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Mesure transdermique du débit de filtration glomérulaire chez les porcelets ventilés mécaniquement

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64413
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, College of Medicine University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

Le débit de filtration glomérulaire (DFG) est le marqueur idéal pour évaluer la fonction rénale. Cependant, la méthode de mesure standard utilisant l’injection d’inuline avec analyse de sang et d’urine en série n’est pas pratique. Cet article décrit une méthode pratique pour mesurer le DFG par voie transdermique chez les porcelets.

Abstract

La mesure transdermique du débit de filtration glomérulaire (DFG) a été utilisée pour évaluer la fonction rénale chez les animaux conscients. Cette technique est bien établie chez les rongeurs pour étudier les lésions rénales aiguës et les maladies rénales chroniques. Cependant, la mesure du DFG à l’aide du système transdermique n’a pas été validée chez les porcs, une espèce ayant un système rénal similaire à celui des humains. Par conséquent, nous avons étudié l’effet de la septicémie sur le DFG transdermique chez des porcs nouveau-nés anesthésiés et ventilés mécaniquement. La septicémie polymicrobienne a été induite par ligature et ponction (CLP). Le système de mesure du DFG transdermique consistant en un capteur de fluorescence miniaturisé a été fixé à la peau rasée du porc pour déterminer la clairance de la sinistrone conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), un traceur de DFG injecté par voie intraveineuse. Nos résultats montrent qu’à 12 h post-CLP, la créatinine sérique augmentait avec une diminution du DFG. Cette étude démontre, pour la première fois, l’utilité de l’approche DFG transdermique dans la détermination de la fonction rénale chez les porcs néonatals ventilés mécaniquement.

Introduction

Une évaluation pratique et quantitative de la fonction rénale est la mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG), qui indique dans quelle mesure les reins filtrent le sang sur la base du principe de clairance1. Une méthode antérieure de mesure du DFG implique l’injection intraveineuse de composés exogènes tels que l’inuline ou la sinistrine, en effectuant des mesures en série des niveaux plasmatiques/urinaires pour détecter leur clairance 2,3. Cette méthode est lourde et nécessite la collecte en série d’échantillons de plasma et d’urine4. Une alternative est la mesure des produits finaux métaboliques endogènes tels que la créatinine. Cependant, cela prend du temps et, parfois, est imprécis, car il est non seulement filtré par le glomérule mais également sécrété par les tubules 5,6. De plus, le taux de créatinine est influencé par le sexe, l’âge, l’alimentation et la masse musculaire 7,8,9.

Une mesure plus précise, peu invasive et largement utilisée du DFG est l’utilisation de moniteurs de DFG transdermiques, qui mesurent le DFG en temps réel chez les animaux 4,10. La sinistrine, un marqueur rénal exogène hautement soluble et librement filtré, est marquée avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Ce composé conjugué est injecté par voie intraveineuse et la fonction rénale en temps réel peut être évaluée sans prélèvement d’échantillons de sang etd’urine 11. L’utilisation de la mesure du DFG transdermique a été validée chez les rongeurs12, les chiens 13 et les chats14, mais pas chez les porcs.

Les espèces porcines partagent plusieurs caractéristiques anatomiques et physiologiques avec les humains, ce qui en fait des animaux idéaux pour l’étude de diverses maladies humaines15. L’utilisation de porcs dans la recherche biomédicale translationnelle est devenue de plus en plus populaire et préférée aux modèles de rongeurs parce qu’elle imite la physiologie humaine et la physiopathologie16. Les porcs néonatals sont intéressants pour comprendre les mécanismes des maladies propres aux patients pédiatriques17. En outre, les progrès récents de la transplantation de porcs à organes humains incitent à élargir les outils de diagnostic pour les essais précliniques et cliniques 18,19,20,21. Cet article, pour la première fois, fournit un guide pour l’utilisation du dispositif transdermique dans la mesure du DFG chez les porcs nouveau-nés.

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Protocol

Les procédures sont rédigées conformément aux normes nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre des sciences de la santé de l’Université du Tennessee (UTHSC).

REMARQUE: Les porcelets du groupe expérimental sont soumis à une ligature et à une ponction des cæcales, tandis que le groupe simulé ne subit qu’une ouverture de l’abdomen sans ligature ou ponction des cæcales. Les porcelets des deux groupes sont maintenus sous anesthésie pendant 12 heures après l’intervention afin de laisser suffisamment de temps pour que la septicémie et les lésions rénales aiguës (IRA) s’ensuivent dans le groupe expérimental. La mesure transdermique du DFG suivra 8 h après l’intervention pour un total de 12 h.

1. Approvisionnement et logement des porcelets

  1. Identifiez une ferme porcine locale qui peut fournir des porcelets néonatals âgés de 3 à 5 jours. Planifiez l’accouchement au début de la semaine pour terminer l’expérimentation avant que les porcelets aient plus de 7 jours.
    REMARQUE : Le fournisseur a fourni de trois à cinq porcelets le lundi pour cette expérience; vendredi, les porcelets auraient subi l’expérience. L’utilisation du même sexe et du même âge est essentielle pour éviter les facteurs de confusion.
  2. À l’arrivée du porcelet, assurez-vous qu’il a une pièce d’identité individuelle (p. ex., une étiquette auriculaire et un registre indiquant le poids et l’âge).
  3. Hébergez les porcelets dans une unité de soins pour animaux de laboratoire (ULAT) sous les soins d’un vétérinaire agréé. Les animaux sont logés en groupe dans un enclos spacieux avec un sol en béton massif qui se lave facilement à l’eau pour maintenir un bon assainissement.
  4. Ajoutez un meuble tel qu’une balle lourde pour permettre l’enrichissement et la stimulation de l’environnement.
  5. S’assurer que le LACU offre des conditions environnementales optimales, y compris les éléments clés suivants: assainissement, nutrition, contrôle de la température, ventilation et cycle jour-nuit en contrôlant l’éclairage.
  6. Demandez au vétérinaire de vérifier quotidiennement le porcelet, y compris la mesure du poids, pour informer l’investigateur si un porcelet semble malade, ce qui peut nécessiter une exclusion de l’expérience.
  7. Laissez les porcelets pendant au moins 1 jour pour s’acclimater à l’environnement, ce qui aide à minimiser le stress.

2. Préparation préopératoire

  1. Préparez la station chirurgicale avant de commencer l’expérience. Cela comprend un coussin chauffant, des cathéters, un ventilateur, un tube endotrachéal, une solution saline héparinée et un sac de liquide de lactate de sonnerie.
    REMARQUE: Les porcelets ont une faible capacité de thermorégulation et sont sujets à l’hypothermie qui altère l’hémodynamique22,23. Par conséquent, il est essentiel de prévoir suffisamment de temps pour que le coussin chauffant se réchauffe.
  2. Préparer 10 mg/mL de α-chloralose en le mélangeant avec une solution saline à 60 °C jusqu’à ce que le mélange soit limpide. Ne pas surchauffer la solution pour éviter la cristallisation du médicament lors du refroidissement. Filtrer avec un filtre à seringue (taille 0,22 μm) avant l’administration aux porcelets.
  3. Établir un médicament anesthésique basé sur le poids de l’animal - Kétamine: 20 mg / kg et Xylazine: 2,2 mg / kg. Utilisez α chloralose (5 mL/kg) pour maintenir l’anesthésie.
    REMARQUE: α-chloralose est utilisé en raison de la facilité d’administration IV par rapport à inhalé
    Les anesthésiques, car ces derniers nécessitent une machine anesthésique et un système de récupération approprié à administrer via un tube endotrachéal.

3. Anesthésie

  1. Effectuer l’induction de l’anesthésie dans l’enclos à porcs, un environnement familier pour les porcelets, afin d’éviter un stress excessif.
  2. Cueillez délicatement le porcelet par les pattes arrière et administrez de la kétamine: 20 mg / kg et de la xylazine: 2,2 mg / kg dans la patte arrière au niveau du muscle semimembranosus/semitendinosus, à l’aide d’une aiguille de 23 G 3/4.
  3. Attendez quelques minutes pour que les médicaments fassent effet. Vérifiez le niveau d’anesthésie adéquat en vous assurant que l’animal est suffisamment détendu pour être immobile, avec perte du réflexe palpébral et du tonus de la mâchoire pour permettre un transport facile et sûr au poste chirurgical. Évaluer le réflexe palpébral en touchant le coin interne de l’œil; L’absence de clignement des yeux indique une anesthésie adéquate.

4. Trachéostomie

REMARQUE: Cette expérience est la non-survie, donc une trachéotomie est effectuée pour établir une voie respiratoire pour la ventilation mécanique. La trachéostomie est une procédure rapide et facile, par opposition à l’intubation endotrachéale, qui est difficile chez les porcelets compte tenu de l’anatomie de leur tête et de leurs voies respiratoires supérieures24,25. De plus, un laryngospasme est fréquemment signalé pendant l’intubation, entraînant une période prolongée d’hypoxie et d’hypercarbie pouvant compromettre les résultats26.

  1. Placez le porcelet en position couchée dorsale. Identifier le cartilage cricothyroïdien en palpant la proéminence du cartilage thyroïdien qui se sent ferme. Stériliser la zone avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70% avant d’appliquer un champ stérile.
  2. À l’aide d’une lame chirurgicale, faites une incision médiane ventrale de 2-3 cm inférieure à l’extrémité caudale du cartilage thyroïdien.
  3. À l’aide d’un hémostatique de moustique incurvé, disséquez carrément les tissus et les muscles sous-cutanés sus-jacents (sternohyoideus et coli cutané) jusqu’à ce que la membrane cricothyroïdienne et les premiers anneaux trachéaux soient visualisés. Lors de la dissection, soyez prudent pour éviter de blesser les vaisseaux sanguins.
  4. Obtenez une vue dégagée de la membrane cricothyroïdienne et des anneaux trachéaux24, puis utilisez une paire de pinces à angle droit mixter longues pour élever les structures.
    1. Avec une paire de petits ciseaux, faites une petite incision au niveau de la membrane cricothyroïdienne ou du premier anneau trachéal. Étendre la coupe horizontalement à ~0,5 cm pour passer un tube endotrachéal de 3,0 mm.
    2. Insérez le tube jusqu’à la marque de 5 cm. Assurez-vous de l’expansion thoracique bilatérale et des bruits respiratoires avant de fixer le tube.
  5. Passez du ruban ombilical autour de la trachée pour la fixer en place. Du ruban adhésif supplémentaire est utilisé pour fixer le tube à la base de la mâchoire.
  6. Allumez le ventilateur, connectez le tube endotrachéal et roulez les boutons spécifiques (par exemple. Boutons SIMV, boutons PEEP, etc.) pour sélectionner les paramètres de base suivants. Mode de contrôle de la pression: ventilation mécanique intermittente synchronisée (SIMV); pression inspiratoire de pointe (PIP) - 15; pression expiratoire positive (PEP) - 5; Taux- 20; I-temps - 0,6. Après la première analyse des gaz du sang, ajuster les réglages du ventilateur en fonction des résultats des gaz du sang, dans le but de maintenir une oxygénation et une ventilation adéquates.

5. Canulation des vaisseaux fémoraux

  1. Établir les voies respiratoires et la ventilation, avant de porter l’attention sur les vaisseaux fémoraux pour l’accès veineux et la surveillance invasive de la pression artérielle. L’artère fémorale est identifiée en sentant un pouls au sillon entre les muscles sartorius et gracilis, et la veine peut être trouvée juste médiale à l’artère.
  2. Pendant que le porcelet est couché en position couchée dorsale, stérilisez la région de l’aine à l’aide de povidone iodée et d’éthanol et appliquez un champ de taille appropriée.
  3. Utilisez une lame chirurgicale pour créer une incision longitudinale de 3-4 cm, commençant crânienne au niveau du pli inguinal et s’étendant distalement le long du canal fémoral.
  4. Appliquer une dissection émoussée et nette, en utilisant des pinces et des ciseaux incurvés par les moustiques, respectivement, pour disséquer jusqu’au niveau du faisceau neurovasculaire fémoral. Le faisceau se trouve profondément dans le corps du muscle gracillis27. Disséquer circonférentiellement l’artère fémorale et la veine sur une distance de 2 à 3 cm pour permettre la canulation. Ligate petites branches latérales si nécessaire.
  5. Appliquez une cravate en soie 3.0 aux extrémités proximales et distales de l’artère et de la veine pour appliquer la traction. Attachez la suture de soie distale sur la veine et l’artère, en ligaturant les vaisseaux.
  6. En commençant par la veine fémorale, maintenez une traction distale et proximale sur les liens de soie, puis utilisez une paire de micro-ciseaux pour créer une veinotomie.
  7. Ensuite, utilisez un introducteur de cathéter de prélèvement veineux pour ouvrir le vaisseau tout en insérant un cathéter en polyuréthane prémesuré d’un diamètre interne x diamètre extérieur de 0,86 mm x 1,32 mm. Une fois inséré, attachez la suture de soie proximale 3.0 pour fixer le cathéter. Rincer le cathéter avec 3 mL de solution saline héparinée (1 U/mL). Cette solution peut être obtenue en ajoutant 0,5 mL d’héparine à 50 mL de solution saline normale.
  8. Insérez un cathéter de pression artérielle invasif en utilisant la même approche ci-dessus pour créer une artériotomie et passer le cathéter.
    REMARQUE: Le maintien de la traction distale et proximale est essentiel pour minimiser la perte de sang lors de l’accès à l’artère.
  9. Une fois les cathéters fixés, couvrez le site avec de la gaze imbibée de solution saline et, si nécessaire, la peau peut être suturée à l’aide d’une suture en soie 3.0 pour prévenir l’infection.

6. Maintien de l’anesthésie, des liquides et des gaz du sang

  1. Surveiller la profondeur de l’anesthésie tout au long de l’expérience, en utilisant le tonus de la mâchoire et le réflexe palpébral, et administrer α-chloralose, par voie intraveineuse, au besoin pour maintenir l’animal sous anesthésie profonde. Utilisez une dose de charge initiale de 50 mg / kg et 20 mg / kg pour les autres bolus.
  2. Infuser le lactate de sonnerie à un débit de 4 mL/kg/h tout au long de l’expérience comme fluide d’entretien. Par exemple, si le poids du porcelet est de 3 kg, le débit de perfusion de liquide est de 12 mL/h.
  3. Pour l’analyse des gaz au chevet du patient, prélever un échantillon de sang artériel dans une seringue héparinée et présenter l’échantillon à l’analyseur. Sélectionnez l’option gaz du sang artériel et attendez ~2-3 s que l’analyseur présente l’aiguille de prélèvement sanguin.
    1. Insérez délicatement l’aiguille dans l’extrémité de la seringue contenant l’échantillon de sang. Attendez que l’analyseur aspire l’échantillon requis et retirez la seringue. Laissez la machine analyser les gaz du sang et présenter les résultats.
    2. En fonction des résultats, ajuster le ventilateur pour maintenir le pH entre 7,35 et 7,45, la pression partielle de dioxyde de carbone (PCO2) entre 35 et 45 mmHg et la pression partielle d’oxygène (PaO2) entre 80 et 150 mmHg. Les réglages diffèrent en fonction du type de ventilateur, mais impliquent en grande partie l’augmentation ou la réduction de la fréquence respiratoire à l’aide de boutons appropriés pour compenser l’hypoxie et / ou l’hypercapnie.
  4. Prélever 3 mL de sang dans un tube vert clair (héparine au lithium). Centrifuger l’échantillon à 2000 xg pendant 15 min, maintenu à 4 °C pour extraire le plasma. Une fois terminé, le plasma peut être analysé immédiatement pour le taux de créatinine sérique avec l’analyseur chimique de chevet ou stocké à -80 ° C pour une analyse ultérieure.
  5. Surveillez la température en continu à l’aide d’un thermomètre à sonde rectale et ajustez la température du coussin chauffant pour maintenir la température du porcelet entre 101 et 103 °F.

7. Groupe expérimental; ligature et perforation des cæcaux (CLP) 25,28,29

REMARQUE : Pour les porcelets du groupe expérimental, effectuer une CLP pour induire une septicémie polymicrobienne28 et surveiller l’animal pendant 12 heures après la chirurgie afin de laisser suffisamment de temps pour qu’une septicémie sévère s’ensuive. L’enregistrement transdermique du DFG commence à 8 h après la ligature des cæcaux pour permettre 4 h d’enregistrement.

  1. Utilisez une lame chirurgicale pour créer une incision verticale paramédiane gauche de 5 à 6 cm, car le caecum chez les porcs se trouve dans la fosse paralombairegauche 30. Disséquer les couches de la paroi abdominale, en évitant de blesser les vaisseaux épigastriques superficiels.
  2. Une fois la couche péritonéale incisée, utilisez un rétracteur pour améliorer l’accès aux structures intra-abdominales.
  3. Identifiez le côlon spiralé dans le quadrant supérieur gauche de l’abdomen. Tracez le côlon en spirale, caudale et dorsale, pour localiser le caecum. L’iléon est vu rejoignant le côlon spiralé à la base du caecum.
  4. Litérez le caecum juste distal à la jonction iléo-cæcale (Figure 1).
  5. À l’aide d’une aiguille de 18 G, faire sept ponctions dans le caecum et extruder les matières fécales dans la région péritonéale.
  6. Fermez l’abdomen en couches avec une suture en soie 3.0 à l’aide de points de suture simples interrompus ou continus. Une agrafeuse peut également être utilisée pour fermer la couche de peau si disponible.

8. Groupe Sham

  1. Suivez les étapes 7.2-7.4 comme ci-dessus. Après avoir identifié le caecum, replacez-le intact et fermez la paroi abdominale de la même manière.
  2. Surveiller les porcelets dans le groupe simulé pendant 12 heures pour éliminer tout biais de confusion attribué à une exposition prolongée à l’anesthésie.

9. Configuration du dispositif de DFG transdermique

  1. Après 8 h de ligature des selles, préparez-vous à initier la mesure transdermique du DFG.
  2. Utilisez la version 3.0 du logiciel de service MB pour ajuster la fréquence d’échantillonnage sur le périphérique GFR. Brièvement, connectez le dispositif DFG transdermique au logiciel de l’ordinateur à l’aide du connecteur USB. Ouvrez le logiciel, cliquez sur connecter et réglez la synchronisation à 4000 ms. Cliquez sur Écrire pour enregistrer les paramètres.
    NOTE: Cela donne jusqu’à 6 h de temps d’échantillonnage total. Chez les porcs, le DFG transdermique est complété en 4 h. Pour les expériences nécessitant un échantillonnage jusqu’à 12 h, choisissez l’option 8000 ms.
  3. Fixez les patchs adhésifs double face avec une fenêtre transparente à l’appareil. Fixez l’appareil d’un côté, en veillant à ce que la diode électroluminescente recouvre la fenêtre transparente pour permettre la détection du traceur.
  4. Rasez la zone recouvrant la paroi thoracique latérale. Fixez la batterie à l’appareil et collez immédiatement le patch adhésif avec l’appareil en place et assurez-vous qu’il est bien fixé (Figure 2). Étant donné que les porcelets sont profondément anesthésiés, le ruban adhésif peut être inutile pour maintenir l’appareil en place.
    REMARQUE: Le patch adhésif seul suffit à fixer. Cependant, dans les procédures où l’animal serait manipulé, deviendrait actif ou où l’anesthésie pourrait être perturbée, il pourrait être important d’appliquer un ruban. Un pansement pourrait également être une approche alternative31.
  5. Un enregistrement de base de 3 à 5 minutes est requis avant l’administration de FITC-sinistrin.

10. Préparation et injection de FITC-sinistrin

  1. Préparer un mélange de FITC-sinistrin avec une solution saline jusqu’à une concentration finale de 50 mg/mL. La dose administrée au porcelet est de 20 mg/kg. FITC-sinistrin est fourni sous forme de poudre.
    NOTE: La FITC-sinistrin peut également être administrée par un cathéter veineux périphérique inséré dans la veine auriculaire. Il est essentiel d’atteindre un niveau maximal élevé en administrant FITC-sinistrin comme bolus de poussée à travers le cathéter veineux de la veine fémorale.
  2. Fixez la seringue avec le médicament à un côté d’un robinet d’arrêt à trois voies et une chasse d’eau saline de l’autre côté du robinet d’arrêt. Poussez la FITC-sinistrin et suivez immédiatement avec un bolus salin de 5 ml avant de fermer le robinet d’arrêt à trois voies sur la veine du porcelet.

11. Enregistrement transdermique du DFG

  1. Gardez l’appareil attaché au porcelet pendant 4 h. Pendant ce temps, gardez le porcelet sous anesthésie en utilisant des doses intermittentes de α-chloralose à une concentration de 20 mg / kg pour éviter tout artefact de mouvement.
  2. À la fin des 4 h, retirez l’appareil et débranchez immédiatement la batterie.

12. Mesure du DFG

  1. Connectez le dispositif de DFG transdermique à l’ordinateur à l’aide du connecteur USB fourni par le fournisseur.
  2. Ouvrez le logiciel de lecture pour récupérer les données de l’appareil. Enregistrez les données brutes en cliquant sur la séquence : connexion, lecture, renommage et enregistrement. Comme indiqué dans le manuel, traiter et évaluer les données enregistrées dans le logiciel d’analyse.
  3. En bref, ouvrez le logiciel version 3.0 et importez les données. Ajustez les positions de décalage, de début et de fin à l’aide des marqueurs automatisés. Supprimez les artefacts si nécessaire, puis cliquez sur Adapter. Cela donne une lecture qui montre la clairance FITC-sinistrin en minutes (t1/2). Le t1/2 est ensuite utilisé pour calculer le DFGt32,33 comme suit:
    Equation 1
    NOTA : En consultation avec le fabricant, le facteur de conversion utilisé pour les porcs est de 20 (ce qui indique que 20 % du poids corporel est constitué d’espace extracellulaire), comparativement à 21,33 chez le rat (DFGt en mL/min) et à 14 616,8 chez la souris (DFGt en μL/min). En effet, le DFG est mesuré avec précision en fonction du liquide extracellulaire 34,35, qui dépend à son tour du poids corporel36.

13. Euthanasie des porcelets

  1. Prélever 3 mL de sang après 12 h de CLP pour une analyse biochimique plus approfondie.
  2. Euthanasier le porcelet en administrant 0,2 mL/kg de mélange prémélangé de pentobarbital sodique à 20 % et de phénytoïne sodique par voie intraveineuse.
  3. Prélevez le bon rein pour l’étude histopathologique avant d’emmener le porcelet à la morgue.

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Representative Results

Dans cette section, nous présentons pour la première fois les données représentatives de l’utilisation du DFG transdermique chez les porcs nouveau-nés. Nous avons utilisé un modèle de ligature et de ponction des cæcaux dont il a déjà été démontré qu’il diminuait la fonction rénale28. En conséquence, nous avons émis l’hypothèse que chez nos porcs CLP, il devrait y avoir une baisse aiguë du DFG correspondant à l’IRA, ce qui devrait être détecté sur le dispositif de DFG transdermique comme un temps de clairance accru (t1/2), validant ainsi son utilisation chez les porcs. Sept porcelets mâles ont été inclus, trois porcelets fictifs et quatre septicémies. Les deux groupes avaient des poids comparables (figure 3A). Comme prévu, la septicémie de28 à 12 heures a augmenté les taux sériques de protéine C-réactive (CRP), un marqueur de bactériémie et de septicémie (Figure 3B). Des courbes de clairance FITC-sinistrin représentatives chez les porcelets fictifs par rapport aux porcelets septiques sont montrées (Figure 4 A, B), l’IRA étant représentée en superposant les courbes simulées et septicémiques (Figure 4C). L’IRA est représentée par une surface accrue sous la courbe pour les porcs CLP. Cela peut être vu de manière visible lorsque la courbe factice est posée sur la courbe CLP. La demi-vie moyenne de FITC-sinistrin dans les groupes simulé et septicémie était respectivement de 114 et 537 minutes (Figure 5A). Le DFG moyen dans le groupe simulé était de 5,1 mL/min/100 g du poids corporel, tandis que dans le groupe septicémie, il était de 1,06 mL/min/100 g du poids corporel (figure 5B). Un autre animal a été exclu lorsque la sonde a été déplacée, ce qui a perturbé la courbe de dégagement et le temps. Alors que la créatinine sérique sur 12 h (un biomarqueur de l’insuffisance rénale aiguë) n’a pas changé dans le groupe simulé, elle a augmenté de ~ 0,6 à 1,08 mg / dL chez les porcs septiques (Figure 6).

Figure 1
Figure 1 : Chirurgie de ligature du caecum. (A) Caecum identifié et amené à l’extérieur. (B) Caecum ligaturé à la base avec une cravate en soie avant perforation avec une aiguille. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Fixation du dispositif transdermique à la peau. (A) Peau rasée avant la fixation du patch adhésif. (B) Dispositif transdermique de DFG fixé au patch adhésif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résultats représentatifs. (A) Poids des porcelets utilisés dans cette étude et (B) Taux sériques de protéine C-réactive (CRP) chez les porcelets mâles fictifs et septiques ventilés mécaniquement (test t non apparié). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Courbes de clairance FITC-sinistrin représentatives chez les porcelets mâles fictifs et septiques ventilés mécaniquement. (A) 12 h simulé, (B) 12 h septicémie. Les porcs septiques présentent une insuffisance rénale démontrée par une augmentation de l’aire sous la courbe. Les points de données noirs représentent les données brutes, les lignes bleues l’ajustement à trois compartiments, les lignes vertes les intervalles de confiance à 95 % et la ligne rouge les données filtrées. (C) Superposition de courbes représentatives pour refléter le degré de divergence par rapport à la ligne de base chez les porcs septiques. La courbe de septicémie (rouge) a montré une clairance minimale de la FITC-sinistrine, indiquant une IRA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résultats représentatifs. (A) demi-vie FITC-sinistrine et (B) diagrammes DFG chez les porcelets mâles fictifs et septiques ventilés mécaniquement (test t non apparié). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Créatinine sérique chez les porcelets mâles fictifs et septiques ventilés mécaniquement. (test ANOVA unidirectionnel). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Cet article décrit les étapes pratiques pour déterminer la fonction rénale chez les porcs à l’aide des moniteurs de DFG transdermique miniaturisés et de la FITC-sinistrin dans un modèle de porc néonatal anesthésié et ventilé mécaniquement. Des articles antérieurs ont établi des protocoles expérimentaux de DFG transdermique chez les rongeurs11,12,14, mais aucun protocole n’existe chez les porcs.

Récemment, il y a eu une volonté d’explorer des modèles animaux alternatifs pour résoudre des maladies intraitables et alléger le fardeau des maladies rénales chez l’homme. Malheureusement, bon nombre de ces approches ont eu des limitations translationnelles en raison de différences de taille, anatomiques et physiologiques. L’anatomie rénale et la physiopathologie des rongeurs présentent des différences majeures par rapport aux humains37. Étant donné que les systèmes humain et porcin partagent des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles similaires, le modèle porcin peut être un modèle physiopathologique plus réaliste des maladies humaines38,39. Les porcs sont maintenant largement utilisés pour délimiter la physiopathologie et dans le développement de médicaments. Avec la publication du génome porcin, parallèlement à la production transgénique réussie de modèles spécifiques à une maladie, le modèle porcin devrait jouer un rôle plus critique dans la recherche translationnelle40,41.

La clairance de l’inuline reste le moyen le plus accepté de détermination du DFG, mais elle n’est pas pratique dans les grands modèles animaux en raison de la nécessité d’une perfusion continue d’inuline, d’un cathétérisme de la vessie et de sa nature longue et encombrante42. La créatinine sérique et l’azote uréique sanguin (BUN) sont couramment utilisés pour mesurer la fonction rénale dans les études précliniques, mais comme la créatinine est sécrétée dans les tubules et que l’urée est de plus en plus réabsorbée dans la déshydratation, ces marqueurs se sont révélés médiocres dans l’estimation de la fonction rénale 5,43. De manière cruciale, la sécrétion tubulaire de créatinine s’est avérée provoquer une surestimation du DFG lorsqu’elle est utilisée comme marqueur de la fonction rénale chez les porcs6. En outre, en raison de leur habitus corporel, une augmentation de la créatinine est plus susceptible d’être observée dans les grands modèles animaux par rapport aux rongeurs. Une étude chez la souris a révélé une augmentation de 1,5 fois de la créatinine sérique 6 h après la ligaturecæcale 44. Auparavant, nous avons montré une augmentation de la créatinine chez les porcs nouveau-nés 6 h après la CLP28. Dans cette étude, nous avons gardé les animaux pendant une plus longue durée, ~ 12 heures après la ligature des cæcaux pour laisser suffisamment de temps pour une IRA significative et une augmentation ultérieure de la créatinine. Comme dans notre étude précédente, nous avons confirmé l’induction de la septicémie par une augmentation des taux sériques de CRP, un marqueur de l’inflammation et de la septicémie. Dans cette étude, et comme le montrent les articles précédents, la gravité de la septicémie après CLP dépend de la durée de la ligature et du nombre de ponctions44.

Un protocole de mesure du DFG chez les porcs utilisant l’iohexol a déjà été validé chez les porcs37, mais en revanche, la procédure de DFG transdermique constitue une nette amélioration. Il est moins encombrant, évite les prélèvements répétés de sang ou d’urine et offre une fenêtre en temps réel sur la fonction rénale et la possibilité de mesures répétées en série chez le même animal45. Cette étude fournit des lignes directrices pratiques pour la détermination du DFG transdermique chez les porcs.

Comme établi par d’autres groupes, les étapes les plus critiques sont la fixation correcte du dispositif sur l’animal et l’injection en bolus de FITC-sinistrin. L’appareil de mesure doit être bien fixé à la surface de la peau pour empêcher les artefacts de mouvement sur la trace. Parce que les porcs sont moins poilus que les rongeurs, l’utilisation d’une crème dépilatoire n’est pas nécessaire. Un rasage propre avec une tondeuse pourrait être tout ce qui est nécessaire. Cela minimise l’augmentation associée à l’épilation de la demi-vie de FITC-sinistrin, dont le mécanisme est inconnu12. Pour une fixation correcte, un patch adhésif double face et du ruban adhésif sont nécessaires pour maintenir l’appareil en place. Les emplacements optimaux de placement de l’appareil sont la paroi thoracique latérale et la région abdominale ventrale. Ces zones étaient corrélées avec moins d’artefacts de mouvement.

Lors de l’injection de la FITC-sinistrin, la dose correcte et entière doit être injectée en un seul mouvement de fluide dans la veine. Lorsque l’injection est interrompue et redémarrée, elle crée plusieurs « mini-pics » sur la courbe de dégagement. La veine de la queue est couramment utilisée pour les petits rongeurs, mais la veine auriculaire de l’oreille offre une voie plus accessible et proéminente chez les porcs. Une canule peut être placée dans la veine de l’oreille pour de multiples mesures chez des porcs conscients. Une distinction importante à noter dans le temps d’échantillonnage est que, contrairement aux rongeurs (~1-2 h), les porcs durent plus longtemps (~4 h), ce qui se rapproche du temps qu’il faut pour que FITC-sinistrin soit éliminé de la circulation. À notre connaissance, il s’agit du premier article détaillant le DFG transdermique via la clairance FITC-sinistrine chez les porcs. Donc, aucune citation n’existe pour référence. Le temps de mesure utilisé ~4h a été obtenu via des consultations avec le fabricant. Ce temps d’échantillonnage est comparable à une étude antérieure validant le DFG transdermique chez d’autres mammifères non rongeurs14.

Lors de l’évaluation du DFG transdermique chez les porcelets, quelques facteurs doivent être pris en compte. On sait que les modèles à un compartiment surestiment considérablement le DFG46; Nous utilisons le modèle cinétique à trois compartiments qui est plus précis, fournissant une communication à trois voies du marqueur injecté par voie intraveineuse entre le plasma, l’espace extracellulaire et les composants plus profonds46. En outre, ce sont des porcelets ventilés mécaniquement sous anesthésie très profonde pendant ~12 h. Étant donné que l’anesthésie influence la fonction rénale47,48, il pourrait être utile d’en tenir compte dans les procédures qui nécessitent une longue sédation ou lorsque les manœuvres expérimentales nécessitent une anesthésie supplémentaire parallèlement à la surveillance du DFG. Enfin, et c’est peut-être le plus important, les porcelets néonatals ont un système rénal encore en développement avec des néphrons immatures qui fonctionnent à une fraction de l’animal adulte49. Par conséquent, ils démontrent un DFG et une fonction rénale inférieurs50.

Comme indiqué précédemment, le DFG transdermique chez les porcs n’est pas une mesure absolue des concentrations de sinistrines dans le sang. Ce n’est qu’une estimation de la désintégration de la fluorescence au fil du temps12. L’utilisation d’un facteur de conversion tente d’atténuer ce problème en exprimant le DFG en mL/min. Cependant, comme le facteur de conversion dépend de l’espace extracellulaire, qui à son tour dépend du poids corporel34,35,36, il est possible que de grandes variations existent si le poids n’est pas contrôlé ou si l’espace extracellulaire n’est pas défini avec précision 51,52.

De plus, la pigmentation de la peau semble affecter la clairance transdermique FITC-sinistrin12,31. Dans nos études, nous avons constaté que les porcs pigmentés présentaient une diminution du signal. Dans un cas, nous n’avons pas détecté de signal chez un porc de couleur intensément foncée. Cependant, comme le signal de fond tend à être réduit chez les animaux pigmentés12, nous avons constaté que les valeurs du DFG étaient largement comparables. Une solution à cela est d’opter pour des zones de couleur plus claire de la peau lors de la mise en place de l’appareil. Étant donné que ces porcs ont été largement utilisés dans un modèle chirurgical de la maladie, avec plusieurs formes d’éclairage et de sources de chaleur impliquées, il faut tenir compte des artefacts de mouvement potentiels sur les traces du DFG via la lumière réfléchie absorbée par la peau environnante12. Une solution à ce problème pourrait être de minimiser la lumière infrarouge pendant l’enregistrement ou de recouvrir les appareils de papier d’aluminium.

En résumé, cette étude offre une méthode simple et fiable pour mesurer le débit de filtration glomérulaire chez les porcs nouveau-nés en utilisant la mesure transdermique de la clairance FITC-sinistrine. De plus, nos données confirment l’utilité du système dans l’évaluation de la fonction rénale dans les contextes de lésions rénales aiguës.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par les subventions R01 DK120595 et R01 DK127625 des National Institutes of Health accordées au Dr Adebiyi. Le contenu de cet article relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. Merci au Dr. Daniel Schock-Kusch, directeur de site chez MediBeacon GmbH, pour ses conseils.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha - Chloralose Sigma-Aldrich C0128-25G Used for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0 Surgical Specialties SP117 Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8C Fischer Scientific 75-008-821 Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed Progressive Medical International 1109021995 Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 g MediBeacon Inc. FTCF S001 Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer Instrumentation Laboratory 5700 For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 in Adroit Medical Systems V029 Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy Pump Adroit Medical Systems HTP Allows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst One IDEXX Laboratories 89-92525-00 Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr Millar SPR-524 Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulator True Care TCRTCBINF033G Used to connect IV fluid bag to vein catheter
Ketamine Covetrus 68317 Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0 MediBeacon Inc. N/A Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGVR33RS Syringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant Ventilator Sechrist Millennium 20409 Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) Covetrus 72934 Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bag Baxter 2B2323Q Maintanence fluid infusion
Sterile Gloves Henry Schein 104-5920 Used by operator during surgery
Sterile Gown Halyard Health 95021 Used by operator during surgery
Steril Towel Medline 42131704 Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needle Ethicon NC1842168 Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR Monitor MediBeacon Inc. TDM004 Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patch MediBeacon Inc. PTC-SM001 Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds Fisher Scientific NC9303017 To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5 Micro medical tubing BB31695 For femoral vein cannulation
Xylazine Covetrus 61035 Used for induction of anesthesia

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Médecine Numéro 187
Mesure transdermique du débit de filtration glomérulaire chez les porcelets ventilés mécaniquement
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Fanous, M. S., Afolabi, J. M.,… More

Fanous, M. S., Afolabi, J. M., Michael, O. S., Falayi, O. O., Iwhiwhu, S. A., Adebiyi, A. Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets. J. Vis. Exp. (187), e64413, doi:10.3791/64413 (2022).

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