Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Transdermal måling af glomerulær filtreringshastighed hos mekanisk ventilerede smågrise

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64413
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, College of Medicine University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

Glomerulær filtreringshastighed (GFR) er den ideelle markør til vurdering af nyrefunktionen. Standardmålemetoden ved anvendelse af inulininjektion med seriel blod- og urinanalyse er imidlertid upraktisk. Denne artikel beskriver en praktisk metode til måling af GFR transdermalt hos smågrise.

Abstract

Transdermal måling af glomerulær filtreringshastighed (GFR) er blevet brugt til at evaluere nyrefunktionen hos bevidste dyr. Denne teknik er veletableret hos gnavere til at studere akut nyreskade og kronisk nyresygdom. GFR-måling ved hjælp af det transdermale system er imidlertid ikke blevet valideret hos svin, en art med et nyresystem, der ligner mennesker. Derfor undersøgte vi effekten af sepsis på transdermal GFR hos bedøvede og mekanisk ventilerede neonatale grise. Polymikrobiel sepsis blev induceret ved cecal ligering og punktering (CLP). Det transdermale GFR-målesystem bestående af en miniaturiseret fluorescenssensor blev fastgjort til grisens barberede hud for at bestemme clearance af fluorescein-isothiocyanat (FITC) konjugeret sinistrin, et intravenøst injiceret GFR-sporstof. Vores resultater viser, at serumkreatinin steg ved 12 timer efter CLP med et fald i GFR. Denne undersøgelse viser for første gang nytten af den transdermale GFR-tilgang til bestemmelse af nyrefunktionen hos mekanisk ventilerede, neonatale grise.

Introduction

En praktisk og kvantitativ evaluering af nyrefunktionen er den glomerulære filtreringshastighed (GFR) måling, som fortæller, hvor godt nyrerne filtrerer blod baseret på clearanceprincippet1. En tidligere metode til måling af GFR indebærer intravenøs injektion af eksogene forbindelser såsom inulin eller sinistrin, der udfører serielle målinger af plasma-/urinniveauer for at detektere deres clearance 2,3. Denne metode er besværlig og kræver seriel indsamling af plasma- og urinprøver4. Et alternativ er måling af endogene metaboliske slutprodukter såsom kreatinin. Dette er imidlertid tidskrævende og til tider unøjagtigt, da det ikke kun filtreres af glomerulus, men også udskilles af tubuli 5,6. Desuden påvirkes kreatininniveauet af køn, alder, kost og muskelmasse 7,8,9.

Et mere præcist, minimalt invasivt og udbredt mål for GFR er brugen af transdermale GFR-monitorer, der måler GFR i realtid hos dyr 4,10. Sinistrin, en meget opløselig og frit filtreret eksogen nyremarkør, er mærket med fluorescein-isothiocyanat (FITC). Denne konjugerede forbindelse injiceres intravenøst, og nyrefunktionen i realtid kan vurderes uden at indsamle blod- og urinprøver11. Brugen af transdermal GFR-måling er blevet valideret hos gnavere 12, hunde13 og katte14, men ikke hos svin.

Svinearter deler flere anatomiske og fysiologiske egenskaber med mennesker, hvilket gør dem til ideelle dyr til at studere forskellige menneskelige sygdomme15. Brugen af svin i translationel biomedicinsk forskning er blevet stadig mere populær og foretrukket frem for gnavermodeller, fordi den efterligner menneskelig fysiologi og patofysiologi16. Neonatale grise er af interesse for at forstå mekanismerne for sygdomme, der er unikke for pædiatriske patienter17. Desuden sætter den nylige udvikling inden for gris til human organtransplantation en trang til at udvide de diagnostiske værktøjer til prækliniske og kliniske forsøg 18,19,20,21. Dette papir giver for første gang en vejledning til brugen af den transdermale enhed til måling af GFR hos neonatale grise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurerne er skrevet i henhold til nationale standarder for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Tennessee Health Science Center (UTHSC).

BEMÆRK: Smågrise i forsøgsgruppen udsættes for cecal ligation og punktering, mens sham-gruppen kun gennemgår åbning af maven uden cecal ligation eller punktering. Smågrise i begge grupper holdes under anæstesi i 12 timer efter proceduren for at give tilstrækkelig tid til sepsis og akut nyreskade (AKI) at følge i forsøgsgruppen. Transdermal GFR-måling vil følge ved 8 timer efter proceduren i alt 12 timer.

1. Forsyning af smågrise og opstaldning

  1. Identificer en lokal svinebedrift, der kan give neonatale smågrise i alderen 3-5 dage. Planlæg leveringen tidligt på ugen for at afslutte forsøget, før smågrise er ældre end 7 dage.
    BEMÆRK: Leverandøren leverede tre til fem smågrise om mandagen til dette forsøg; Fredag ville smågrisene have gennemgået forsøget. Brug af samme køn og næsten samme alder er afgørende for at undgå forvirrende faktorer.
  2. Ved pattegrisens ankomst skal du sikre dig, at de har en individuel identifikation (f.eks. et øremærke og en rekord, der inkluderer vægt og alder).
  3. Hus smågrisene i en laboratoriedyreplejeenhed (LACU) under pleje af en autoriseret dyrlæge. Dyrene er anbragt som en gruppe i en rummelig pen med et solidt betongulv, der let vaskes med vand for at opretholde god sanitet.
  4. Tilføj et møbel såsom en tung bold for at give mulighed for miljøberigelse og stimulering.
  5. Sørg for, at LACU giver optimale miljøforhold, herunder følgende nøgleelementer: sanitet, ernæring, temperaturregulering, ventilation og dag-nat-cyklus ved at kontrollere belysningen.
  6. Få dyrlægen til at kontrollere pattegrisen dagligt, herunder vægtmåling, for at informere forsøgslederen, hvis en pattegris forekommer syg, hvilket kan nødvendiggøre udelukkelse fra forsøget.
  7. Lad smågrisene i mindst 1 dag akklimatisere sig til miljøet, hvilket hjælper med at minimere stresset.

2. Præoperativ forberedelse

  1. Forbered den kirurgiske station, inden eksperimentet påbegyndes. Dette inkluderer en varmepude, katetre, en ventilator, et endotrachealrør, hepariniseret saltvand og en pose ringer laktatvæske.
    BEMÆRK: Smågrise har dårlig termoregulerende kapacitans og er tilbøjelige til hypotermi, som ændrer hæmodynamikken22,23. Derfor er det vigtigt at give tilstrækkelig tid til, at varmepuden kan varme op.
  2. Der fremstilles 10 mg/ml α-chloralose ved at blande det med saltvand ved 60 °C, indtil blandingen er klar. Overophedning ikke opløsningen for at undgå krystallisering af medicinen ved afkøling. Filtrer med et sprøjtefilter (størrelse 0,22 μm), inden det administreres til smågrisene.
  3. Udarbejd bedøvelsesmedicin baseret på dyrevægt-ketamin: 20 mg/kg og Xylazin: 2,2 mg/kg. Brug α -chloralose (5 ml / kg) for at opretholde anæstesi.
    BEMÆRK: α -chloralose anvendes på grund af den lette administration af IV sammenlignet med inhaleret
    anæstetika, da sidstnævnte kræver en bedøvelsesmaskine og et passende rensningssystem, der skal leveres via et endotracheal rør.

3. Anæstesi

  1. Udfør induktion af anæstesi i svinestien, et miljø, der er kendt for smågrise, for at undgå unødig stress.
  2. Pluk forsigtigt grisen ved bagbenene og indfør ketamin: 20 mg/kg og Xylazin: 2,2 mg/kg ind i bagbenet ved semimembranosus/semitendinosus-musklen ved hjælp af en 23 G 3/4 nål.
  3. Tillad et par minutter for medicinen at træde i kraft. Kontroller for det passende anæstesiniveau ved at sikre, at dyret er afslappet nok til at være immobile, med tab af palpebral refleks og kæbetone for at muliggøre nem og sikker transport til den kirurgiske station. Vurder palpebral refleksen ved at røre ved det indre hjørne af øjet; fravær af blinkende indikerer tilstrækkelig anæstesi.

4. Trakeostomi

BEMÆRK: Dette eksperiment er ikke-overlevelse, så en trakeotomi udføres for at etablere en luftvej til mekanisk ventilation. Trakeostomi er en hurtig og nem procedure, i modsætning til endotracheal intubation, som er udfordrende hos smågrise givet deres hoved og øvre luftvejsanatomi24,25. Derudover rapporteres laryngospasme almindeligvis under intubation, hvilket resulterer i en længere periode med hypoxi og hypercarbi, der kan kompromittere resultaterne26.

  1. Placer grisen i dorsal recumbency. Identificer cricothyroid brusk ved at palpere fremtrædende skjoldbrusk, som føles fast. Steriliser området ved hjælp af povidon-jod og 70% ethanol, inden du påfører en steril drapering.
  2. Brug et kirurgisk blad til at gøre et 2-3 cm ventralt midterlinjesnit ringere end den kaudale ende af skjoldbruskkirtlen.
  3. Brug en buet myg hæmostat til at dissekere de overliggende subkutane væv og muskler (sternohyoideus og kutan coli), indtil cricothyroidmembranen og de første par trakealringe er visualiseret. Når du dissekerer, skal du være forsigtig med at undgå at skade blodkar.
  4. Få et klart overblik over cricothyroidmembranen og trakealringene24, og brug derefter et par lange mixter retvinklede tang til at hæve strukturerne.
    1. Med en lille saks skal du lave et lille snit ved cricothyroidmembranen eller den første trakealring. Forlæng snittet vandret til ~ 0,5 cm for at passere et 3,0 mm endotracheal rør.
    2. Indsæt røret til 5 cm mærket. Sørg for bilateral brystudvidelse og åndedrætslyde, inden røret fastgøres.
  5. Før navlebånd rundt i luftrøret for at fastgøre det på plads. Yderligere tape bruges til at fastgøre røret til bunden af kæben.
  6. Tænd for ventilatoren, tilslut endotrachealrøret, og rul de specifikke knapper (f.eks. SIMV-knapper, PEEP-knapper osv.) for at vælge følgende grundlæggende indstillinger. Trykreguleringstilstand: synkroniseret intermitterende mekanisk ventilation (SIMV); maksimalt inspiratorisk tryk (PIP) - 15; positivt slutekspiratorisk tryk (PEEP) - 5; Sats- 20; I-tid - 0,6. Efter den første blodgasanalyse justeres ventilatorindstillingerne i henhold til blodgasresultaterne med det formål at opretholde tilstrækkelig iltning og ventilation.

