Был разработан простой и масштабируемый метод оценки функциональной значимости вариантов миссенса в Ube3a, гене, потеря и усиление функции которого связаны как с синдромом Ангельмана, так и с расстройством аутистического спектра.
Более широкое использование секвенирования в медицине выявило миллионы вариантов кодирования в геноме человека. Многие из этих вариантов встречаются в генах, связанных с нарушениями нервного развития, но функциональное значение подавляющего большинства вариантов остается неизвестным. Настоящий протокол описывает изучение вариантов Ube3a, гена, который кодирует убиквитин-лигазу E3, связанную как с аутизмом, так и с синдромом Ангельмана. Дублирование или трипликация Ube3a тесно связана с аутизмом, тогда как его удаление вызывает синдром Ангельмана. Таким образом, понимание валентности изменений активности белка UBE3A важно для клинических исходов. Здесь описан быстрый клеточный метод, который связывает варианты Ube3a с репортером пути Wnt. Этот простой анализ является масштабируемым и может быть использован для определения валентности и величины изменений активности в любом варианте Ube3a . Кроме того, возможность этого метода позволяет генерировать богатство структурно-функциональной информации, которая может быть использована для получения глубокого понимания ферментативных механизмов UBE3A.
Последние технологические достижения сделали секвенирование экзомов и геномов рутинным в клинических условиях 1,2. Это привело к открытию большого количества генетических вариантов, в том числе миллионов ошибочных вариантов, которые обычно изменяют одну аминокислоту в белке. Понимание функциональной значимости этих вариантов остается проблемой, и только небольшая часть (~ 2%) известных вариантов промахов имеет клиническую интерпретацию 1,3.
Ярким примером этой проблемы является Ube3a, ген, который кодирует убиквитин-лигазу E3, которая нацелена на белки субстрата для деградации4. Ube3a находится в хромосоме 15q11-13 и экспрессируется исключительно из унаследованного матерью аллеля 5,6,7. Наблюдения генетики заболевания убедительно свидетельствуют о том, что недостаточная или чрезмерная активность фермента UBE3A вызывает отчетливые нарушения развития нервной системы. Делеция материнской хромосомы 15q11-13 вызывает синдром Ангельмана (AS)8, расстройство, характеризующееся тяжелой умственной отсталостью, двигательными нарушениями, судорогами, счастливым поведением с частой улыбкой и дисморфическими чертами лица 8,9,10. Напротив, дупликация или трипликация материнской хромосомы 15q11-13 вызывает синдром Dup15q, гетерогенное состояние, признанное одной из наиболее распространенных синдромных форм аутизма 11,12,13. Кроме того, существуют сотни вариантов промахов, идентифицированных в Ube3a, большинство из которых считаются вариантами неопределенной значимости (VUS), поскольку их функциональное и клиническое значение неизвестно. Таким образом, существует значительный интерес к разработке методов, которые могут эмпирически оценить варианты Ube3a, чтобы определить, способствуют ли они заболеванию нервного развития.
Фермент UBE3A принадлежит к семейству доменов HECT (гомологичному E6-AP C-terminus) убиквитиновых лигажей E3, которые все обладают одноименным доменом HECT, который содержит биохимический механизм, необходимый для принятия активированного убиквитина из ферментов E2 и переноса его в субстратные белки14. Исторически сложилось так, что характеристика ферментов E3 основывалась на восстановленных системах in vitro, которые требуют ансамбля очищенных белков 4,15,16. Такие методы медленны и трудоемки и не поддаются оценке активности большого количества вариантов. В предыдущей работе было идентифицировано, что UBE3A активирует путь Wnt в клетках HEK293T путем модуляции функции протеасомы для замедления деградации β-катенина17. Это понимание позволяет использовать репортеры путей Wnt в качестве эффективного и быстрого метода для идентификации вариантов Ube3a18 как потери, так и усиления функции. В приведенном ниже протоколе подробно описан метод генерации вариантов Ube3a, а также репортер на основе люциферазы для оценки изменений активности вариантов Ube3a.
Протокол, описанный здесь, обеспечивает эффективный и масштабируемый метод оценки ферментативной активности вариантов Ube3a. Есть несколько технических деталей, которые требуют тщательного рассмотрения при использовании этого анализа. Одним из соображений является выбор плазмид …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана премией Фонда Саймонса «Мост к независимости» (SFARI Award #387972; J.J.Y.), премия NARSAD Young Investigator Award от Фонда исследований мозга и поведения (J.J.Y.), исследовательская стипендия от Фонда Альфреда. Слоуна (J.J.Y.) и исследовательские гранты от Фонда синдрома Ангельмана (J.J.Y.), Фонда Уайтхолла (J.J.Y.) и NIMH (R01MH122786; Д.Ж.Ю.).
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
pCIG2 plasmid | |||
pGL3 BAR plasmid | |||
Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
pTK Renilla plasmid | |||
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |