Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Transdermal måling av glomerulær filtreringshastighet i mekanisk ventilerte smågriser

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64413
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, College of Medicine University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

Glomerulær filtreringshastighet (GFR) er den ideelle markøren for å vurdere nyrefunksjonen. Imidlertid er standard målemetode ved bruk av inulininjeksjon med seriell blod- og urinanalyse upraktisk. Denne artikkelen beskriver en praktisk metode for å måle GFR transdermalt hos gris.

Abstract

Transdermal måling av glomerulær filtreringshastighet (GFR) har blitt brukt til å evaluere nyrefunksjonen hos bevisste dyr. Denne teknikken er godt etablert hos gnagere for å studere akutt nyreskade og kronisk nyresykdom. GFR-måling ved bruk av det transdermale systemet er imidlertid ikke validert hos griser, en art med et lignende nyresystem som mennesker. Vi undersøkte derfor effekten av sepsis på transdermal GFR hos anesteserte og mekanisk ventilerte nyfødte griser. Polymikrobiell sepsis ble indusert ved cekal ligering og punktering (CLP). Det transdermale GFR-målesystemet bestående av en miniatyrisert fluorescenssensor ble festet til grisens barberte hud for å bestemme clearance av fluorescein-isotiocyanat (FITC) konjugert sinistrin, en intravenøst injisert GFR-sporstoff. Våre resultater viser at ved 12 timer etter CLP økte serumkreatinin med en reduksjon i GFR. Denne studien viser for første gang nytten av den transdermale GFR-tilnærmingen for å bestemme nyrefunksjonen hos mekanisk ventilerte, nyfødte griser.

Introduction

En praktisk og kvantitativ evaluering av nyrefunksjonen er måling av glomerulær filtrasjonshastighet (GFR), som forteller hvor godt nyrene filtrerer blod basert på clearanceprinsippet1. En tidligere metode for måling av GFR innebærer intravenøs injeksjon av eksogene forbindelser som inulin eller sinistrin, og utfører serielle målinger av plasma / urinnivåer for å oppdage deres clearance 2,3. Denne metoden er tungvint, og krever seriell innsamling av plasma- og urinprøver4. Et alternativ er måling av endogene metabolske sluttprodukter som kreatinin. Dette er imidlertid tidkrevende og til tider unøyaktig, da det ikke bare filtreres av glomerulus, men også utskilles av tubuli 5,6. Videre påvirkes kreatininnivået av kjønn, alder, kosthold og muskelmasse 7,8,9.

Et mer presist, minimalt invasivt og mye brukt mål på GFR er bruken av transdermale GFR-skjermer, som måler sanntids GFR hos dyr 4,10. Sinistrin, en høyoppløselig og fritt filtrert eksogen nyremarkør, er merket med fluorescein-isotiocyanat (FITC). Denne konjugerte forbindelsen injiseres intravenøst, og nyrefunksjonen i sanntid kan vurderes uten å samle blod- og urinprøver11. Bruken av transdermal GFR-måling er validert hos gnagere 12, hunder13 og katter14, men ikke hos svin.

Svin arter deler flere anatomiske og fysiologiske egenskaper med mennesker, noe som gjør dem ideelle dyr for å studere ulike menneskelige sykdommer15. Bruken av griser i translasjonell biomedisinsk forskning har blitt stadig mer populær og foretrukket over gnagermodeller fordi den etterligner menneskelig fysiologi og patofysiologi16. Neonatale griser er av interesse for å forstå mekanismene for sykdommer som er unike for pediatriske pasienter17. Videre setter den nylige fremgangen i gris til menneskelig organtransplantasjon en trang til å utvide diagnostiske verktøy for prekliniske og kliniske studier 18,19,20,21. Dette papiret gir for første gang en veiledning for bruk av transdermal enhet for måling av GFR hos nyfødte griser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrene er skrevet i henhold til nasjonale standarder for pleie og bruk av laboratoriedyr og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Tennessee Health Science Center (UTHSC).

MERK: Grisene i forsøksgruppen blir utsatt for cekalligering og punktering, mens humbuggruppen bare gjennomgår åpning av magen uten cekalligering eller punktering. Grisene i begge gruppene holdes under anestesi i 12 timer etter prosedyren for å gi nok tid til sepsis og akutt nyreskade (AKI) for å følge i eksperimentgruppen. Transdermal GFR-måling vil følge ved 8 timer etter prosedyren i totalt 12 timer.

1. Piglet forsyning og bolig

  1. Identifiser en lokal hog gård som kan gi neonatal gris i alderen 3-5 dager. Planlegg leveransen tidlig i uken for å fullføre forsøket før noen smågriser er eldre enn 7 dager.
    MERK: Leverandøren ga tre til fem smågriser på mandager for dette eksperimentet; innen fredag ville grisungene ha gjennomgått eksperimentet. Å bruke samme kjønn og nær samme alder er viktig for å unngå forstyrrende faktorer.
  2. Ved grisens ankomst, sørg for at de har en individuell identifikasjon (f.eks. et øremerke og et register som inkluderer vekt og alder).
  3. Hus grisene i en laboratoriedyrpleieenhet (LACU) under omsorg av en lisensiert veterinær. Dyrene er plassert som en gruppe i en romslig penn med et solid betonggulv som lett vaskes med vann for å opprettholde gode sanitærforhold.
  4. Legg til et møbel som en tung ball for å tillate miljøberikelse og stimulering.
  5. Sørg for at LACU gir optimale miljøforhold, inkludert følgende nøkkelelementer: sanitæranlegg, ernæring, temperaturkontroll, ventilasjon og dag-natt-syklus ved å kontrollere belysningen.
  6. Få veterinæren til å sjekke grisen daglig, inkludert vektmåling, for å informere etterforskeren om noen gris virker syk, noe som kan nødvendiggjøre utelukkelse fra forsøket.
  7. La grisene stå i minst 1 dag for å akklimatisere seg til miljøet, noe som bidrar til å minimere stresset.

2. Preoperativ forberedelse

  1. Forbered operasjonsstasjonen før du starter eksperimentet. Dette inkluderer en varmepute, katetre, en ventilator, et endotrakealrør, heparinisert saltvann og en pose med ringerlaktatvæske.
    MERK: Grisunger har dårlig termoregulatorisk kapasitans og er utsatt for hypotermi som endrer hemodynamikk22,23. Derfor er det viktig å gi nok tid til at varmeputen varmes opp.
  2. Tilbered 10 mg/ml α-kloralose ved å blande det med saltvann ved 60 °C til blandingen er klar. Ikke overopphet løsningen for å unngå krystallisering av medisinen ved avkjøling. Filter med sprøytefilter (størrelse 0,22 μm) før administrering til grisene.
  3. Tegn opp bedøvelsesmedisin basert på dyrevekt-Ketamin: 20 mg / kg og Xylazin: 2,2 mg / kg. Bruk α -kloralose (5 ml / kg) for å opprettholde anestesi.
    MERK: α -kloralose brukes på grunn av enkel i.v. administrering sammenlignet med inhalert
    anestetika, da sistnevnte krever en bedøvelsesmaskin og et passende rensesystem som skal leveres via et endotrakealrør.

3. Anestesi

  1. Utfør induksjon av anestesi i grispennen, et miljø kjent for gris, for å unngå unødig stress.
  2. Plukk grisen forsiktig i bakbena og administrer ketamin: 20 mg/kg og xylazin: 2,2 mg/kg i bakbenet ved semimembranosus/semitendinosusmuskelen ved bruk av en 23 G 3/4 nål.
  3. Tillat noen minutter for medisinene å tre i kraft. Sjekk for tilstrekkelig anestesi nivå ved å sørge for at dyret er avslappet nok til å være immobile, med tap av palpebral refleks og kjeve tone for å tillate enkel og sikker transport til kirurgisk stasjon. Vurder palpebralrefleksen ved å berøre øyets indre hjørne; Fravær av blinking indikerer tilstrekkelig anestesi.

4. Trakeostomi

MERK: Dette eksperimentet er ikke-overlevelse, så en trakeotomi utføres for å etablere en luftvei for mekanisk ventilasjon. Trakeostomi er en rask og enkel prosedyre, i motsetning til endotrakeal intubasjon, som er utfordrende hos grisunger gitt hodet og øvre luftveis anatomi24,25. I tillegg rapporteres laryngospasme ofte under intubasjon, noe som resulterer i en lengre periode med hypoksi og hyperkarbi som kan kompromittere resultatene26.

  1. Plasser grisen i dorsal recumbency. Identifiser cricothyroid brusk ved palpering fremtredende av skjoldbruskkjertelen brusk som føles fast. Steriliser området ved hjelp av povidon-jod og 70% etanol før du påfører en steril drapering.
  2. Ved hjelp av et kirurgisk blad, gjør et 2-3 cm ventralt midtlinjeinnsnitt dårligere enn den kaudale enden av skjoldbruskkjertelen.
  3. Ved hjelp av en buet mygghemostat dissekerer du sløvt det overliggende subkutane vevet og musklene (sternohyoideus og kutan coli) til cricothyroidmembranen og de første trakealringene visualiseres. Når du dissekerer, vær forsiktig for å unngå å skade blodårene.
  4. Få en klar oversikt over cricothyroid membran og trakealringer24, bruk deretter et par lange mixter rettvinklede tang for å heve strukturene.
    1. Med en liten saks, lag et lite kutt ved cricothyroidmembranen eller den første trakealringen. Forleng kuttet horisontalt til ~ 0,5 cm for å passere et 3,0 mm endotrakealt rør.
    2. Sett røret til 5 cm-merket. Sørg for bilateral brystutvidelse og pustelyder før du sikrer røret.
  5. Pass navlestreng rundt luftrøret for å sikre den på plass. Ytterligere tape brukes til å feste røret til bunnen av kjeven.
  6. Slå på ventilatoren, koble endotrakealrøret, og rull de spesifikke knottene (f.eks. SIMV-knotter, PEEP-knapper osv.) for å velge følgende grunnlinjeinnstillinger. Trykkreguleringsmodus: synkronisert intermitterende mekanisk ventilasjon (SIMV); topp inspiratorisk trykk (PIP) - 15; positivt endeekspiratorisk trykk (PEEP) - 5; Sats- 20; I-tid - 0,6. Etter den første blodgassanalysen justerer du ventilatorinnstillingene i henhold til blodgassresultatene, med mål om å opprettholde tilstrekkelig oksygenering og ventilasjon.

5. Femoral fartøy kanylering

  1. Etablere luftveier og ventilasjon, før du bytter oppmerksomhet til lårbenene for venøs tilgang og invasiv blodtrykksovervåking. Lårarterien identifiseres ved å kjenne en puls i sporet mellom sartorius- og gracilis-musklene, og venen kan finnes bare medialt til arterien.
  2. Mens grisen ligger i en dorsal liggende stilling, steriliser lyskeområdet ved hjelp av povidon-jod og etanol, og bruk en passende størrelse drapering.
  3. Bruk et kirurgisk blad for å skape et 3-4 cm langsgående snitt, som starter kranialt ved inngangskrøllen og strekker seg distalt langs lårkanalen.
  4. Påfør stump og skarp disseksjon, ved hjelp av myggbuede tang og saks, henholdsvis for å dissekere ned til nivået av den femorale nevrovaskulære bunten. Bunten kan bli funnet dypt i kroppen av gracillis muskel27. Disseker lårarterien og venen i løpet av 2-3 cm for å tillate kanylering. Ligate små sidegrener om nødvendig.
  5. Påfør et 3,0 silkebånd i både arterien og venens proksimale og distale ender for å bruke trekkraft. Bind den distale silke suturen på både venen og arterien, ligating karene.
  6. Begynn med lårbenet, oppretthold distal og proksimal trekkraft på silkebåndene og bruk deretter et par mikrosaks for å skape en venotomi.
  7. Deretter bruker du et veneplukkkateter for å åpne karet mens du setter inn et forhåndsmålt polyuretankateter med en indre diameter x ytre diameter på 0,86 mm x 1,32 mm. Når den er satt inn, bind den proksimale 3,0 silke suturen for å fikse kateteret. Skyll kateteret med 3 ml heparinisert saltoppløsning (1 U/ml). Denne løsningen kan gjøres ved å tilsette 0,5 ml heparin til 50 ml normal saltvann.
  8. Sett inn et invasivt blodtrykkskateter ved hjelp av samme tilnærming ovenfor for å skape en arteriotomi og passere kateteret.
    MERK: Opprettholde distal og proksimal trekkraft er viktig for å minimere blodtap når du får tilgang til arterien.
  9. Når katetrene er sikret, dekk stedet med saltvann-gjennomvåt gasbind, og om nødvendig kan huden sutureres ved hjelp av en 3,0 silke sutur for å forhindre infeksjon.

6. Vedlikehold av anestesi, væske og blodgass

  1. Overvåk dybden av anestesi gjennom hele forsøket, ved hjelp av kjevetone og palpebral refleks, og administrer α-kloralose, intravenøst, etter behov for å opprettholde dyret under dyp anestesi. Bruk en startdose på 50 mg/kg og 20 mg/kg for ytterligere boluser.
  2. Tilfør ringlaktat med en hastighet på 4 ml / kg / t gjennom hele forsøket som vedlikeholdsvæske. For eksempel, hvis grisevekten er 3 kg, er væskeinfusjonshastigheten 12 ml / t.
  3. For sengegassanalyse trekker du en arteriell blodprøve i en heparinisert blodgasssprøyte og presenterer prøven til analysatormaskinen. Velg alternativet arteriell blodgass, og vent til ~2-3 s for analysatoren skal presentere blodtrekknålen.
    1. Stikk kanylen forsiktig inn i enden av sprøyten som inneholder blodprøven. Vent til analysatoren aspirerer den nødvendige prøven og trekk ut sprøyten. La maskinen analysere blodgassen og presentere resultatene.
    2. Basert på resultatene, juster ventilatoren for å opprettholde pH mellom 7,35--7,45, partialtrykk av karbondioksid (PCO2) mellom 35-45 mmHg og partialtrykk av oksygen (PaO2) mellom 80-150 mmHg. Innstillingene varierer basert på ventilatortype, men innebærer i stor grad å øke eller redusere respirasjonsfrekvensen ved hjelp av passende knotter for å kompensere for hypoksi og / eller hyperkapnia.
  4. Trekk 3 ml blod inn i et lysegrønt rør (litiumheparin). Sentrifuge prøven ved 2000 xg i 15 minutter, opprettholdt ved 4 °C for å ekstrahere plasma. Når plasmaet er fullført, kan det analyseres umiddelbart for serumkreatininnivå med kjemianalysatoren ved sengen eller lagres ved -80 °C for senere analyse.
  5. Overvåk temperaturen kontinuerlig ved hjelp av et rektalt sondetermometer og juster temperaturen på varmeputen for å opprettholde grisetemperaturen mellom 101 og 103 ° F.

7. Eksperimentgruppe; cekalligering og perforering (CLP) 25,28,29

MERK: For grisene i forsøksgruppen, utfør CLP for å indusere polymikrobiell sepsis28 og overvåk dyret i 12 timer etter operasjonen for å gi nok tid til alvorlig sepsis å følge. Transdermal GFR-opptak starter ved 8 timer etter cekal ligering for å tillate 4 timers opptak.

  1. Bruk et kirurgisk blad for å lage et 5-6 cm venstre paramedian vertikalt snitt, da cecum hos griser ligger i venstre paralumbar fossa30. Disseker ned bukvegglagene, unngå skade på overfladiske epigastriske kar.
  2. Når bukhinnelaget er innskåret, bruk en retractor for å forbedre tilgangen til intrabdominale strukturer.
  3. Identifiser spiral kolon i øvre venstre kvadrant av magen. Spor spiral kolon, kaudalt og dorsalt, for å finne cecum. Ileum ses å bli med i spiralkolonet ved foten av cecum.
  4. Ligate cecum bare distalt til ileocecal krysset (figur 1).
  5. Ved hjelp av en 18 G nål, gjør syv punkteringer i cecum og ekstrudere avføring i bukhinnen.
  6. Lukk magen i lag med en 3,0 silke sutur ved hjelp av enten enkle avbrutte eller kontinuerlige masker. En stiftemaskin kan også brukes til å lukke hudlaget hvis tilgjengelig.

8. Sham-gruppen

  1. Følg trinnene 7.2-7.4 som ovenfor. Etter å ha identifisert cecum, legg den tilbake uberørt og lukk bukveggen på samme måte.
  2. Overvåk smågrisene i humbuggruppen i 12 timer for å eliminere forvirrende skjevheter som tilskrives langvarig eksponering for anestesi.

9. Transdermalt GFR-enhetsoppsett

  1. Etter 8 timers cecal ligering, gjør deg klar til å starte transdermal måling av GFR.
  2. Bruk MB-tjenesteprogramvareversjon 3.0 til å justere samplingsfrekvensen på GFR-enheten. Koble den transdermale GFR-enheten kort til dataprogramvaren ved hjelp av USB-kontakten. Åpne programvaren, klikk koble til, og juster timingen til 4000 ms. Klikk skriv for å lagre innstillingene.
    MERK: Dette gir opptil 6 timer total prøvetakingstid. Hos grisene er transdermal GFR fullført på 4 timer. For eksperimenter som krever prøvetaking opptil 12 timer, velg alternativet 8000 ms.
  3. Fest de tosidige selvklebende patchene med et klart vindu til enheten. Fest enheten til den ene siden, og sørg for at den lysemitterende dioden ligger over det klare vinduet for å tillate spordeteksjon.
  4. Barber området som ligger over den laterale thoraxveggen. Fest batteriet til enheten og fest umiddelbart plasteret med enheten på plass og sørg for at det er godt sikret (figur 2). Siden grisene er dypt bedøvet, kan tape være unødvendig å holde enheten på plass.
    MERK: Selvklebende plaster alene er nok til å sikre. Men i prosedyrer der dyret vil bli manipulert, bli aktiv, eller hvor anestesi kan bli forstyrret, kan det være viktig å bruke et bånd. En bandasje kan også være en alternativ tilnærming31.
  5. En baseline registrering på 3-5 min er nødvendig før administrering av FITC-sinistrin.

10. FITC-sinistrin forberedelse og injeksjon

  1. Forbered en blanding av FITC-sinistrin med saltoppløsning til en endelig konsentrasjon på 50 mg / ml. Dosen som administreres til grisen er 20 mg / kg. FITC-sinistrin leveres i pulverform.
    MERK: FITC-sinistrin kan også administreres gjennom et perifert venekateter satt inn i ørevenen. Det er viktig å oppnå et høyt toppnivå ved å administrere FITC-sinistrin som en push-bolus gjennom lårvenekateteret.
  2. Fest sprøyten med medisiner til den ene siden av en treveis stopphane og en saltvannsspyling på den andre siden av stopphanen. Skyv FITC-sinistrin og følg umiddelbart med en 5 ml saltvannsbolus før du lukker treveis stoppkranen til grisevenen.

11. Transdermal GFR-opptak

  1. Hold enheten festet til grisen i 4 timer. I løpet av denne tiden, hold grisen under anestesi ved hjelp av intermitterende doser av α-kloralose i en konsentrasjon på 20 mg / kg for å unngå bevegelsesartefakt.
  2. På slutten av 4 timer, fjern enheten og koble fra batteriet umiddelbart.

12. GFR-måling

  1. Koble den transdermale GFR-enheten til datamaskinen ved hjelp av USB-kontakten levert av leverandøren.
  2. Åpne leseprogramvaren for å hente data fra enheten. Lagre rådataene ved å klikke på sekvensen: koble til, les, gi nytt navn og lagre. Som beskrevet i håndboken, behandle og evaluere de lagrede dataene i analyseprogramvaren.
  3. Kort sagt, åpne programvaren ver. 3.0 og importer dataene. Juster forskyvnings-, start- og sluttposisjonene ved hjelp av de automatiserte markørene. Fjern artefakter om nødvendig, og klikk tilpass. Dette gir en avlesning som viser FITC-sinistrin klaring i løpet av minutter (t1/2). T1/2 brukes deretter til å beregne tGFR32,33 som nedenfor:
    Equation 1
    MERK: I samråd med produsenten er konverteringsfaktoren som brukes til griser 20 (noe som indikerer at 20% av kroppsvekten er ekstracellulært rom), i motsetning til 21,33 hos rotter (tGFR i ml / min) og 14,616,8 hos mus (tGFR i μL / min). Dette skyldes at GFR måles nøyaktig som en funksjon av ekstracellulær væske34,35, som igjen er avhengig av kroppsvekt 36.

13. Piglet eutanasi

  1. Samle 3 ml blod etter 12 timer CLP for videre biokjemisk analyse.
  2. Avliv smågrisen ved å administrere 0,2 ml / kg ferdigblandet blanding av 20% natriumpentobarbital og fenytoinnatrium intravenøst.
  3. Høst riktig nyre for histopatologisk studie før du tar grisen til likhuset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette avsnittet presenterer vi for første gang representative data fra bruk av transdermal GFR hos nyfødte griser. Vi brukte en cecal ligation og punktering modell som tidligere har vist seg å redusere nyrefunksjonen28. Følgelig antok vi at hos våre CLP-griser skulle det være et akutt fall i GFR som tilsvarer AKI, og dette bør oppdages på det transdermale GFR-apparatet som økt clearancetid (t1/2), og dermed validere bruken hos griser. Syv hanngrisunger ble inkludert, tre humbug og fire sepsis. De to gruppene hadde sammenliknbare vekter (figur 3A). Som forventet28 økte 12 timers sepsis serumnivåer av C-reaktivt protein (CRP), en bakteriemi og sepsismarkør (figur 3B). Representative FITC-sinistrin clearancekurver i humbug vs septikgris er vist (figur 4 A,B), med AKI vist ved overlegging av humbug- og sepsiskurvene (figur 4C). AKI er vist med et økt areal under kurven for CLP-grisene. Dette kan sees synlig når humbugkurven legges på CLP-kurven. Gjennomsnittlig halveringstid for FITC-sinistrin i gruppene med humbug og sepsis var henholdsvis 114 og 537 minutter (figur 5A). Gjennomsnittlig GFR i humbuggruppen var 5,1 ml/min/100 g kroppsvekt, mens den i sepsisgruppen var 1,06 ml/min/100 g av kroppsvekten (figur 5B). Ytterligere et dyr ble ekskludert da sonden ble forskjøvet, noe som forstyrret clearancekurven og tiden. Mens 12 timers serumkreatinin (en biomarkør for akutt nyreskade) ikke endret seg i humbuggruppen, ble den økt fra ~ 0,6 til 1,08 mg/dl hos septikgrisene (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Cecum ligation kirurgi. (A) Cecum identifisert og brakt til utsiden. (B) Cecum ligert i bunnen med et silkebånd før det punkteres med en nål. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Festing av transdermal enhet til huden. (A) Hud barbert før klebemiddelet festes. (B) Transdermal GFR-enhet festet til plasteret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representative resultater. (A ) Vekt av grisene som ble brukt i denne studien og (B) serum C-reaktivt protein (CRP) nivåer i mekanisk ventilert humbug og septiske hanngris ( uparret t-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative FITC-sinistrin clearance kurver i mekanisk ventilert humbug og septisk hanngris. (A ) 12 timer humbug, (B) 12 timer sepsis. Septisk svin med nedsatt nyrefunksjon som vist ved økt areal under kurven. Svarte datapunkter representerer rådata, blå linjer som passer i tre deler, grønne linjer med 95 % konfidensintervaller og rød linje i de filtrerte dataene. (C) Overlegg av representative kurver for å gjenspeile graden av divergens fra baseline hos septiksvin. Sepsiskurven (rød) viste minimal clearance av FITC-sinistrin, noe som indikerer AKI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater. (A ) FITC-sinistrin halveringstid og ( B) GFR plott i mekanisk ventilert humbug og septisk hanngris (uparret t-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Serumkreatinin hos mekanisk ventilert humbug og septiske hanngris. (Enveis ANOVA-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papiret beskriver praktiske trinn for å bestemme nyrefunksjonen hos griser ved hjelp av de miniatyriserte transdermale GFR-skjermene og FITC-sinistrin i en mekanisk ventilert, bedøvet neonatal grismodell. Tidligere papirer har etablert eksperimentelle transdermale GFR-protokoller hos gnagere 11,12,14, men det finnes ingen protokoller hos griser.

Nylig har det vært en stasjon for å utforske alternative dyremodeller for å løse vanskelige sykdommer og lette byrden av nyresykdom hos mennesker. Dessverre har mange av disse tilnærmingene hatt translasjonelle begrensninger på grunn av størrelse, anatomiske og fysiologiske forskjeller. Gnageres nyreanatomi og patofysiologi har store forskjeller sammenlignet med mennesker37. Siden menneske- og grisesystemene deler lignende anatomiske og funksjonelle egenskaper, kan svinemodellen være en mer realistisk patofysiologisk modell av menneskelige sykdommer38,39. Griser er nå mye brukt til å avgrense patofysiologi og i medisinutvikling. Med publiseringen av grisegenomet, sammen med vellykket transgen produksjon av sykdomsspesifikke modeller, står svinemodellen for å ta en mer kritisk rolle i translasjonsforskning40,41.

Inulinclearance er fortsatt det mest aksepterte middelet for GFR-bestemmelse, men er upraktisk i store dyremodeller på grunn av behovet for kontinuerlig infusjon av inulin, kateterisering av blæren og dens tidkrevende og besværlige natur42. Serumkreatinin og blodureanitrogen (BUN) brukes ofte til å måle nyrefunksjon i prekliniske studier, men fordi kreatinin utskilles i tubuli og urea i økende grad reabsorberes ved dehydrering, har disse markørene vist seg å være dårlige når det gjelder å estimere nyrefunksjonen 5,43. Avgjørende var at tubulær kreatininsekresjon ble funnet å forårsake overestimering av GFR når den ble brukt som markør for nyrefunksjon hos grisene6. På grunn av deres kropps habitus er det også mer sannsynlig at en økning i kreatinin blir sett i store dyremodeller sammenlignet med gnagere. En studie på mus viste en 1,5 ganger økning i serumkreatinin 6 timer etter cekal ligering44. Tidligere viste vi en økning i kreatinin hos nyfødte griser på 6 timer etter CLP28. I denne studien holdt vi dyrene i lengre tid, ~ 12 timer etter cecal ligering for å gi nok tid til betydelig AKI og en påfølgende økning i kreatinin. Som i vår forrige studie bekreftet vi induksjon av sepsis ved økt serumnivå av CRP, en inflammasjon og sepsismarkør. I denne studien, og som tidligere papirer viser, er alvorlighetsgraden av sepsis etter CLP avhengig av lengden på ligering og antall punkteringer44.

En protokoll for å måle GFR hos griser ved bruk av ioheksol har tidligere blitt validert hos gris37, men derimot er den transdermale GFR-prosedyren en markant forbedring. Det er mindre tungvint, unngår gjentatt blod- eller urinprøvetaking, og gir et sanntidsvindu til nyrefunksjon og mulighet for gjentatte, serielle målinger i samme dyr45. Denne studien gir praktiske retningslinjer for transdermal GFR-bestemmelse hos griser.

Som etablert av andre grupper, er de mest kritiske trinnene riktig fiksering av enheten til dyret og bolusinjeksjonen av FITC-sinistrin. Måleapparatet må være godt festet til hudoverflaten for å forhindre bevegelsesartefakter på sporet. Fordi grisene er mindre hårete enn gnagere, er det ikke nødvendig å bruke en hårfjerningskrem. En ren barbering med en klipper kan være alt som trengs. Dette minimerer den depileringsrelaterte økningen i halveringstiden til FITC-sinistrin, hvis mekanisme er ukjent12. For riktig fiksering kreves det en dobbeltsidig selvklebende og tape for å holde enheten på plass. De optimale plasseringsstedene for enheten er den laterale thoraxveggen og ventrale bukregionen. Disse områdene korrelerte med færre bevegelsesartefakter.

Når FITC-sinistrin injiseres, må riktig og hele dosen injiseres i en væskebevegelse i venen. Når injeksjonen avbrytes og startes på nytt, opprettes det flere "mini-peaks" på klaringskurven. Halevenen brukes rutinemessig til små gnagere, men den øreformede ørevenen gir en mer tilgjengelig og fremtredende rute hos grisene. En kanyle kan plasseres i ørevenen for flere målinger hos bevisste griser. Et viktig skille å merke seg i prøvetakingstiden er at, i motsetning til gnagere (~ 1-2 t), varer grisene lenger (~ 4 timer), noe som tilnærmer tiden det tar for FITC-sinistrin å bli fjernet fra sirkulasjonen. Så vidt vi vet, er dette det første papiret som beskriver transdermal GFR via FITC-sinistrinklarering hos griser. Så det finnes ingen sitater for referanse. Måletiden som ble brukt ~4t ble ankommet, via konsultasjoner med produsenten. Denne prøvetakingstiden er sammenlignbar med en tidligere studie som validerer transdermal GFR hos andre ikke-gnagere pattedyr14.

Ved evaluering av transdermal GFR hos gris er det noen faktorer som må vurderes. En-romsmodeller er kjent for å overvurdere GFR betydelig46; Vi bruker den tredelte kinetiske modellen som er mer nøyaktig, og gir treveiskommunikasjon av den intravenøst injiserte markøren mellom plasma, ekstracellulært rom og dypere komponenter46. Også disse er mekanisk ventilerte smågriser under svært dyp anestesi i ~ 12 timer. Siden anestesi påvirker nyrefunksjonen47,48, kan det være verdt å ta hensyn til det i prosedyrer som krever lang sedasjon eller hvor eksperimentelle manøvrer krever ytterligere anestesi sammen med GFR-overvåking. Til slutt, og kanskje mest avgjørende, har nyfødte grisunger fortsatt utviklende nyresystemer med umodne nefroner som fungerer på en brøkdel av det voksne dyret49. Derfor viser de lavere GFR og nyrefunksjon50.

Som tidligere indikert, er transdermal GFR hos griser ikke et absolutt mål på sinistrinkonsentrasjoner i blodet. Det er bare en estimering av forfall i fluorescens over tid12. Bruken av en konverteringsfaktor forsøker å dempe dette, ved å uttrykke GFR i ml/min. Men fordi konverteringsfaktoren er avhengig av ekstracellulært rom, som igjen er avhengig av kroppsvekt34,35,36, er det mulig for store variasjoner å eksistere hvis vekten ikke er kontrollert for, eller hvis det ekstracellulære rommet ikke er nøyaktig definert 51,52.

I tillegg ser hudpigmentering ut til å påvirke transdermal FITC-sinistrinclearance12,31. I våre studier fant vi at de pigmenterte grisene viste redusert signal. I ett tilfelle oppdaget vi ikke signal i en intenst mørk farget gris. Men siden bakgrunnssignalet har en tendens til å bli redusert hos pigmenterte dyr12, fant vi at GFR-verdier i stor grad var sammenlignbare. En løsning på dette er å velge lysere områder av huden når du plasserer enheten. Siden disse grisene i stor grad ble brukt i en kirurgisk sykdomsmodell, med flere former for belysning og varmekilder involvert, må man ta hensyn til potensielle bevegelsesartefakter på GFR-sporene via reflektert lys absorbert fra omkringliggende hud12. En løsning på dette kan være å minimere infrarødt lys under opptak eller dekke enhetene i folie.

Oppsummert tilbyr denne studien en enkel og pålitelig metode for å måle glomerulær filtreringshastighet hos nyfødte griser ved hjelp av transdermal måling av FITC-sinistrinclearance. Videre støtter våre data nytten av systemet for å evaluere nyrefunksjonen i innstillingene for akutt nyreskade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R01 DK120595 og R01 DK127625 tildelt Dr. Adebiyi. Innholdet i denne artikkelen er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Takk til Dr. Daniel Schock-Kusch, site director hos MediBeacon GmbH, for hans råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha - Chloralose Sigma-Aldrich C0128-25G Used for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0 Surgical Specialties SP117 Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8C Fischer Scientific 75-008-821 Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed Progressive Medical International 1109021995 Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 g MediBeacon Inc. FTCF S001 Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer Instrumentation Laboratory 5700 For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 in Adroit Medical Systems V029 Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy Pump Adroit Medical Systems HTP Allows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst One IDEXX Laboratories 89-92525-00 Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr Millar SPR-524 Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulator True Care TCRTCBINF033G Used to connect IV fluid bag to vein catheter
Ketamine Covetrus 68317 Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0 MediBeacon Inc. N/A Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGVR33RS Syringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant Ventilator Sechrist Millennium 20409 Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) Covetrus 72934 Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bag Baxter 2B2323Q Maintanence fluid infusion
Sterile Gloves Henry Schein 104-5920 Used by operator during surgery
Sterile Gown Halyard Health 95021 Used by operator during surgery
Steril Towel Medline 42131704 Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needle Ethicon NC1842168 Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR Monitor MediBeacon Inc. TDM004 Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patch MediBeacon Inc. PTC-SM001 Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds Fisher Scientific NC9303017 To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5 Micro medical tubing BB31695 For femoral vein cannulation
Xylazine Covetrus 61035 Used for induction of anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pasala, S., Carmody, J. B. How to use... serum creatinine, cystatin C and GFR. Archives of Disease in Childhood Education and Practice Edition. 102 (1), 37-43 (2017).
  2. Smith, H. W. The Kidney: Structure and Function in Health and Disease. , Oxford University Press, USA. (1951).
  3. Gutman, Y., Gottschalk, C. W., Lassiter, W. E. Micropuncture study of inulin absorption in the rat kidney. Science. 147 (3659), 753-754 (1965).
  4. Ellery, S. J., Cai, X., Walker, D. D., Dickinson, H., Kett, M. M. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in small rodents: through the skin for the win. Nephrology. 20 (3), 117-123 (2015).
  5. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
  6. Wendt, M., Waldmann, K. H., Bickhardt, K. Comparative studies of the clearance of inulin and creatinine in swine. Zentralblatt fur Veterinarmedizin. Reihe A. 37 (10), 752-759 (1990).
  7. Schwartz, G. J., Brion, L. P., Spitzer, A. The use of plasma creatinine concentration for estimating glomerular filtration rate in infants, children, and adolescents. Pediatric Clinics of North America. 34 (3), 571-590 (1987).
  8. Boer, D. P., de Rijke, Y. B., Hop, W. C., Cransberg, K., Dorresteijn, E. M. Reference values for serum creatinine in children younger than 1 year of age. Pediatric Nephrology. 25 (10), 2107-2113 (2010).
  9. Guignard, J. P., Drukker, A. Why do newborn infants have a high plasma creatinine. Pediatrics. 103 (4), 49 (1999).
  10. Friedemann, J., Schock-Kusch, D., Shulhevich, Y. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in conscious laboratory animals: state of the art and future perspectives. Reporters, Markers, Dyes, Nanoparticles, and Molecular Probes for Biomedical Applications IX. 10079, 63-71 (2017).
  11. Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents. Journal of Visualized Experiments. (109), e53767 (2016).
  12. Scarfe, L., et al. Transdermal measurement of glomerular filtration rate in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58520 (2018).
  13. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  14. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
  15. Almond, G. W. Research applications using pigs. The Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. 12 (3), 707-716 (1996).
  16. Bassols, A., et al. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. Proteomics Clinical Applications. 8 (9-10), 715-731 (2014).
  17. Ayuso, M., Irwin, R., Walsh, C., Van Cruchten, S., Van Ginneken, C. Low birth weight female piglets show altered intestinal development, gene expression, and epigenetic changes at key developmental loci. FASEB Journal. 35 (4), 21522 (2021).
  18. Pierson, R. N. Progress toward pig-to-human xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1871-1873 (2022).
  19. Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1889-1898 (2022).
  20. Reardon, S. First pig kidneys transplanted into people: what scientists think. Nature. 605 (7911), 597-598 (2022).
  21. Lu, T., Yang, B., Wang, R., Qin, C. Xenotransplantation: current status in preclinical research. Frontiers in Immunology. 10, 3060 (2019).
  22. Pattison, R. J., English, P. R., MacPherson, O., Roden, J. A., Birnie, M. Hypothermia and its attempted control in newborn piglets. Proceedings of the British Society of Animal Production. 1990, 81 (1972).
  23. Tucker, B. S., Petrovski, K. R., Kirkwood, R. N. Neonatal piglet temperature changes: effect of intraperitoneal warm saline injection. Animals. 12 (10), 1312 (2022).
  24. Alcalá Rueda, I., et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 278 (8), 3081-3090 (2021).
  25. Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques, Third Edition. , CRC Press/Taylor & Francis Group. Boca Raton. (2016).
  26. Steinbacher, R., von Ritgen, S., Moens, Y. P. Laryngeal perforation during a standard intubation procedure in a pig. Laboratory Animals. 46 (3), 261-263 (2012).
  27. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Göttingen minipig: intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. Journal of Visualized Experiments. (52), e2652 (2011).
  28. Soni, H., Adebiyi, A. Early septic insult in neonatal pigs increases serum and urinary soluble Fas ligand and decreases kidney function without inducing significant renal apoptosis. Renal Failure. 39 (1), 83-91 (2017).
  29. Bütz, D. E., Morello, S. L., Sand, J., Holland, G. N., Cook, M. E. The expired breath carbon delta value is a marker for the onset of sepsis in a swine model. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 29 (4), 606-613 (2014).
  30. Turner, A. S., McIlwraith, C. W. Techniques in Large Animal Surgery. , Lea & Febiger. (1989).
  31. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
  32. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  33. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (10), 2997-3001 (2009).
  34. Peters, A. M. Expressing glomerular filtration rate in terms of extracellular fluid volume. Nephrology Dialysis Transplantation. 7 (3), 205-210 (1992).
  35. Groth, S., Christensen, A. B., Nielsen, H. CdTe-detector registration of 99mTc-DTPA clearance. European Journal of Nuclear Medicine. 8 (6), 242-244 (1983).
  36. Guyton, A. C., Hall, J. E. The body fluid compartments: extracellular and intracellular fluids; interstitial fluid and edema. Textbook of Medical Physiology. 9, 306-308 (2000).
  37. Luis-Lima, S., et al. Iohexol plasma clearance simplified by dried blood spot testing. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 33 (9), 1597-1603 (2018).
  38. Kobayashi, E., Hishikawa, S., Teratani, T., Lefor, A. T. The pig as a model for translational research: overview of porcine animal models at Jichi Medical University. Transplantation Research. 1 (1), 8 (2012).
  39. Swindle, M. M., et al. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  40. Ibrahim, Z., et al. Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems. Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2006).
  41. Judge, E. P., et al. Anatomy and bronchoscopy of the porcine lung. A model for translational respiratory medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (3), 334-343 (2014).
  42. Stevens, L. A., Levey, A. S. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (11), 2305-2313 (2009).
  43. Bankir, L., Yang, B. New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism. Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).
  44. Ruiz, S., et al. Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture. Intensive Care Medicine Experimental. 4 (1), 22 (2016).
  45. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).
  46. Frennby, B., Sterner, G. Contrast media as markers of GFR. European Radiology. 12 (2), 475484 (2002).
  47. Burchardi, H., Kaczmarczyk, G. The effect of anaesthesia on renal function. European Journal of Anaesthesiology. 11 (3), 163-168 (1994).
  48. Fusellier, M., et al. Influence of three anesthetic protocols on glomerular filtration rate in dogs. American Journal of Veterinary Research. 68 (8), 807811 (2007).
  49. Arant, B. S. Functional immaturity of the newborn kidney-paradox or prostaglandin. Homeostasis, Nephrotoxicity, and Renal Anomalies in the Newborn. , Springer. Boston, MA. 271-278 (1986).
  50. Gattineni, J., Baum, M. Developmental changes in renal tubular transport-an overview. Pediatric Nephrology. 30 (12), 2085-2098 (2015).
  51. Gu, X., Yang, B. Methods for assessment of the glomerular filtration rate in laboratory animals. Kidney Diseases. , 1-11 (2022).
  52. Mullins, T. P., Tan, W. S., Carter, D. A., Gallo, L. A. Validation of non-invasive transcutaneous measurement for glomerular filtration rate in lean and obese C57BL/6J mice. Nephrology. 25 (7), 575-581 (2020).

Tags

Medisin utgave 187
Transdermal måling av glomerulær filtreringshastighet i mekanisk ventilerte smågriser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fanous, M. S., Afolabi, J. M.,… More

Fanous, M. S., Afolabi, J. M., Michael, O. S., Falayi, O. O., Iwhiwhu, S. A., Adebiyi, A. Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets. J. Vis. Exp. (187), e64413, doi:10.3791/64413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter