Summary

שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a

Published: October 10, 2022
doi:

Summary

שיטה פשוטה ומדרגית פותחה כדי להעריך את המשמעות התפקודית של גרסאות missense ב- Ube3a, גן שאובדן ורווח תפקודו קשורים הן לתסמונת אנג’למן והן להפרעת ספקטרום האוטיזם.

Abstract

השימוש המוגבר בריצוף ברפואה זיהה מיליוני גרסאות קידוד בגנום האנושי. רבים מהווריאנטים האלה מתרחשים בגנים הקשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות, אך המשמעות התפקודית של הרוב המכריע של הווריאנטים עדיין לא ידועה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של וריאנטים עבור Ube3a, גן המקודד E3 יוביקוויטין ליגאז הקשור הן לאוטיזם והן לתסמונת אנג’למן. שכפול או משולש של Ube3a קשור מאוד לאוטיזם, ואילו מחיקתו גורמת לתסמונת אנג’למן. לפיכך, הבנת הערכיות של שינויים בפעילות החלבון UBE3A חשובה לתוצאות קליניות. כאן מתוארת שיטה מהירה, מבוססת תאים, המשלבת גרסאות Ube3a עם כתב מסלול Wnt. בדיקה פשוטה זו ניתנת להרחבה וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את הערכיות ואת גודל השינויים בפעילות בכל גרסה של Ube3a . יתר על כן, המתקן של שיטה זו מאפשר יצירת שפע של מידע מבנה-פונקציה, אשר ניתן להשתמש בו כדי לקבל תובנות עמוקות על מנגנונים אנזימטיים של UBE3A.

Introduction

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה הפכה את ריצוף האקסומים והגנומים לשגרתי במסגרות קליניות 1,2. זה הוביל לגילוי של מספר רב של וריאנטים גנטיים, כולל מיליוני וריאנטים של מיסנס שבדרך כלל משנים חומצת אמינו אחת בחלבון. הבנת המשמעות הפונקציונלית של וריאנטים אלה נותרה אתגר, ורק לחלק קטן (~2%) מהווריאנטים הידועים של מיסנס יש פרשנות קלינית 1,3.

דוגמה בולטת לבעיה זו היא Ube3a, גן המקודד יוביקוויטין ליגאז E3 המכוון לחלבוני סובסטרט לפירוק4. Ube3a שוכן בתוך כרומוזום 15q11-13 ומתבטא אך ורק באלל 5,6,7 שעבר בירושה אימהית. תצפיות מהגנטיקה של מחלות מצביעות על כך שפעילות לא מספקת או מוגזמת של האנזים UBE3A גורמת להפרעות נוירו-התפתחותיות מובהקות. מחיקת כרומוזום אימהי 15q11-13 גורמת לתסמונת אנג’למן (AS)8, הפרעה המאופיינת במוגבלות אינטלקטואלית קשה, ליקויים מוטוריים, התקפים, התנהגות שמחה עם חיוך תכוף, ותווי פנים דיסמורפיים 8,9,10. לעומת זאת, שכפול או שילוש של כרומוזום אימהי 15q11-13 גורם לתסמונת Dup15q, מצב הטרוגני המוכר כאחת הצורות הסינדרומיות הנפוצות ביותר של אוטיזם11,12,13. בנוסף, ישנם מאות וריאנטים שגויים שזוהו ב– Ube3a, שרובם נחשבים לווריאנטים בעלי משמעות לא ברורה (VUS) מכיוון שמשמעותם התפקודית והקלינית אינה ידועה. לפיכך, יש עניין רב בפיתוח שיטות שיכולות להעריך באופן אמפירי גרסאות Ube3a כדי לקבוע אם הם תורמים למחלות נוירו-התפתחותיות.

האנזים UBE3A שייך למשפחת התחום HECT (הומולוגית ל-E6-AP C-terminus) של ליגאזות יוביקוויטין E3 שכולן מחזיקות בתחום ה-HECT המפורסם, המכיל את המנגנון הביוכימי הדרוש כדי לקבל יוביקוויטין פעיל מאנזימי E2 ולהעבירו לחלבוני סובסטרט14. מבחינה היסטורית, האפיון של אנזימי E3 הסתמך על מערכות מבחנה משוחזרות הדורשות אנסמבל של חלבונים מטוהרים 4,15,16. שיטות כאלה הן איטיות ועתירות עבודה ואינן ניתנות להערכת הפעילות של מספר רב של גרסאות. בעבודה קודמת, UBE3A זוהה כמפעיל את מסלול ה-Wnt בתאי HEK293T על ידי ויסות תפקוד הפרוטאזום כדי להאט את הפירוק של β-קטנין17. תובנה זו מאפשרת את השימוש בכתבי מסלול Wnt כשיטה יעילה ומהירה לזיהוי גרסאות אובדן ורווח של פונקציה של Ube3a18. הפרוטוקול שלהלן מתאר בפירוט שיטה ליצירת וריאנטים של Ube3a וכן כתב מבוסס לוציפראז להערכת שינויים בפעילות של וריאנטים של Ube3a.

Protocol

1. שיבוט מוטגנזה ליצירת גרסאות Ube3a שכפלו את כל גרסאות Ube3a לפלסמיד pCIG2 (איור 1A), וקטור ביקיסטרוני המכיל מקדם עוף-β-אקטין ואתר כניסה לריבוזום פנימי (IRES) עבור ביטוי EGFP19. מבנים באורך מלא של Ube3a מכילים רצף תגי Myc מסוף N והם משוכפלים ל-pCIG2 באמצע…

Representative Results

סריקה פונקציונלית בקנה מידה גדול של וריאנטים של Ube3a missense מזהה נוף רחב של מוטציות אובדן ורווח של תפקודעבודה קודמת עם מוטנטים של Ube3a הציעה שתגובת Wnt יכולה לשמש ככתב של פעילות החלבון UBE3A התאית. תצפיות אלה הורחבו, ונערכו ניסויי ולידציה נוספים כדי לחקור אם בדיקת BAR מתאימה לדי…

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה יעילה ומדרגית להערכת הפעילות האנזימטית של גרסאות Ube3a. ישנם מספר פרטים טכניים המחייבים שיקול דעת זהיר בעת שימוש בבדיקה זו. שיקול אחד הוא הבחירה בפלסמידים של כתב Wnt המשמשים בבדיקה זו. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באופן ספציפי ב-β-catenin מופעל reporter (BAR)2…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרס גשר לעצמאות של קרן סימונס (פרס SFARI #387972; J.J.Y.), פרס חוקר צעיר של NARSAD מהקרן לחקר המוח וההתנהגות (J.J.Y.), מלגת מחקר מקרן אלפרד פ. סלואן (J.J.Y.), ומענקי מחקר מקרן תסמונת אנג’למן (J.J.Y.), קרן וייטהול (J.J.Y.) ו- NIMH (R01MH122786; ג’יי.ג’יי.).

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red Gibco 25300-054
1 Kb DNA ladder Lambda Biotech M108-S
100 bp DNA Ladder Lambda Biotech M107
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP New England BioLabs B0202A
5x Phusion HF Reaction Buffer New England BioLabs B0518S
Antibiotic-Antimycotic Solution Corning 30004CI
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate PerkinElmer 6005030
Carbenicillin Disodium Salt Midwest Scientific KCC46000-5
Countess cell counting chamber  slides Invitrogen by Thermo Fisher Scientific C10283
Countess II Automated Cell Counter  life technologies Cell counting machine
Custom DNA oligos Integrated DNA Technologies (IDT)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix New England BioLabs N0447S
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Gibco 10569044 Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line
DPBS (1x) Gibco 14190-136
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
EcoRI-HF  New England BioLabs R3101S Restriction enzyme
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Gibco 16140071 Fetal bovine serum
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes Fisherbrand FB012924
FuGENE 6 Transfection Reagent Promega E2691
Gel Loading Dye Purple (6x) New England BioLabs B7024A
HEK293T cells ATCC CRL-3216
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells Intact Genomics 1011-12 E. coli DH10B cells
HiSpeed Plasmid Midi Kit Qiagen 12643 Midi prep
pCIG2 plasmid
pGL3 BAR plasmid
Phusion HF DNA Polymerase New England BioLabs M0530L DNA polymerase
ProFlex 3 x 32 well PCR System Applied biosystems by life technologies Thermocycler
pTK Renilla plasmid
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 Mini prep
QIAquick Gel Extraction Kit (250) Qiagen 28706 Gel purification
QIAquick PCR Purification Kit (250) Qiagen 28106 PCR purification
rCutSmart Buffer New England BioLabs B6004S
SacI-HF New England BioLabs R3156S Restriction enzyme
Synergy HTX Multi-Mode Reader BioTek  Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek)
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202L Ligase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis Fisher Scientific BP13324
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom Fisherbrand FB012931
UltraPure Ethidium Bromide Solution Invitrogen by Thermo Fisher Scientific 15585011
XmaI New England BioLabs R0180S Restriction enzyme

References

  1. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
  2. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  3. Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
  4. Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
  5. Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
  6. Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
  7. Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
  8. Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
  9. Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
  10. Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
  11. Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
  12. Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
  13. de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
  14. Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
  15. Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
  16. Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
  17. Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
  18. Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
  19. Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
  22. Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
  23. Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
  24. Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
  25. Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
  26. Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).

Play Video

Cite This Article
Stelzer, J. A., Yi, J. J. A Scalable, Cell-Based Method for the Functional Assessment of Ube3a Variants. J. Vis. Exp. (188), e64454, doi:10.3791/64454 (2022).

View Video