Summary

Un método escalable basado en células para la evaluación funcional de variantes de Ube3a

Published: October 10, 2022
doi:

Summary

Se desarrolló un método simple y escalable para evaluar la importancia funcional de las variantes sin sentido en Ube3a, un gen cuya pérdida y ganancia de función están relacionadas tanto con el síndrome de Angelman como con el trastorno del espectro autista.

Abstract

El aumento del uso de la secuenciación en medicina ha identificado millones de variantes codificantes en el genoma humano. Muchas de estas variantes ocurren en genes asociados con trastornos del neurodesarrollo, pero el significado funcional de la gran mayoría de las variantes sigue siendo desconocido. El presente protocolo describe el estudio de variantes para Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 vinculada tanto al autismo como al síndrome de Angelman. La duplicación o triplicación de Ube3a está fuertemente relacionada con el autismo, mientras que su eliminación causa el síndrome de Angelman. Por lo tanto, comprender la valencia de los cambios en la actividad de la proteína UBE3A es importante para los resultados clínicos. Aquí, se describe un método rápido basado en células que empareja variantes de Ube3a con un reportero de la vía Wnt. Este ensayo simple es escalable y se puede utilizar para determinar la valencia y magnitud de los cambios de actividad en cualquier variante de Ube3a . Además, la facilidad de este método permite la generación de una gran cantidad de información estructura-función, que se puede utilizar para obtener información profunda sobre los mecanismos enzimáticos de UBE3A.

Introduction

Los recientes avances tecnológicos han hecho que la secuenciación de exomas y genomas sea rutinaria en entornos clínicos 1,2. Esto ha llevado al descubrimiento de un gran número de variantes genéticas, incluyendo millones de variantes sin sentido que típicamente cambian un aminoácido en una proteína. Comprender el significado funcional de estas variantes sigue siendo un desafío, y solo una pequeña fracción (~2%) de las variantes sin sentido conocidas tienen una interpretación clínica 1,3.

Un ejemplo destacado de este problema es Ube3a, un gen que codifica una ubiquitina ligasa E3 que se dirige a las proteínas de sustrato para su degradación4. Ube3a reside dentro del cromosoma 15q11-13 y se expresa exclusivamente a partir del alelo heredado materno 5,6,7. Las observaciones de la genética de la enfermedad sugieren fuertemente que la actividad insuficiente o excesiva de la enzima UBE3A causa distintos trastornos del desarrollo neurológico. La deleción del cromosoma materno 15q11-13 causa el síndrome de Angelman (EA)8, un trastorno caracterizado por discapacidad intelectual grave, deficiencias motoras, convulsiones, un comportamiento feliz con sonrisas frecuentes y rasgos faciales dismórficos 8,9,10. En contraste, la duplicación o triplicación del cromosoma materno 15q11-13 causa el síndrome de Dup15q, una condición heterogénea reconocida como una de las formas sindrómicas más prevalentes de autismo11,12,13. Además, hay cientos de variantes sin sentido identificadas en Ube3a, la mayoría de las cuales se consideran variantes de significado incierto (VUS) ya que su significado funcional y clínico son desconocidos. Por lo tanto, existe un interés considerable en desarrollar métodos que puedan evaluar empíricamente las variantes de Ube3a para determinar si contribuyen a la enfermedad del desarrollo neurológico.

La enzima UBE3A pertenece a la familia de dominios HECT (homólogos a E6-AP C-terminal) de ligasas de ubiquitina E3 que poseen el dominio HECT del mismo nombre, que contiene la maquinaria bioquímica necesaria para aceptar ubiquitina activada de enzimas E2 y transferirla a proteínas sustrato14. Históricamente, la caracterización de las enzimas E3 se ha basado en sistemas in vitro reconstituidos que requieren un conjunto de proteínas purificadas 4,15,16. Tales métodos son lentos y requieren mucha mano de obra y no son susceptibles de evaluar la actividad de un gran número de variantes. En trabajos anteriores, se identificó UBE3A para activar la vía Wnt en las células HEK293T mediante la modulación de la función del proteasoma para ralentizar la degradación de la β-catenina17. Esta información permite el uso de reporteros de la vía Wnt como un método eficiente y rápido para identificar variantes de pérdida y ganancia de función de Ube3a18. El siguiente protocolo describe en detalle un método para generar variantes de Ube3a, así como un reportero basado en luciferasa para evaluar los cambios en la actividad de las variantes de Ube3a.

Protocol

1. Clonación de mutagénesis para generar variantes de Ube3a Clone todas las variantes de Ube3a en el plásmido pCIG2 (Figura 1A), un vector bicistrónico que contiene un promotor de β-actina de pollo y un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para la expresión de EGFP19. Las construcciones Ube3a de longitud completa contienen una secuencia de etiquetas Myc de N-terminal y se clonan en pCIG2 usando un siti…

Representative Results

El cribado funcional a gran escala de las variantes sin sentido de Ube3a identifica un amplio panorama de mutaciones de pérdida y ganancia de funciónTrabajos previos con mutantes Ube3a sugirieron que la respuesta Wnt puede servir como un reportero de la actividad celular de la proteína UBE3A. Estas observaciones se ampliaron y se realizaron experimentos de validación adicionales para investigar si el ensayo BAR es adecuado para informar una gama de actividades UBE3A en la célul…

Discussion

El protocolo descrito aquí proporciona un método eficiente y escalable para evaluar la actividad enzimática de las variantes de Ube3a. Hay varios detalles técnicos que merecen una cuidadosa consideración al usar este ensayo. Una consideración es la elección de los plásmidos reporteros Wnt utilizados en este ensayo. El protocolo descrito aquí utiliza específicamente el reportero activado por β-catenina (BAR)21, un informador que contiene un concatemer de 12 elementos de respuest…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por un Premio Puente a la Independencia de la Fundación Simons (Premio SFARI # 387972; J.J.Y.), un NARSAD Young Investigator Award de la Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), una beca de investigación de la Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), y becas de investigación de la Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), la Whitehall Foundation (J.J.Y.) y el NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red Gibco 25300-054
1 Kb DNA ladder Lambda Biotech M108-S
100 bp DNA Ladder Lambda Biotech M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP New England BioLabs B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer New England BioLabs B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate PerkinElmer 6005030
Carbenicillin Disodium Salt Midwest Scientific KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides Invitrogen by Thermo Fisher Scientific C10283
Countess II Automated Cell Counter  life technologies Cell counting machine
Custom DNA oligos Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England BioLabs N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Gibco 10569044 Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x) Gibco 14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
EcoRI-HF  New England BioLabs R3101S Restriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Gibco 16140071 Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes Fisherbrand FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2691
Gel Loading Dye Purple (6x) New England BioLabs B7024A
HEK293T cells ATCC CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells Intact Genomics 1011-12 E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi Kit Qiagen 12643 Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase New England BioLabs M0530L DNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System Applied biosystems by life technologies Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250) Qiagen 28706 Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250) Qiagen 28106 PCR purification
rCutSmart Buffer New England BioLabs B6004S
SacI-HF New England BioLabs R3156S Restriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode Reader BioTek  Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202L Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis Fisher Scientific BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom Fisherbrand FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution Invitrogen by Thermo Fisher Scientific 15585011
XmaI New England BioLabs R0180S Restriction enzyme

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Cite This Article
Stelzer, J. A., Yi, J. J. A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants. J. Vis. Exp. (188), e64454, doi:10.3791/64454 (2022).

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