная процедура СКФ является заметным улучшением. Он менее громоздкий, позволяет избежать повторного забора крови или мочи и предлагает окно в реальном времени в функцию почек и возможность повторных, последовательных измерений у одного и того же животного45. Это исследование дает практические рекомендации по трансдермальному определению СКФ у свиней.

Как установлено другими группами, наиболее критическими шагами являются правильная фиксация прибора на животном и болюсное введение ФИТК-синистрина. Измерительное устройство должно быть хорошо закреплено на поверхности кожи, чтобы предотвратить движение артефактов на следе. Поскольку свиньи менее волосатые, чем грызуны, использование крема для депиляции не требуется. Чистое бритье с помощью клипера может быть всем, что нужно. Это минимизирует связанное с депиляцией увеличение периода полувыведения FITC-синистрина, механизм которого неизвестен12. Для правильной фиксации требуется двусторонний клейкий пластырь и лента, чтобы удерживать устройство на месте. Оптимальными местами размещения прибора являются боковая стенка грудной клетки и брюшная область вентрального нерва. Эти области коррелировали с меньшим количеством артефактов движения.

При введении FITC-синистрина правильная и целая доза должна быть введена одним движением жидкости в вену. Когда инъекция прерывается и перезапускается, она создает несколько «мини-пиков» на кривой зазора. Хвостовая жилка обычно используется для мелких грызунов, но ушная ушная жила предлагает более доступный и заметный маршрут у свиней. Канюля может быть помещена в ушную вену для многократных измерений у сознательных свиней. Важное различие, которое следует отметить во времени отбора проб, заключается в том, что, в отличие от грызунов (~ 1-2 ч), свиньи служат дольше (~ 4 ч), что приближается к времени, необходимому для очистки FITC-синистрина из циркуляции. Насколько нам известно, это первая статья, в которой подробно описывается трансдермальная СКФ через FITC-синистриновую очистку у свиней. Таким образом, никаких ссылок для справки не существует. Время измерения , используемое ~ 4 часа, было достигнуто путем консультаций с производителем. Это время отбора проб сопоставимо с предыдущим исследованием, подтверждающим трансдермальную СКФ у других млекопитающих, не являющихся грызунами14.

При оценке трансдермальной СКФ у поросят есть несколько факторов, которые необходимо учитывать. Известно, что однокамерные модели значительно завышают СКФ46; мы используем трехкамерную кинетическую модель, которая является более точной, обеспечивая трехстороннюю связь внутривенно вводимого маркера между плазмой, внеклеточным пространством и более глубокими компонентами46. Кроме того, это механически вентилируемые поросята под очень глубоким наркозом в течение ~ 12 ч. Поскольку анестезия влияет на функцию почек 47,48, возможно, стоит принять это во внимание в процедурах, которые требуют длительной седации или где экспериментальные маневры требуют дополнительной анестезии наряду с мониторингом СКФ. Наконец, и, возможно, самое главное, неонатальные поросята имеют все еще развивающиеся почечные системы с незрелыми нефронами, которые функционируют у доли взрослого животного49. Следовательно, они демонстрируют более низкую СКФ и функцию почек50.

Как указывалось ранее, трансдермальная СКФ у свиней не является абсолютной мерой концентрации синистрина в крови. Это единственная оценка распада флуоресценции с течением времени12. Использование коэффициента пересчета пытается смягчить это, выражая СКФ в мл/мин. Однако, поскольку коэффициент преобразования зависит от внеклеточного пространства, которое, в свою очередь, зависит от массы тела 34,35,36, возможно существование широких вариаций, если вес не контролируется или если внеклеточное пространство не точно определено 51,52.

Кроме того, пигментация кожи, по-видимому, влияет на трансдермальный клиренс FITC-синистрина12,31. В наших исследованиях мы обнаружили, что пигментированные свиньи показали снижение сигнала. В одном случае мы не обнаружили сигнал у свиньи интенсивно темного цвета. Однако, поскольку фоновый сигнал имеет тенденцию к снижению у пигментированных животных12, мы обнаружили, что значения СКФ были в значительной степени сопоставимы. Одним из решений этой проблемы является выбор более светлых участков кожи при размещении устройства. Поскольку эти свиньи в основном использовались в хирургической модели заболевания с участием нескольких форм освещения и источников тепла, необходимо учитывать потенциальные артефакты движения на следах СКФ через отраженный свет, поглощенный окружающей кожей12. Одним из решений этой проблемы может быть минимизация инфракрасного света во время записи или покрытия устройств фольгой.

Таким образом, это исследование предлагает простой и надежный метод измерения скорости клубочковой фильтрации у неонатальных свиней с использованием трансдермального измерения клиренса FITC-синистрина. Кроме того, наши данные подтверждают полезность системы в оценке функции почек в условиях острого повреждения почек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Никакой.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения R01 DK120595 и R01 DK127625, присужденными доктору Адебийи. Содержание этой статьи является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Спасибо доктору Даниэлю Шок-Кушу, директору сайта MediBeacon GmbH, за его советы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha - Chloralose Sigma-Aldrich C0128-25G Used for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0 Surgical Specialties SP117 Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8C Fischer Scientific 75-008-821 Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed Progressive Medical International 1109021995 Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 g MediBeacon Inc. FTCF S001 Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer Instrumentation Laboratory 5700 For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 in Adroit Medical Systems V029 Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy Pump Adroit Medical Systems HTP Allows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst One IDEXX Laboratories 89-92525-00 Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr Millar SPR-524 Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulator True Care TCRTCBINF033G Used to connect IV fluid bag to vein catheter
Ketamine Covetrus 68317 Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0 MediBeacon Inc. N/A Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGVR33RS Syringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant Ventilator Sechrist Millennium 20409 Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) Covetrus 72934 Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bag Baxter 2B2323Q Maintanence fluid infusion
Sterile Gloves Henry Schein 104-5920 Used by operator during surgery
Sterile Gown Halyard Health 95021 Used by operator during surgery
Steril Towel Medline 42131704 Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needle Ethicon NC1842168 Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR Monitor MediBeacon Inc. TDM004 Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patch MediBeacon Inc. PTC-SM001 Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds Fisher Scientific NC9303017 To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5 Micro medical tubing BB31695 For femoral vein cannulation
Xylazine Covetrus 61035 Used for induction of anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pasala, S., Carmody, J. B. How to use... serum creatinine, cystatin C and GFR. Archives of Disease in Childhood Education and Practice Edition. 102 (1), 37-43 (2017).
  2. Smith, H. W. The Kidney: Structure and Function in Health and Disease. , Oxford University Press, USA. (1951).
  3. Gutman, Y., Gottschalk, C. W., Lassiter, W. E. Micropuncture study of inulin absorption in the rat kidney. Science. 147 (3659), 753-754 (1965).
  4. Ellery, S. J., Cai, X., Walker, D. D., Dickinson, H., Kett, M. M. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in small rodents: through the skin for the win. Nephrology. 20 (3), 117-123 (2015).
  5. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
  6. Wendt, M., Waldmann, K. H., Bickhardt, K. Comparative studies of the clearance of inulin and creatinine in swine. Zentralblatt fur Veterinarmedizin. Reihe A. 37 (10), 752-759 (1990).
  7. Schwartz, G. J., Brion, L. P., Spitzer, A. The use of plasma creatinine concentration for estimating glomerular filtration rate in infants, children, and adolescents. Pediatric Clinics of North America. 34 (3), 571-590 (1987).
  8. Boer, D. P., de Rijke, Y. B., Hop, W. C., Cransberg, K., Dorresteijn, E. M. Reference values for serum creatinine in children younger than 1 year of age. Pediatric Nephrology. 25 (10), 2107-2113 (2010).
  9. Guignard, J. P., Drukker, A. Why do newborn infants have a high plasma creatinine. Pediatrics. 103 (4), 49 (1999).
  10. Friedemann, J., Schock-Kusch, D., Shulhevich, Y. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in conscious laboratory animals: state of the art and future perspectives. Reporters, Markers, Dyes, Nanoparticles, and Molecular Probes for Biomedical Applications IX. 10079, 63-71 (2017).
  11. Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents. Journal of Visualized Experiments. (109), e53767 (2016).
  12. Scarfe, L., et al. Transdermal measurement of glomerular filtration rate in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58520 (2018).
  13. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  14. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
  15. Almond, G. W. Research applications using pigs. The Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. 12 (3), 707-716 (1996).
  16. Bassols, A., et al. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. Proteomics Clinical Applications. 8 (9-10), 715-731 (2014).
  17. Ayuso, M., Irwin, R., Walsh, C., Van Cruchten, S., Van Ginneken, C. Low birth weight female piglets show altered intestinal development, gene expression, and epigenetic changes at key developmental loci. FASEB Journal. 35 (4), 21522 (2021).
  18. Pierson, R. N. Progress toward pig-to-human xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1871-1873 (2022).
  19. Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1889-1898 (2022).
  20. Reardon, S. First pig kidneys transplanted into people: what scientists think. Nature. 605 (7911), 597-598 (2022).
  21. Lu, T., Yang, B., Wang, R., Qin, C. Xenotransplantation: current status in preclinical research. Frontiers in Immunology. 10, 3060 (2019).
  22. Pattison, R. J., English, P. R., MacPherson, O., Roden, J. A., Birnie, M. Hypothermia and its attempted control in newborn piglets. Proceedings of the British Society of Animal Production. 1990, 81 (1972).
  23. Tucker, B. S., Petrovski, K. R., Kirkwood, R. N. Neonatal piglet temperature changes: effect of intraperitoneal warm saline injection. Animals. 12 (10), 1312 (2022).
  24. Alcalá Rueda, I., et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 278 (8), 3081-3090 (2021).
  25. Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques, Third Edition. , CRC Press/Taylor & Francis Group. Boca Raton. (2016).
  26. Steinbacher, R., von Ritgen, S., Moens, Y. P. Laryngeal perforation during a standard intubation procedure in a pig. Laboratory Animals. 46 (3), 261-263 (2012).
  27. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Göttingen minipig: intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. Journal of Visualized Experiments. (52), e2652 (2011).
  28. Soni, H., Adebiyi, A. Early septic insult in neonatal pigs increases serum and urinary soluble Fas ligand and decreases kidney function without inducing significant renal apoptosis. Renal Failure. 39 (1), 83-91 (2017).
  29. Bütz, D. E., Morello, S. L., Sand, J., Holland, G. N., Cook, M. E. The expired breath carbon delta value is a marker for the onset of sepsis in a swine model. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 29 (4), 606-613 (2014).
  30. Turner, A. S., McIlwraith, C. W. Techniques in Large Animal Surgery. , Lea & Febiger. (1989).
  31. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
  32. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  33. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (10), 2997-3001 (2009).
  34. Peters, A. M. Expressing glomerular filtration rate in terms of extracellular fluid volume. Nephrology Dialysis Transplantation. 7 (3), 205-210 (1992).
  35. Groth, S., Christensen, A. B., Nielsen, H. CdTe-detector registration of 99mTc-DTPA clearance. European Journal of Nuclear Medicine. 8 (6), 242-244 (1983).
  36. Guyton, A. C., Hall, J. E. The body fluid compartments: extracellular and intracellular fluids; interstitial fluid and edema. Textbook of Medical Physiology. 9, 306-308 (2000).
  37. Luis-Lima, S., et al. Iohexol plasma clearance simplified by dried blood spot testing. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 33 (9), 1597-1603 (2018).
  38. Kobayashi, E., Hishikawa, S., Teratani, T., Lefor, A. T. The pig as a model for translational research: overview of porcine animal models at Jichi Medical University. Transplantation Research. 1 (1), 8 (2012).
  39. Swindle, M. M., et al. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  40. Ibrahim, Z., et al. Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems. Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2006).
  41. Judge, E. P., et al. Anatomy and bronchoscopy of the porcine lung. A model for translational respiratory medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (3), 334-343 (2014).
  42. Stevens, L. A., Levey, A. S. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (11), 2305-2313 (2009).
  43. Bankir, L., Yang, B. New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism. Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).
  44. Ruiz, S., et al. Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture. Intensive Care Medicine Experimental. 4 (1), 22 (2016).
  45. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).
  46. Frennby, B., Sterner, G. Contrast media as markers of GFR. European Radiology. 12 (2), 475484 (2002).
  47. Burchardi, H., Kaczmarczyk, G. The effect of anaesthesia on renal function. European Journal of Anaesthesiology. 11 (3), 163-168 (1994).
  48. Fusellier, M., et al. Influence of three anesthetic protocols on glomerular filtration rate in dogs. American Journal of Veterinary Research. 68 (8), 807811 (2007).
  49. Arant, B. S. Functional immaturity of the newborn kidney-paradox or prostaglandin. Homeostasis, Nephrotoxicity, and Renal Anomalies in the Newborn. , Springer. Boston, MA. 271-278 (1986).
  50. Gattineni, J., Baum, M. Developmental changes in renal tubular transport-an overview. Pediatric Nephrology. 30 (12), 2085-2098 (2015).
  51. Gu, X., Yang, B. Methods for assessment of the glomerular filtration rate in laboratory animals. Kidney Diseases. , 1-11 (2022).
  52. Mullins, T. P., Tan, W. S., Carter, D. A., Gallo, L. A. Validation of non-invasive transcutaneous measurement for glomerular filtration rate in lean and obese C57BL/6J mice. Nephrology. 25 (7), 575-581 (2020).

Tags

Медицина выпуск 187
Трансдермальное измерение скорости клубочковой фильтрации у поросят с механической вентиляцией
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fanous, M. S., Afolabi, J. M.,… More

Fanous, M. S., Afolabi, J. M., Michael, O. S., Falayi, O. O., Iwhiwhu, S. A., Adebiyi, A. Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets. J. Vis. Exp. (187), e64413, doi:10.3791/64413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter