Summary

Eine skalierbare, zellbasierte Methode zur funktionellen Bewertung von Ube3a-Varianten

Published: October 10, 2022
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Summary

Eine einfache und skalierbare Methode wurde entwickelt, um die funktionelle Bedeutung von Missense-Varianten in Ube3a zu bewerten, einem Gen, dessen Verlust und Funktionsgewinn sowohl mit dem Angelman-Syndrom als auch mit der Autismus-Spektrum-Störung verbunden sind.

Abstract

Der verstärkte Einsatz von Sequenzierung in der Medizin hat Millionen von kodierenden Varianten im menschlichen Genom identifiziert. Viele dieser Varianten kommen in Genen vor, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, aber die funktionelle Bedeutung der überwiegenden Mehrheit der Varianten bleibt unbekannt. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung von Varianten für Ube3a, ein Gen, das eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert, die sowohl mit Autismus als auch mit Angelman-Syndrom verbunden ist. Die Duplikation oder Verdreifachung von Ube3a ist stark mit Autismus verbunden, während seine Deletion das Angelman-Syndrom verursacht. Daher ist das Verständnis der Valenz von Veränderungen der UBE3A-Proteinaktivität wichtig für klinische Ergebnisse. Hier wird eine schnelle, zellbasierte Methode beschrieben, die Ube3a-Varianten mit einem Wnt-Signalweg-Reporter paart. Dieser einfache Assay ist skalierbar und kann verwendet werden, um die Wertigkeit und das Ausmaß von Aktivitätsänderungen in jeder Ube3a-Variante zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Einrichtung dieser Methode die Generierung einer Fülle von Struktur-Funktions-Informationen, die verwendet werden können, um tiefe Einblicke in die enzymatischen Mechanismen von UBE3A zu gewinnen.

Introduction

Jüngste technologische Fortschritte haben die Sequenzierung von Exomen und Genomen in klinischen Umgebungen zur Routine gemacht 1,2. Dies hat zur Entdeckung einer großen Anzahl genetischer Varianten geführt, darunter Millionen von Missense-Varianten, die typischerweise eine Aminosäure in einem Protein verändern. Das Verständnis der funktionellen Bedeutung dieser Varianten bleibt eine Herausforderung, und nur ein kleiner Bruchteil (~2%) der bekannten Missense-Varianten hat eine klinische Interpretation 1,3.

Ein prominentes Beispiel für dieses Problem ist Ube3a, ein Gen, das für eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert, die auf Substratproteine für den Abbauabzielt 4. Ube3a befindet sich auf Chromosom 15q11-13 und wird ausschließlich aus dem mütterlich vererbten Allel 5,6,7 exprimiert. Beobachtungen aus der Krankheitsgenetik deuten stark darauf hin, dass eine unzureichende oder übermäßige Aktivität des UBE3A-Enzyms unterschiedliche neurologische Entwicklungsstörungen verursacht. Die Deletion des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 verursacht das Angelman-Syndrom (AS)8, eine Störung, die durch schwere geistige Behinderung, motorische Beeinträchtigungen, Krampfanfälle, ein fröhliches Auftreten mit häufigem Lächeln und dysmorphe Gesichtszüge gekennzeichnetist 8,9,10. Im Gegensatz dazu verursacht die Duplikation oder Verdreifachung des mütterlichen Chromosoms 15q11-13 das Dup15q-Syndrom, eine heterogene Erkrankung, die als eine der häufigsten syndromalen Formen von Autismus anerkanntwird 11,12,13. Darüber hinaus gibt es Hunderte von Missense-Varianten, die in Ube3a identifiziert wurden, von denen die meisten als Varianten von ungewisser Signifikanz (VUS) gelten, da ihre funktionelle und klinische Bedeutung unbekannt ist. Daher besteht ein erhebliches Interesse an der Entwicklung von Methoden, die Ube3a-Varianten empirisch bewerten können, um festzustellen, ob sie zu neurologischen Entwicklungsstörungen beitragen.

Das UBE3A-Enzym gehört zur HECT-Domänenfamilie (homolog to E6-AP C-terminus) von E3-Ubiquitin-Ligasen, die alle die gleichnamige HECT-Domäne besitzen, die die biochemische Maschinerie enthält, die notwendig ist, um aktiviertes Ubiquitin von E2-Enzymen aufzunehmen und auf Substratproteine zu übertragen14. In der Vergangenheit stützte sich die Charakterisierung von E3-Enzymen auf rekonstituierte In-vitro-Systeme, die ein Ensemble gereinigter Proteineerfordern 4,15,16. Solche Methoden sind langsam und arbeitsintensiv und können die Aktivität einer großen Anzahl von Varianten nicht beurteilen. In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass UBE3A den Wnt-Signalweg in HEK293T-Zellen aktiviert, indem es die Funktion des Proteasoms moduliert, um den Abbau von β-Catenin17 zu verlangsamen. Diese Erkenntnis ermöglicht den Einsatz von Wnt-Signalwegreportern als effiziente und schnelle Methode, um sowohl Loss- als auch Gain-of-Function-Varianten von Ube3a18 zu identifizieren. Das folgende Protokoll beschreibt detailliert eine Methode zur Erzeugung von Ube3a-Varianten sowie einen Luciferase-basierten Reporter zur Beurteilung von Veränderungen in der Aktivität von Ube3a-Varianten.

Protocol

1. Mutagenese-Klonierung zur Erzeugung von Ube3a-Varianten Klonen Sie alle Ube3a-Varianten in das pCIG2-Plasmid (Abbildung 1A), einen bicistronischen Vektor, der einen Hühner-β-Aktin-Promotor und eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) für die EGFP-Expression19 enthält. Ube3a-Konstrukte in voller Länge enthalten eine N-terminale Myc-Tag-Sequenz und werden unter Verwendung einer 5′-SacI-Site und einer 3′-X…

Representative Results

Großflächiges funktionelles Screening von Ube3a-Missense-Varianten identifiziert eine breite Landschaft von Loss- und Gain-of-Function-MutationenFrühere Arbeiten mit Ube3a-Mutanten deuteten darauf hin, dass die Wnt-Antwort als Reporter der zellulären UBE3A-Proteinaktivität dienen kann. Diese Beobachtungen wurden erweitert und zusätzliche Validierungsexperimente durchgeführt, um zu untersuchen, ob der BAR-Assay geeignet ist, eine Reihe von UBE3A-Aktivitäten in der Zelle zu me…

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine effiziente und skalierbare Methode zur Beurteilung der enzymatischen Aktivität von Ube3a-Varianten. Es gibt mehrere technische Details, die bei der Verwendung dieses Assays sorgfältig berücksichtigt werden sollten. Eine Überlegung ist die Wahl der Wnt-Reporterplasmide, die in diesem Assay verwendet werden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet speziell den β-Catenin-aktivierten Reporter (BAR)21, einen Reporter, der ein Konkatemer aus 12…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), einen NARSAD Young Investigator Award der Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), ein Forschungsstipendium der Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.) und Forschungsstipendien der Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), der Whitehall Foundation (J.J.Y.) und des NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red Gibco 25300-054
1 Kb DNA ladder Lambda Biotech M108-S
100 bp DNA Ladder Lambda Biotech M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP New England BioLabs B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer New England BioLabs B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate PerkinElmer 6005030
Carbenicillin Disodium Salt Midwest Scientific KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides Invitrogen by Thermo Fisher Scientific C10283
Countess II Automated Cell Counter  life technologies Cell counting machine
Custom DNA oligos Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England BioLabs N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Gibco 10569044 Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x) Gibco 14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
EcoRI-HF  New England BioLabs R3101S Restriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Gibco 16140071 Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes Fisherbrand FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2691
Gel Loading Dye Purple (6x) New England BioLabs B7024A
HEK293T cells ATCC CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells Intact Genomics 1011-12 E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi Kit Qiagen 12643 Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase New England BioLabs M0530L DNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System Applied biosystems by life technologies Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250) Qiagen 28706 Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250) Qiagen 28106 PCR purification
rCutSmart Buffer New England BioLabs B6004S
SacI-HF New England BioLabs R3156S Restriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode Reader BioTek  Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202L Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis Fisher Scientific BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom Fisherbrand FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution Invitrogen by Thermo Fisher Scientific 15585011
XmaI New England BioLabs R0180S Restriction enzyme

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Cite This Article
Stelzer, J. A., Yi, J. J. A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants. J. Vis. Exp. (188), e64454, doi:10.3791/64454 (2022).

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