5. Kanellering af lårbenskar

  1. Etabler luftvejene og ventilationen, før du skifter opmærksomhed til lårbenskarrene for venøs adgang og invasiv blodtryksovervågning. Lårbensarterien identificeres ved at føle en puls ved rillen mellem sartorius og gracilis musklerne, og venen kan findes lige medial til arterien.
  2. Mens grisen ligger i en rygliggende position, steriliseres lyskeområdet ved hjælp af povidon-jod og ethanol og påføres en passende størrelse drapering.
  3. Brug et kirurgisk blad til at skabe et 3-4 cm langsgående snit, der starter kranielt ved inguinalfolden og strækker sig distalt langs lårbenskanalen.
  4. Påfør stump og skarp dissektion ved hjælp af henholdsvis mygbuede tang og saks for at dissekere ned til niveauet for lårbenet neurovaskulært bundt. Bundtet kan findes dybt i kroppen af gracillis muskel27. Circumferentially dissekere lårbenet arterien og venen i løbet af 2-3 cm for at muliggøre kannulation. Læg små sidegrene om nødvendigt.
  5. Påfør et 3.0 silkebånd ved både arterien og venens proksimale og distale ender for at anvende trækkraft. Bind den distale silkesutur på både venen og arterien, og ligér karrene.
  6. Begynd med lårbenet, oprethold distal og proximal trækkraft på silkebåndene og brug derefter et par mikrosakse til at skabe en venotomi.
  7. Brug derefter et veneplukkateter til at åbne beholderen, mens du indsætter et forudmålt polyurethankateter med en indvendig diameter x ydre diameter på 0,86 mm x 1,32 mm. Når den er indsat, skal du binde den proksimale 3.0 silkesutur for at fiksere kateteret. Kateteret skylles med 3 ml hepariniseret saltopløsning (1 U/ml). Denne opløsning kan fremstilles ved at tilsætte 0,5 ml heparin til 50 ml normal saltvand.
  8. Indsæt et invasivt blodtrykskateter ved hjælp af den samme fremgangsmåde ovenfor for at skabe en arteriotomi og passere kateteret.
    BEMÆRK: Opretholdelse af distal og proksimal trækkraft er afgørende for at minimere blodtab, når du får adgang til arterien.
  9. Når katetrene er sikret, skal du dække stedet med saltvandsvædet gasbind, og om nødvendigt kan huden sutureres ved hjælp af en 3.0 silkesutur for at forhindre infektion.

6. Vedligeholdelse af anæstesi, væske og blodgas

  1. Overvåg dybden af anæstesi gennem hele eksperimentet ved hjælp af kæbetone og palpebral refleks, og indgift α-chloralose intravenøst efter behov for at opretholde dyret under dyb anæstesi. Brug en indledende støddosis på 50 mg/kg og 20 mg/kg til yderligere boluser.
  2. Tilsæt ringelaktat med en hastighed på 4 ml/kg/h under hele forsøget som vedligeholdelsesvæske. For eksempel, hvis smågrisevægten er 3 kg, er væskeinfusionshastigheden 12 ml / t.
  3. Til analyse af sengegas skal du trække en arteriel blodprøve i en hepariniseret blodgassprøjte og præsentere prøven for analysatormaskinen. Vælg indstillingen arteriel blodgas, og vent på ~ 2-3 s for analysatoren at præsentere blodtræknålen.
    1. Indsæt forsigtigt nålen i enden af sprøjten, der indeholder blodprøven. Vent på, at analysatoren aspirerer den nødvendige prøve, og træk sprøjten ud. Lad maskinen analysere blodgassen og præsentere resultaterne.
    2. Baseret på resultaterne justeres ventilatoren for at opretholde pH mellem 7,35--7,45, partialtryk af kuldioxid (PCO2) mellem 35-45 mmHg og partialtryk af ilt (PaO2) mellem 80-150 mmHg. Indstillingerne varierer afhængigt af ventilatortypen, men involverer i vid udstrækning at øge eller reducere respirationsfrekvensen ved hjælp af passende knapper for at kompensere for hypoxi og / eller hyperkapni.
  4. Træk 3 ml blod ind i et lysegrønt rør (lithiumheparin). Prøven centrifugeres ved 2000 xg i 15 min. ved 4 °C for at ekstrahere plasma. Når plasmaet er afsluttet, kan det straks analyseres for serumkreatininniveau med sengekemianalysatoren eller opbevares ved -80 °C til senere analyse.
  5. Overvåg temperaturen kontinuerligt ved hjælp af et rektalt sondetermometer, og juster varmepudsets temperatur for at opretholde smågrisetemperaturen mellem 101 og 103 ° F.

7. Eksperiment gruppe; cecal ligering og perforering (CLP) 25,28,29

BEMÆRK: For smågrise i forsøgsgruppen skal du udføre CLP for at inducere polymikrobiel sepsis28 og overvåge dyret i 12 timer efter operationen for at give tilstrækkelig tid til, at alvorlig sepsis kan følge. Transdermal GFR-optagelse starter ved 8 timer efter cecal ligering for at give mulighed for 4 timers optagelse.

  1. Brug et kirurgisk blad til at skabe et 5-6 cm venstre paramedian lodret snit, da cecum hos svin ligger i venstre paralumbarfossa 30. Disseker ned i abdominale væglag, undgå skade på de overfladiske epigastriske kar.
  2. Når peritoneallaget er indskåret, skal du bruge en retraktor til at forbedre adgangen til intrabdominale strukturer.
  3. Identificer spiralkolon i den øverste venstre kvadrant af maven. Spor spiralkolon, caudally og dorsalt, for at lokalisere cecum. Ileum ses slutte sig til spiralkolon ved bunden af cecum.
  4. Ligate cecum lige distal til ileocecal junction (figur 1).
  5. Brug en 18 G nål til at lave syv punkteringer i cecum og ekstrudere afføring ind i peritonealområdet.
  6. Luk maven i lag med en 3,0 silkesutur ved hjælp af enten enkle afbrudte eller kontinuerlige sting. En hæftemaskine kan også bruges til at lukke hudlaget, hvis det er tilgængeligt.

8. Sham-gruppen

  1. Følg trinene 7.2-7.4 som ovenfor. Efter at have identificeret cecum, skal du placere det uberørt igen og lukke mavemuren på samme måde.
  2. Overvåg smågrise i skingruppen i 12 timer for at eliminere enhver forvirrende bias, der tilskrives langvarig eksponering for anæstesi.

9. Opsætning af transdermal GFR-enhed

  1. Efter 8 timers cecal ligering skal du gøre dig klar til at starte transdermal måling af GFR.
  2. Brug MB-tjenestesoftwareversionen 3.0 til at justere samplingshastigheden på GFR-enheden. Tilslut kort den transdermale GFR-enhed til computersoftwaren ved hjælp af USB-stikket. Åbn softwaren, klik på Opret forbindelse, og juster timingen til 4000 ms. Klik på Skriv for at gemme indstillingerne.
    BEMÆRK: Dette giver op til 6 timers samlet prøvetagningstid. Hos grisene afsluttes transdermal GFR på 4 timer. For eksperimenter, der kræver prøveudtagning op til 12 timer, skal du vælge indstillingen 8000 ms.
  3. Fastgør de dobbeltsidede klæbeplastre med et klart vindue til enheden. Fastgør enheden til den ene side, og sørg for, at den lysemitterende diode ligger over det klare vindue for at muliggøre sporing.
  4. Barber området over den laterale thoraxvæg. Fastgør batteriet til enheden, og sæt straks klæbeplasteret på plads med enheden, og sørg for, at det er godt sikret (figur 2). Da smågrisene er dybt bedøvede, kan tape være unødvendigt at holde enheden på plads.
    BEMÆRK: Klæbeplasteret alene er nok til at sikre. Men i forsøg, hvor dyret ville blive manipuleret, blive aktivt, eller hvor anæstesi kan blive forstyrret, kan det være vigtigt at anvende et bånd. En bandage kan også være en alternativ tilgang31.
  5. Der kræves en baseline-registrering på 3-5 minutter før administration af FITC-sinistrin.

10. FITC-sinistrin forberedelse og injektion

  1. Der fremstilles en blanding af FITC-sinistrin med saltopløsning til en slutkoncentration på 50 mg/ml. Den dosis, der gives til pattegrisen, er 20 mg/kg. FITC-sinistrin leveres i pulverform.
    BEMÆRK: FITC-sinistrin kan også administreres gennem et perifert venekateter indsat i aurikulærvenen. Det er vigtigt at opnå et højt topniveau ved at administrere FITC-sinistrin som en push bolus gennem lårbenet vene venekateter.
  2. Fastgør sprøjten med medicin til den ene side af en trevejs stoppik og en saltvandsskylning på den anden side af stophanen. Skub FITC-sinistrin og følg straks med en 5 ml saltvandsbolus, før du lukker trevejs stophanen til pattegrisvenen.

11. Transdermal GFR-optagelse

  1. Hold enheden fastgjort til grisen i 4 timer. I løbet af denne tid skal grisen holdes under anæstesi ved hjælp af intermitterende doser α-chloralose i en koncentration på 20 mg / kg for at undgå enhver bevægelsesartefakt.
  2. I slutningen af 4 timer skal du fjerne enheden og straks frakoble batteriet.

12. GFR-måling

  1. Tilslut den transdermale GFR-enhed til computeren ved hjælp af USB-stikket, der leveres af leverandøren.
  2. Åbn læsesoftwaren for at hente data fra enheden. Gem rådata ved at klikke på sekvensen: opret forbindelse, læs, omdøb og gem. Som beskrevet i manualen skal du behandle og evaluere de gemte data i analysesoftwaren.
  3. Kort sagt skal du åbne softwaren vers. 3.0 og importere dataene. Juster forskydnings-, start- og slutpositionerne ved hjælp af de automatiske markører. Fjern artefakter, hvis det er nødvendigt, og klik på Fit. Dette giver en aflæsning, der viser FITC-sinistrin-clearance på få minutter (t1/2). T1/2 bruges efterfølgende til at beregne tGFR32,33 som nedenfor:
    Equation 1
    BEMÆRK: I samråd med producenten er omregningsfaktoren, der anvendes til svin, 20 (hvilket indikerer, at 20% af kropsvægten er ekstracellulært rum) i modsætning til 21,33 hos rotter (tGFR i ml / min) og 14,616,8 hos mus (tGFR i μL / min). Dette skyldes, at GFR måles nøjagtigt som en funktion af ekstracellulær væske34,35, som igen er afhængig af kropsvægt 36.

13. Pattegrise eutanasi

  1. Saml 3 ml blod efter 12 timers CLP til yderligere biokemisk analyse.
  2. Aflivning af grisen ved at administrere 0,2 ml / kg forblandet blanding af 20% natriumpentobarbital og phenytoinnatrium intravenøst.
  3. Høst den rigtige nyre til histopatologisk undersøgelse, før du tager grisen til lighuset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette afsnit præsenterer vi for første gang de repræsentative data fra brugen af transdermal GFR hos neonatale grise. Vi brugte en cecal ligation og punktering model, som tidligere har vist sig at nedsætte nyrefunktionen28. Derfor antog vi, at der hos vores CLP-grise skulle være et akut fald i GFR svarende til AKI, og dette skulle detekteres på den transdermale GFR-enhed som øget clearancetid (t1/2) og derved validere dets anvendelse til svin. Syv hangrise var inkluderet, tre falske og fire sepsis. De to grupper havde sammenlignelige vægte (figur 3A). Som forventet28 øgede 12 timers sepsis serumniveauerne af C-reaktivt protein (CRP), en bakteriæmi og sepsismarkør (figur 3B). Repræsentative FITC-sinistrin-clearancekurver i sham vs septiske smågrise er vist (figur 4 A, B), med AKI vist ved at overlejre skin- og sepsiskurverne (figur 4C). AKI fremgår af et øget areal under kurven for CLP-grisene. Dette kan ses synligt, når skinkurven lægges på CLP-kurven. Den gennemsnitlige halveringstid for FITC-sinistrin i fup- og sepsisgrupperne var henholdsvis 114 og 537 minutter (figur 5A). Den gennemsnitlige GFR i skingruppen var 5,1 ml/min/100 g af kropsvægten, mens den i sepsisgruppen var 1,06 ml/min/100 g af kropsvægten (figur 5B). Et yderligere dyr blev udelukket, da sonden blev forskudt, hvilket forstyrrede frihøjdekurven og tiden. Mens 12 timers serumkreatinin (en biomarkør for akut nyreskade) ikke ændrede sig i skingruppen, blev den øget fra ~ 0,6 til 1,08 mg / dL hos septiske grise (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Cecum ligation kirurgi. (A) Cecum identificeret og bragt til det ydre. (B) Cecum ligeret i bunden med et silkebånd, inden det punkteres med en nål. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fastgørelse af transdermal enhed til huden. (A) Hud, der er barberet inden fastgørelse af klæbemiddelplaster. (B) Transdermal GFR-enhed fastgjort til klæbemiddelplasteret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative resultater. (A ) Vægten af de smågrise, der er anvendt i denne undersøgelse, og (B) Serum C-reaktive proteinniveauer (CRP) i mekanisk ventileret skin- og septisk hangrise ( uparret t-test). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative FITC-sinistrin-clearancekurver i mekanisk ventilerede skin- og septiske hangrise. (A ) 12 timers skin, (B) 12 h sepsis. Septikgrise til stede med nedsat nyrefunktion som demonstreret ved et øget areal under kurven. Sorte datapunkter repræsenterer rådata, blå linjer passer til tre rum, grønne linjer 95% konfidensintervaller og rød linje de filtrerede data. C) Overlejring af repræsentative kurver for at afspejle graden af afvigelse fra baseline hos septiksvin. Sepsiskurven (rød) viste minimal clearance af FITC-sinistrin, hvilket indikerer AKI. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative resultater. (A ) FITC-sinistrin halveringstid og ( B) GFR-plots i mekanisk ventileret skin- og septiske hangrise (uparret t-test). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Serumkreatinin i mekanisk ventileret skin- og septisk hangrise. (Envejs ANOVA test). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir beskriver praktiske trin til bestemmelse af nyrefunktion hos svin ved hjælp af de miniaturiserede transdermale GFR-skærme og FITC-sinistrin i en mekanisk ventileret, bedøvet neonatal grisemodel. Tidligere papirer har etableret eksperimentelle transdermale GFR-protokoller hos gnavere11,12,14, men der findes ingen protokoller hos svin.

For nylig har der været et drev til at udforske alternative dyremodeller for at løse uhåndterlige sygdomme og lette byrden af nyresygdom hos mennesker. Desværre har mange af disse tilgange haft translationelle begrænsninger på grund af størrelse, anatomiske og fysiologiske forskelle. Gnaveres nyreanatomi og patofysiologi har store forskelle sammenlignet med mennesker37. Da menneske- og svinesystemerne deler lignende anatomiske og funktionelle egenskaber, kan svinemodellen være en mere realistisk patofysiologisk model af menneskelige sygdomme38,39. Grise bruges nu i vid udstrækning til at afgrænse patofysiologi og i lægemiddeludvikling. Med offentliggørelsen af grisegenomet står svinemodellen sammen med en vellykket transgen produktion af sygdomsspecifikke modeller til at indtage en mere kritisk rolle i translationel forskning40,41.

Inulinclearance er fortsat det mest accepterede middel til GFR-bestemmelse, men er upraktisk i store dyremodeller på grund af behovet for kontinuerlig infusion af inulin, kateterisering af blæren og dens tidskrævende og besværlige natur42. Serumkreatinin og blodurinstofkvælstof (BUN) bruges almindeligvis til at måle nyrefunktionen i prækliniske undersøgelser, men fordi kreatinin udskilles i tubuli, og urinstof i stigende grad reabsorberes i dehydrering, har disse markører vist sig at være dårlige til at estimere nyrefunktionen 5,43. Det afgørende var, at rørformet kreatininsekretion viste sig at forårsage overvurdering af GFR, når det blev brugt som markør for nyrefunktion hos grisene6. På grund af deres krops habitus er det også mere sandsynligt, at en stigning i kreatinin ses i store dyremodeller sammenlignet med gnavere. En undersøgelse på mus afslørede en 1,5 gange stigning i serumkreatinin 6 timer efter cecal ligering44. Tidligere viste vi en stigning i kreatinin hos neonatale grise ved 6 timer efter CLP28. I denne undersøgelse holdt vi dyrene i længere tid, ~ 12 timer efter cecal ligering for at give tilstrækkelig tid til betydelig AKI og en efterfølgende stigning i kreatinin. Som i vores tidligere undersøgelse bekræftede vi induktionen af sepsis ved en stigning i serumniveauer af CRP, en inflammations- og sepsismarkør. I denne undersøgelse, og som tidligere papirer viser, er sværhedsgraden af sepsis efter CLP afhængig af længden af ligering og antallet af punkteringer44.

En protokol til måling af GFR hos svin ved hjælp af Iohexol er tidligere blevet valideret hos svin37, men i modsætning hertil er den transdermale GFR-procedure en markant forbedring. Det er mindre besværligt, undgår gentagen blod- eller urinprøvetagning og giver et realtidsvindue til nyrefunktion og muligheden for gentagne, serielle målinger i det samme dyr45. Denne undersøgelse giver praktiske retningslinjer for bestemmelse af transdermal GFR hos svin.

Som fastslået af andre grupper er de mest kritiske trin den korrekte fiksering af enheden til dyret og bolusinjektionen af FITC-sinistrin. Måleapparatet skal være godt fastgjort til hudoverfladen for at forhindre bevægelsesartefakter på sporet. Fordi grise er mindre hårede end gnavere, er det ikke nødvendigt at bruge en hårfjerningscreme. En ren barbering med en klipper kan være alt, hvad der er nødvendigt. Dette minimerer den depilering, der er forbundet med at øge halveringstiden for FITC-sinistrin, hvis mekanisme er ukendt12. For korrekt fiksering kræves et dobbeltsidet klæbeplaster og tape for at holde enheden på plads. De optimale placeringssteder for enheden er den laterale thoraxvæg og den ventrale abdominale region. Disse områder korrelerede med færre bevægelsesartefakter.

Ved injektion af FITC-sinistrin skal den korrekte og hele dosis injiceres i en væskebevægelse i venen. Når injektionen afbrydes og genstartes, skaber den flere "mini-toppe" på frigangskurven. Halevenen bruges rutinemæssigt til små gnavere, men auricular ørevenen tilbyder en mere tilgængelig og fremtrædende rute hos grisene. En kanyle kan placeres i ørevenen til flere målinger hos bevidste grise. En vigtig forskel at bemærke i prøvetagningstiden er, at i modsætning til gnavere (~ 1-2 timer) holder grise længere (~ 4 timer), hvilket tilnærmer den tid, det tager for FITC-sinistrin at blive ryddet fra cirkulationen. Så vidt vi ved, er dette det første papir, der beskriver transdermal GFR via FITC-sinistrinclearance hos svin. Så der findes ingen citater til reference. Den anvendte måletid ~ 4 timer blev nået frem til via konsultationer med producenten. Denne prøvetagningstid kan sammenlignes med en tidligere undersøgelse, der validerede transdermal GFR hos andre ikke-gnaverpattedyr14.

Ved evaluering af transdermal GFR hos smågrise er der et par faktorer, der skal overvejes. Et-rums modeller er kendt for at overvurdere GFR betydeligt46; Vi bruger den kinetiske model med tre rum, som er mere præcis og giver trevejskommunikation af den intravenøst injicerede markør mellem plasmaet, ekstracellulært rum og dybere komponenter46. Disse er også mekanisk ventilerede smågrise under meget dyb anæstesi i ~ 12 timer. Da anæstesi påvirker nyrefunktionen47,48, kan det være værd at tage det i betragtning i procedurer, der kræver lang sedation, eller hvor eksperimentelle manøvrer kræver yderligere anæstesi sammen med GFR-overvågning. Endelig, og måske mest afgørende, har neonatale smågrise stadig udviklende nyresystemer med umodne nefroner, der fungerer ved en brøkdel af det voksne dyr49. Derfor demonstrerer de lavere GFR og nyrefunktion50.

Som tidligere angivet er transdermal GFR hos svin ikke et absolut mål for sinistrinkoncentrationer i blodet. Det er kun et skøn over henfald i fluorescens over tid12. Brugen af en konverteringsfaktor forsøger at afbøde dette ved at udtrykke GFR i ml / min. Men fordi omregningsfaktoren er afhængig af ekstracellulært rum, som igen er afhængig af kropsvægt34,35,36, er det muligt for store variationer at eksistere, hvis vægten ikke kontrolleres for, eller hvis det ekstracellulære rum ikke er nøjagtigt defineret 51,52.

Derudover ser hudpigmentering ud til at påvirke transdermal FITC-sinistrinclearance 12,31. I vores undersøgelser fandt vi, at de pigmenterede grise viste nedsat signal. I et tilfælde registrerede vi ikke signal i en intenst mørkfarvet gris. Da baggrundssignalet imidlertid har tendens til at blive reduceret hos pigmenterede dyr12, fandt vi, at GFR-værdierne stort set var sammenlignelige. En løsning på dette er at vælge lysere farvede områder af huden, når du placerer enheden. Da disse grise i vid udstrækning blev brugt i en kirurgisk sygdomsmodel med flere former for belysning og varmekilder involveret, skal man redegøre for potentielle bevægelsesartefakter på GFR-sporene via reflekteret lys absorberet fra omgivende hud12. En løsning på dette kan være at minimere infrarødt lys under optagelse eller dække enhederne i folie.

Sammenfattende tilbyder denne undersøgelse en enkel og pålidelig metode til måling af glomerulær filtreringshastighed hos neonatale grise ved hjælp af transdermal måling af FITC-sinistrinclearance. Desuden understøtter vores data systemets anvendelighed til evaluering af nyrefunktion i indstillingerne for akut nyreskade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health tilskud R01 DK120595 og R01 DK127625 tildelt Dr. Adebiyi. Indholdet af dette papir er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Tak til Dr. Daniel Schock-Kusch, site director hos MediBeacon GmbH, for hans råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha - Chloralose Sigma-Aldrich C0128-25G Used for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0 Surgical Specialties SP117 Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8C Fischer Scientific 75-008-821 Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed Progressive Medical International 1109021995 Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 g MediBeacon Inc. FTCF S001 Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer Instrumentation Laboratory 5700 For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 in Adroit Medical Systems V029 Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy Pump Adroit Medical Systems HTP Allows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst One IDEXX Laboratories 89-92525-00 Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr Millar SPR-524 Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulator True Care TCRTCBINF033G Used to connect IV fluid bag to vein catheter
Ketamine Covetrus 68317 Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0 MediBeacon Inc. N/A Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGVR33RS Syringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant Ventilator Sechrist Millennium 20409 Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) Covetrus 72934 Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bag Baxter 2B2323Q Maintanence fluid infusion
Sterile Gloves Henry Schein 104-5920 Used by operator during surgery
Sterile Gown Halyard Health 95021 Used by operator during surgery
Steril Towel Medline 42131704 Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needle Ethicon NC1842168 Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR Monitor MediBeacon Inc. TDM004 Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patch MediBeacon Inc. PTC-SM001 Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds Fisher Scientific NC9303017 To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5 Micro medical tubing BB31695 For femoral vein cannulation
Xylazine Covetrus 61035 Used for induction of anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pasala, S., Carmody, J. B. How to use... serum creatinine, cystatin C and GFR. Archives of Disease in Childhood Education and Practice Edition. 102 (1), 37-43 (2017).
  2. Smith, H. W. The Kidney: Structure and Function in Health and Disease. , Oxford University Press, USA. (1951).
  3. Gutman, Y., Gottschalk, C. W., Lassiter, W. E. Micropuncture study of inulin absorption in the rat kidney. Science. 147 (3659), 753-754 (1965).
  4. Ellery, S. J., Cai, X., Walker, D. D., Dickinson, H., Kett, M. M. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in small rodents: through the skin for the win. Nephrology. 20 (3), 117-123 (2015).
  5. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
  6. Wendt, M., Waldmann, K. H., Bickhardt, K. Comparative studies of the clearance of inulin and creatinine in swine. Zentralblatt fur Veterinarmedizin. Reihe A. 37 (10), 752-759 (1990).
  7. Schwartz, G. J., Brion, L. P., Spitzer, A. The use of plasma creatinine concentration for estimating glomerular filtration rate in infants, children, and adolescents. Pediatric Clinics of North America. 34 (3), 571-590 (1987).
  8. Boer, D. P., de Rijke, Y. B., Hop, W. C., Cransberg, K., Dorresteijn, E. M. Reference values for serum creatinine in children younger than 1 year of age. Pediatric Nephrology. 25 (10), 2107-2113 (2010).
  9. Guignard, J. P., Drukker, A. Why do newborn infants have a high plasma creatinine. Pediatrics. 103 (4), 49 (1999).
  10. Friedemann, J., Schock-Kusch, D., Shulhevich, Y. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in conscious laboratory animals: state of the art and future perspectives. Reporters, Markers, Dyes, Nanoparticles, and Molecular Probes for Biomedical Applications IX. 10079, 63-71 (2017).
  11. Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents. Journal of Visualized Experiments. (109), e53767 (2016).
  12. Scarfe, L., et al. Transdermal measurement of glomerular filtration rate in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58520 (2018).
  13. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  14. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
  15. Almond, G. W. Research applications using pigs. The Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. 12 (3), 707-716 (1996).
  16. Bassols, A., et al. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. Proteomics Clinical Applications. 8 (9-10), 715-731 (2014).
  17. Ayuso, M., Irwin, R., Walsh, C., Van Cruchten, S., Van Ginneken, C. Low birth weight female piglets show altered intestinal development, gene expression, and epigenetic changes at key developmental loci. FASEB Journal. 35 (4), 21522 (2021).
  18. Pierson, R. N. Progress toward pig-to-human xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1871-1873 (2022).
  19. Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1889-1898 (2022).
  20. Reardon, S. First pig kidneys transplanted into people: what scientists think. Nature. 605 (7911), 597-598 (2022).
  21. Lu, T., Yang, B., Wang, R., Qin, C. Xenotransplantation: current status in preclinical research. Frontiers in Immunology. 10, 3060 (2019).
  22. Pattison, R. J., English, P. R., MacPherson, O., Roden, J. A., Birnie, M. Hypothermia and its attempted control in newborn piglets. Proceedings of the British Society of Animal Production. 1990, 81 (1972).
  23. Tucker, B. S., Petrovski, K. R., Kirkwood, R. N. Neonatal piglet temperature changes: effect of intraperitoneal warm saline injection. Animals. 12 (10), 1312 (2022).
  24. Alcalá Rueda, I., et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 278 (8), 3081-3090 (2021).
  25. Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques, Third Edition. , CRC Press/Taylor & Francis Group. Boca Raton. (2016).
  26. Steinbacher, R., von Ritgen, S., Moens, Y. P. Laryngeal perforation during a standard intubation procedure in a pig. Laboratory Animals. 46 (3), 261-263 (2012).
  27. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Göttingen minipig: intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. Journal of Visualized Experiments. (52), e2652 (2011).
  28. Soni, H., Adebiyi, A. Early septic insult in neonatal pigs increases serum and urinary soluble Fas ligand and decreases kidney function without inducing significant renal apoptosis. Renal Failure. 39 (1), 83-91 (2017).
  29. Bütz, D. E., Morello, S. L., Sand, J., Holland, G. N., Cook, M. E. The expired breath carbon delta value is a marker for the onset of sepsis in a swine model. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 29 (4), 606-613 (2014).
  30. Turner, A. S., McIlwraith, C. W. Techniques in Large Animal Surgery. , Lea & Febiger. (1989).
  31. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
  32. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  33. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (10), 2997-3001 (2009).
  34. Peters, A. M. Expressing glomerular filtration rate in terms of extracellular fluid volume. Nephrology Dialysis Transplantation. 7 (3), 205-210 (1992).
  35. Groth, S., Christensen, A. B., Nielsen, H. CdTe-detector registration of 99mTc-DTPA clearance. European Journal of Nuclear Medicine. 8 (6), 242-244 (1983).
  36. Guyton, A. C., Hall, J. E. The body fluid compartments: extracellular and intracellular fluids; interstitial fluid and edema. Textbook of Medical Physiology. 9, 306-308 (2000).
  37. Luis-Lima, S., et al. Iohexol plasma clearance simplified by dried blood spot testing. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 33 (9), 1597-1603 (2018).
  38. Kobayashi, E., Hishikawa, S., Teratani, T., Lefor, A. T. The pig as a model for translational research: overview of porcine animal models at Jichi Medical University. Transplantation Research. 1 (1), 8 (2012).
  39. Swindle, M. M., et al. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  40. Ibrahim, Z., et al. Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems. Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2006).
  41. Judge, E. P., et al. Anatomy and bronchoscopy of the porcine lung. A model for translational respiratory medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (3), 334-343 (2014).
  42. Stevens, L. A., Levey, A. S. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (11), 2305-2313 (2009).
  43. Bankir, L., Yang, B. New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism. Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).
  44. Ruiz, S., et al. Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture. Intensive Care Medicine Experimental. 4 (1), 22 (2016).
  45. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).
  46. Frennby, B., Sterner, G. Contrast media as markers of GFR. European Radiology. 12 (2), 475484 (2002).
  47. Burchardi, H., Kaczmarczyk, G. The effect of anaesthesia on renal function. European Journal of Anaesthesiology. 11 (3), 163-168 (1994).
  48. Fusellier, M., et al. Influence of three anesthetic protocols on glomerular filtration rate in dogs. American Journal of Veterinary Research. 68 (8), 807811 (2007).
  49. Arant, B. S. Functional immaturity of the newborn kidney-paradox or prostaglandin. Homeostasis, Nephrotoxicity, and Renal Anomalies in the Newborn. , Springer. Boston, MA. 271-278 (1986).
  50. Gattineni, J., Baum, M. Developmental changes in renal tubular transport-an overview. Pediatric Nephrology. 30 (12), 2085-2098 (2015).
  51. Gu, X., Yang, B. Methods for assessment of the glomerular filtration rate in laboratory animals. Kidney Diseases. , 1-11 (2022).
  52. Mullins, T. P., Tan, W. S., Carter, D. A., Gallo, L. A. Validation of non-invasive transcutaneous measurement for glomerular filtration rate in lean and obese C57BL/6J mice. Nephrology. 25 (7), 575-581 (2020).

Tags

Medicin udgave 187
Transdermal måling af glomerulær filtreringshastighed hos mekanisk ventilerede smågrise
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fanous, M. S., Afolabi, J. M.,… More

Fanous, M. S., Afolabi, J. M., Michael, O. S., Falayi, O. O., Iwhiwhu, S. A., Adebiyi, A. Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets. J. Vis. Exp. (187), e64413, doi:10.3791/64413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter