Un metodo scalabile basato su celle per la valutazione funzionale delle varianti Ube3a
Summary
È stato sviluppato un metodo semplice e scalabile per valutare il significato funzionale delle varianti missenso in Ube3a, un gene la cui perdita e guadagno di funzione sono legati sia alla sindrome di Angelman che al disturbo dello spettro autistico.
Abstract
L’aumento dell’uso del sequenziamento in medicina ha identificato milioni di varianti codificanti nel genoma umano. Molte di queste varianti si verificano in geni associati a disturbi dello sviluppo neurologico, ma il significato funzionale della stragrande maggioranza delle varianti rimane sconosciuto. Il presente protocollo descrive lo studio di varianti per Ube3a, un gene che codifica per una ubiquitina ligasi E3 legata sia all’autismo che alla sindrome di Angelman. La duplicazione o triplicazione di Ube3a è fortemente legata all’autismo, mentre la sua delezione causa la sindrome di Angelman. Pertanto, comprendere la valenza dei cambiamenti nell’attività della proteina UBE3A è importante per i risultati clinici. Qui viene descritto un metodo rapido basato su cellule che accoppia le varianti di Ube3a con un reporter di percorso Wnt. Questo semplice test è scalabile e può essere utilizzato per determinare la valenza e l’entità dei cambiamenti di attività in qualsiasi variante di Ube3a . Inoltre, la facilità di questo metodo consente la generazione di una ricchezza di informazioni struttura-funzione, che possono essere utilizzate per ottenere informazioni approfondite sui meccanismi enzimatici di UBE3A.
Introduction
I recenti progressi tecnologici hanno reso il sequenziamento di esomi e genomi di routine in ambito clinico 1,2. Ciò ha portato alla scoperta di un gran numero di varianti genetiche, tra cui milioni di varianti missenso che tipicamente cambiano un amminoacido in una proteina. Comprendere il significato funzionale di queste varianti rimane una sfida, e solo una piccola frazione (~2%) delle varianti missenso conosciute ha un’interpretazione clinica 1,3.
Un esempio importante di questo problema è Ube3a, un gene che codifica per una ubiquitina ligasi E3 che prende di mira le proteine del substrato per la degradazione4. Ube3a risiede all’interno del cromosoma 15q11-13 ed è espresso esclusivamente dall’allele 5,6,7 ereditato per via materna. Le osservazioni della genetica delle malattie suggeriscono fortemente che l’attività insufficiente o eccessiva dell’enzima UBE3A causa distinti disturbi dello sviluppo neurologico. La delezione del cromosoma materno 15q11-13 causa la sindrome di Angelman (AS)8, un disturbo caratterizzato da grave disabilità intellettiva, menomazioni motorie, convulsioni, un contegno felice con frequenti sorrisi e caratteristiche facciali dismorfiche 8,9,10. Al contrario, la duplicazione o triplicazione del cromosoma materno 15q11-13 causa la sindrome di Dup15q, una condizione eterogenea riconosciuta come una delle forme sindromiche più diffuse di autismo11,12,13. Inoltre, ci sono centinaia di varianti missenso identificate in Ube3a, la maggior parte delle quali sono considerate varianti di significato incerto (VUS) in quanto il loro significato funzionale e clinico è sconosciuto. Pertanto, vi è un notevole interesse nello sviluppo di metodi in grado di valutare empiricamente le varianti di Ube3a per determinare se contribuiscono alla malattia dello sviluppo neurologico.
L’enzima UBE3A appartiene alla famiglia di domini HECT (omologa a E6-AP C-terminale) delle ubiquitina ligasi E3 che possiedono tutte l’omonimo dominio HECT, che contiene il macchinario biochimico necessario per accettare l’ubiquitina attivata dagli enzimi E2 e trasferirla alle proteine del substrato14. Storicamente, la caratterizzazione degli enzimi E3 si è basata su sistemi in vitro ricostituiti che richiedono un insieme di proteine purificate 4,15,16. Tali metodi sono lenti e laboriosi e non suscettibili di valutare l’attività di un gran numero di varianti. In lavori precedenti, UBE3A è stato identificato per attivare la via Wnt nelle cellule HEK293T modulando la funzione del proteasoma per rallentare la degradazione della β-catenina17. Questa intuizione consente l’uso di Wnt pathway reporter come metodo efficiente e rapido per identificare sia le varianti di perdita che di guadagno di funzione di Ube3a18. Il protocollo seguente descrive in dettaglio un metodo per generare varianti di Ube3a e un reporter basato sulla luciferasi per valutare i cambiamenti nell’attività delle varianti di Ube3a.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto fornisce un metodo efficiente e scalabile per valutare l’attività enzimatica delle varianti di Ube3a. Ci sono diversi dettagli tecnici che meritano un’attenta considerazione quando si utilizza questo test. Una considerazione è la scelta dei plasmidi reporter Wnt utilizzati in questo test. Il protocollo qui descritto utilizza specificamente il reporter attivato da β-catenina (BAR)21, un reporter che contiene un concatenatore di 12 elementi di risposta del fat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), un NARSAD Young Investigator Award dalla Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), una borsa di ricerca dalla Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), e borse di ricerca dalla Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), dalla Whitehall Foundation (J.J.Y.) e dal NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
