Summary
Был разработан простой и масштабируемый метод оценки функциональной значимости вариантов миссенса в Ube3a, гене, потеря и усиление функции которого связаны как с синдромом Ангельмана, так и с расстройством аутистического спектра.
Abstract
Более широкое использование секвенирования в медицине выявило миллионы вариантов кодирования в геноме человека. Многие из этих вариантов встречаются в генах, связанных с нарушениями нервного развития, но функциональное значение подавляющего большинства вариантов остается неизвестным. Настоящий протокол описывает изучение вариантов Ube3a, гена, который кодирует убиквитин-лигазу E3, связанную как с аутизмом, так и с синдромом Ангельмана. Дублирование или трипликация Ube3a тесно связана с аутизмом, тогда как его удаление вызывает синдром Ангельмана. Таким образом, понимание валентности изменений активности белка UBE3A важно для клинических исходов. Здесь описан быстрый клеточный метод, который связывает варианты Ube3a с репортером пути Wnt. Этот простой анализ является масштабируемым и может быть использован для определения валентности и величины изменений активности в любом варианте Ube3a . Кроме того, возможность этого метода позволяет генерировать богатство структурно-функциональной информации, которая может быть использована для получения глубокого понимания ферментативных механизмов UBE3A.
Introduction
Последние технологические достижения сделали секвенирование экзомов и геномов рутинным в клинических условиях 1,2. Это привело к открытию большого количества генетических вариантов, в том числе миллионов ошибочных вариантов, которые обычно изменяют одну аминокислоту в белке. Понимание функциональной значимости этих вариантов остается проблемой, и только небольшая часть (~ 2%) известных вариантов промахов имеет клиническую интерпретацию 1,3.
Ярким примером этой проблемы является Ube3a, ген, который кодирует убиквитин-лигазу E3, которая нацелена на белки субстрата для деградации4. Ube3a находится в хромосоме 15q11-13 и экспрессируется исключительно из унаследованного матерью аллеля 5,6,7. Наблюдения генетики заболевания убедительно свидетельствуют о том, что недостаточная или чрезмерная активность фермента UBE3A вызывает отчетливые нарушения развития нервной системы. Делеция материнской хромосомы 15q11-13 вызывает синдром Ангельмана (AS)8, расстройство, характеризующееся тяжелой умственной отсталостью, двигательными нарушениями, судорогами, счастливым поведением с частой улыбкой и дисморфическими чертами лица 8,9,10. Напротив, дупликация или трипликация материнской хромосомы 15q11-13 вызывает синдром Dup15q, гетерогенное состояние, признанное одной из наиболее распространенных синдромных форм аутизма 11,12,13. Кроме того, существуют сотни вариантов промахов, идентифицированных в Ube3a, большинство из которых считаются вариантами неопределенной значимости (VUS), поскольку их функциональное и клиническое значение неизвестно. Таким образом, существует значительный интерес к разработке методов, которые могут эмпирически оценить варианты Ube3a, чтобы определить, способствуют ли они заболеванию нервного развития.
Фермент UBE3A принадлежит к семейству доменов HECT (гомологичному E6-AP C-terminus) убиквитиновых лигажей E3, которые все обладают одноименным доменом HECT, который содержит биохимический механизм, необходимый для принятия активированного убиквитина из ферментов E2 и переноса его в субстратные белки14. Исторически сложилось так, что характеристика ферментов E3 основывалась на восстановленных системах in vitro, которые требуют ансамбля очищенных белков 4,15,16. Такие методы медленны и трудоемки и не поддаются оценке активности большого количества вариантов. В предыдущей работе было идентифицировано, что UBE3A активирует путь Wnt в клетках HEK293T путем модуляции функции протеасомы для замедления деградации β-катенина17. Это понимание позволяет использовать репортеры путей Wnt в качестве эффективного и быстрого метода для идентификации вариантов Ube3a18 как потери, так и усиления функции. В приведенном ниже протоколе подробно описан метод генерации вариантов Ube3a, а также репортер на основе люциферазы для оценки изменений активности вариантов Ube3a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клонирование мутагенеза для генерации вариантов Ube3a
- Клонируйте все варианты Ube3a в плазмиду pCIG2 (рисунок 1A), бицистронный вектор, который содержит промотор цыпленка-β-актина и внутренний сайт входа рибосомы (IRES) для экспрессии EGFP19. Полноразмерные конструкции Ube3a содержат N-концевую последовательность Myc-тегов и клонируются в pCIG2 с использованием 5' SacI сайта и 3' XmaI сайта. Кроме того, естественные участки EcoRI, EcoRV и PstI в кодирующей последовательности Ube3a также используются для фрагментов субклонов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Деидентифицированные варианты для Ube3a могут быть получены через литературу и в общедоступных репозиториях, таких как база данных ClinVar1. Дополнительные незарегистрированные варианты можно получить через личное общение с медицинскими центрами. - Используйте адаптированный двухступенчатый метод20 мегапраймерного мутагенеза для введения мутаций в кадр считывания Ube3a . На первом этапе спроектируйте мутагенный олигонуклеотид, который содержит желаемую мутацию (пример, показанный в этом протоколе, заключается в генерации варианта UBE3A Q588E), окруженного по меньшей мере 30 парами оснований (bp) гомологии 5' и 3′ к мутации (рисунок 1B и таблица 1).
- Используйте мутагенный олигонуклеотид вместе с комплементарным олигонуклеотидом для первого раунда ПЦР для генерации мегапраймера 200-400 bp, содержащего мутацию (рисунок 1C; Таблица 2 и Таблица 3). Используйте все 50 мкл реакционного объема ПЦР для электрофореза агарозного геля с использованием 1% геля и последующей очистки геля (Таблица материалов). Элюируют продукт ПЦР в 30 мкл деионизированногоH2O(diH2O) для использования на стадии ПЦР второго раунда ниже.
- Настройте ПЦР второго раунда, как указано (рисунок 1С; Таблица 2 и Таблица 3). На этом этапе будут генерироваться более крупные фрагменты ДНК (обычно ~ 1-1,5 кб в длину), содержащие участки мутации и терминального ограничения, подходящие для субклонирования (рисунок 1C).
- После завершения реакции ПЦР очистите полученный продукт с помощью набора для очистки ПЦР (Таблица материалов). Элюируют в 30 мкл и переваривают весь очищенный продукт и конструкцию pCIG2 Ube3a WT с соответствующими ферментами рестрикции (пример показывает пищеварение с помощью EcoRI и XmaI).
- После 2 ч пищеварения при 37 °C растворяют продукты пищеварения посредством агарозного геля электрофореза (1% гель) и гель-очищают соответствующими продуктами. Настройте лигирование в соответствии с протоколом производителя (Таблица материалов), преобразуйте продукты лигирования в бактериальный штамм DH10B (Таблица материалов), а затем пластину с выбором ампициллина (100 мкг/мл).
- На следующий день выберите от двух до четырех колоний, чтобы привить 3 мл культур, содержащих бульон Лурия (LB) и 100 мкг / мл ампициллина. Дайте культурам расти ночью при 37 °C в орбитальном инкубаторе с встряхиванием (225 об/мин).
- На следующий день используйте 1-1,5 мл бактериальной культуры для минипрепа плазмидной ДНК (Таблица материалов). Сохраните оставшиеся культуры, поместив их при температуре 4 °C. Скрининг мини-подготовленных плазмид методом секвенирования Сэнгера с использованием олигонуклеотида, который связывает ~ 200 bp от желаемой мутации.
- Используйте бактериальные культуры, сохраненные при 4 °C, для повторной инокуляции культур 50 мл для мидипрепа правильной плазмиды (Таблица материалов). Полная секвенирование кодирующей последовательности Ube3a для проверки правильной последовательности ДНК.
- Создание рабочих запасов плазмид варианта Ube3a, а также β-катенин-активированного репортера (BAR)21, TK-Ренилла люциферазы, лигазы-мертвой Ube3a (мутация UBE3A C820A) и пустого вектора pCIG2 в концентрации 100 нг/мкл с использованием стерильногоH2Oдля последующих стадий трансфекции.
2. Получение и трансфекция эмбриональных клеток почек человека 293T (HEK293T)
- Проводят анализы в клетках HEK293T, выращенных в модифицированной среде Dulbecco Eagle (DMEM), предварительно дополненной глютамином, 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и антибиотико-антимикотическим агентом, как описано ранее17. Выращивайте клетки в стерильном, увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
- Используя шкаф биобезопасности, сначала нанесите взвешенные клетки HEK293T на обработанные культурой тканей 96-луночные плоскодонные пластины с плотностью 2,2 × 104 клетки на скважину в 100 мкл культуральной среды и позвольте им расти в течение ночи.
- На второй день трансфектируют клетки в шкафу биобезопасности с помощью светлячков и рениллы люциферазы репортерных плазмид (таблица 4) и плазмид Ube3a в трех экземплярах. Выполняют трансфекции в 10 мкл общего объема на лунку, используя соотношение плазмид 10:1:8 (50 нг БАР, 5 нг TK-Renilla и 40 нг плазмиды Ube3a на лунку соответственно), как описано ранее18, и 0,4 мкл трансфекционного реагента (таблица 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого эксперимента пустой вектор (только GFP) и плазмида, кодирующая лигазу Ube3a , также трансфицируются, чтобы служить отрицательными элементами управления. - Создайте мастер-микс для трансфекции для каждого варианта в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл (таблица 4) и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут. После инкубации осторожно перемешивают трансфекционную смесь, постукивая по трубке, а затем добавляют 10 мкл трансфекционной смеси непосредственно в существующие питательные среды в скважинах.
- После этого верните клетки в инкубатор и дайте плазмидам экспрессироваться в течение 48 ч. Замена питательных сред не требуется.
- Мониторинг эффективности трансфекции с помощью флуоресценции GFP с помощью флуоресцентного микроскопа. Клетки HEK293T эффективно трансфектируются этим методом, и >80% клеток должны экспрессировать GFP через 48 ч.
3. Измерение активности люциферазы
ПРИМЕЧАНИЕ: Активность люциферазы оценивается с использованием коммерчески доступной системы, которая анализирует как Светлячка, так и Рениллу люциферазу (Таблица материалов) в соответствии с протоколом производителя.
- Осторожно аспирируйте культуральную среду из трансфектированных клеток HEK293T, а затем промывайте клетки холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS). Аспирировать PBS и лизировать клетки, добавляя 25 мкл неденатурирующего лизисного буфера и инкубировать в течение 15 мин с мягким раскачиванием на льду.
- После этого добавьте 20 мкл полученного лизата (центрифугирование не требуется) в новую 96-луночную пробирную пластину, содержащую 100 мкл реагента субстрата люциферазы Светлячка. Аккуратно перемешайте тарелку постукиванием.
- Загрузите пластину на считыватель пластин и измерьте люминесценцию с помощью верхнего детектора с высотой считывания 1 мм и временем интеграции 1 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент усиления детектора, возможно, потребуется отрегулировать в зависимости от силы сигнала. - Сразу после считывания люминесценции люциферазы светлячка добавьте в лунки 100 мкл субстрата люциферазы Renilla. Этот шаг одновременно утоляет активность люциферазы Светлячка при оценке активности люциферазы Рениллы. Смешайте образцы путем мягкого перемешивания пластины и снова измерьте люминесценцию, чтобы оценить активность люциферазы Renilla .
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как другие пластины могут быть использованы для этого анализа, использование пластин с черными рамками и белыми колодцами обеспечит наиболее чувствительные результаты, поскольку это усиливает сигнал люциферазы при минимизации шума. - Количественно оцените ответы репортера как отношение люциферазы светлячка к люциферазе Рениллы (Firefly/Renilla) и усредните значения трехкратных измерений. После этого нормализуйте значение Firefly/Renilla для каждого варианта по отношению к значениям для клеток Ube3a дикого типа (WT), чтобы сравнить относительную активность альтернативных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Крупномасштабный функциональный скрининг вариантов Ube3a missense выявляет широкий ландшафт мутаций потери и усиления функции
Предыдущая работа с мутантами Ube3a показала, что ответ Wnt может служить репортером активности клеточного белка UBE3A. Эти наблюдения были расширены, и были проведены дополнительные эксперименты по валидации, чтобы выяснить, подходит ли анализ BAR для сообщения о диапазоне активности UBE3A в клетке. Во-первых, клетки HEK293T были трансфектированы различным количеством плазмидной ДНК, кодирующей человеческий WT Ube3a. Этот эксперимент показал, что bar-ответ изменяется линейно с количеством Ube3a, трансфектированного в клетки (рисунок 2A). Во-вторых, анализ BAR был протестирован с использованием плазмидной ДНК, кодирующей связанные с заболеванием варианты, ранее охарактеризованные в литературе22. Среди них были доброкачественные варианты (R39H и A178T), один вариант усиления функции, связанный с аутизмом (T458A), и коллекция подтвержденных вариантов, связанных с синдромом Ангельмана, которые вызывают потерю функции UBE3A через различные механизмы15,22. Анализ BAR правильно идентифицировал каждый вариант (фиг.2B), включая все варианты потери функции, демонстрируя точность и общность этого метода18.
Анализ BAR был использован для скрининга 152 вариантов промахов, большинство из которых были идентифицированы из базы данных ClinVar. Подобно генетическим доказательствам в отношении вариаций числа копий при Ube3a-зависимых расстройствах, функциональное влияние вариантов неправильного восприятия было широким и включало доброкачественные варианты, а также варианты потери функции и усиления функции (рисунок 3)18. Особый интерес представляют варианты усиления функции, идентифицированные с использованием этого метода, и последующая валидация убедительно показала, что они определяют подкласс Ube3a-зависимых расстройств с фенотипами, которые отличаются от классического синдрома Ангельмана18.
Влияние вариантов промахов часто непредсказуемо, что подчеркивает необходимость функциональной оценки.
Интригующее наблюдение из функционального скрининга вариантов Ube3a заключается в том, что изменения в некоторых положениях аминокислот производят совершенно разные эффекты, тем самым подчеркивая важность эмпирической оценки вариантов18. Например, три человека были идентифицированы с вариантами в позиции глутамина 588 (Q588) в UBE3A, которые включали замещение глутамата с усилением функции (Q588E), замещение аргинина с потерей функции (Q588R) и еще одно замещение пролина с потерей функции (Q588P; Рисунок 4А). Комплексный мутационный подход был использован для мутации позиции Q588 во все возможные аминокислоты. Когда активность этих вариантов измеряли с помощью анализа BAR, он показал, что любая отрицательно заряженная аминокислота в положении 588 производит гиперактивный фермент (рисунок 4B). Это понимание предоставило важные функциональные подсказки, которые позволили обнаружить новый сайт в домене HECT UBE3A, который облегчает удлинение цепи убиквитина18.
Рисунок 1: ПЦР-зависимый мутагенез Ube3a. (A) Представление вектора экспрессии Ube3a, указывающего на соответствующие сайты рестрикции. (B) Последовательность ДНК, кодирующая UBE3A, показана вверху. Кодон Q588 выделен жирным шрифтом. Праймер мутагенеза Q588E (Mut. primer) показан выровненным по последовательности UBE3A. Красная буква указывает на мутагенизированный сайт. (C) Показана схема ПЦР для генерации мегапраймера и фрагмента ДНК, используемого для субклонирования фрагмента Q588E. Положение мутации Q588E обозначено красной звездочкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Валидация анализа BAR в качестве репортера активности UBE3A убиквитин-лигазы. (A) Клетки HEK293T, трансфектированные растущим количеством плазмиды, кодирующей WT UBE3A, показывают линейное увеличение ответа BAR. Средние значения показаны для соотношений люциферазы Светлячка/Ренильи ± стандартной погрешности (SE). N= 3 независимых эксперимента. (B) Ранее охарактеризованные варианты Ube3a были протестированы в анализе BAR. Ответы были нормализованы до WT UBE3A, а значения показаны как среднее ± SE. Количество экспериментов (n) и p-значений, рассчитанных с использованием t-теста с одной выборкой (двуххвостый) с поправкой множественных сравнений Бенджамини-Хохберга (FDR = 0,05), выглядит следующим образом: GFP, n = 19, ***p = 1,733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1,519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0,567; A178T, n = 4, p = 0,828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8,725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3,419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7,787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0,0,0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Данные перепечатаны с разрешения Weston et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Варианты UBE3A, охватывающие широкий спектр функциональных эффектов. Экран анализа BAR из 152 вариантов Ube3a , показывающих доброкачественные (серый), потеря функции (синий) и усиление функции (красный) мутации относительно WT UBE3A. Значимость определяли с помощью t-теста с одной выборкой (двуххвостого) с поправкой множественных сравнений Бенджамини-Хохберга (FDR = 0,05). Красный, усиление функции; Серый, без изменений от WT UBE3A; Синий, потеря функции. Данные перепечатаны с разрешения Weston et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Варианты UBE3A, охватывающие широкий спектр функциональных эффектов. (A) Результаты BAR-анализа вариантов в позиции 588 UBE3A, показывающие как потери, так и выигрыши функции. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0,0005, T-тест с одной выборкой (двуххвостый) с множественной сравнительной коррекцией Бенджамини-Хохберга (FDR = 0,05). (B) Тепловой график, показывающий нормализованные результаты BAR для всестороннего мутационного анализа в позиции 588 в UBE3A. Белое затенение представляет уровни активности WT UBE3A, синее затенение указывает на потерю функции, а красное затенение указывает на усиление функции. Шкала показывает процентное изменение относительно WT UBE3A. N = 3 независимых эксперимента для Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C; n = 8 для Q588E, n = 6 для Q588D, n = 5 для Q588R, n = 4 для Q588H, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. T-тест с одной выборкой (двуххвостый) с поправкой на множественные сравнения Бенджамини-Хохберга (FDR = 0,05). Данные перепечатаны с разрешения Weston et al.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Имя | Последовательность | Используется для | |
| Грунтовка 1 | ГАТТАТАТАТГАКААТАГАА TTCGCATGTACAGTGAAC |
Убе3а Смысл EcoRI | |
| Мут. Букварь | CCAGACCCAGTACTATGCCAATCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E мутагенез антисмысловый | |
| Грунтовка 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Убе3а XmaI антисмысл | |
Таблица 1: Праймеры, используемые для мутагенеза UBE3A Q588E.
| ПЦР 1-го раунда | |
| Реагент | Количество реакций |
| 5-кратный буфер высокой точности | 10 мкл |
| дНТП (запас 10 мМ) | 1 мкл |
| Грунтовка 1 (приклад 10 мМ) | 1 мкл |
| Грунтовка 2 (запас 10 мМ) | 1 мкл |
| WT-Ube3a ДНК (запас 150 нг/мкл) | 1 мкл |
| Н2О | 35 мкл |
| Высокоточная ДНК-полимераза | 1 мкл |
| Общий объем | 50 мкл |
| ПЦР 2-го раунда | |
| Реагент | Количество реакций |
| 5-кратный буфер высокой точности | 10 мкл |
| дНТП (запас 10 мМ) | 1 мкл |
| Грунтовка 3 (запас 10 мМ) | 1 мкл |
| Очищенный продукт ПЦР (Megaprimer) | 30 мкл |
| WT-Ube3a ДНК (запас 150 нг/мкл) | 1 мкл |
| Н2О | 6 мкл |
| Высокоточная ДНК-полимераза | 1 мкл |
| Общий объем | 50 мкл |
Таблица 2: Параметры ПЦР при мутагенезе.
| ПЦР 1-го раунда | ||
| Шаг | Температура | Время |
| Начальная денатурация | 95 °С | 2 мин |
| (1 цикл) | ||
| Денатурация | 95 °С | 30 с |
| Отжиг | 50 °С | 20 с |
| Расширение | 72 °С | 15 с |
| (30 циклов) | ||
| Окончательное продление | 72 °С | 1 мин |
| Держать | 4 °С | Бесконечный |
| ПЦР 2-го раунда | ||
| Шаг | Температура | Время |
| Начальная денатурация | 95 °С | 2 мин |
| (1 цикл) | ||
| Денатурация | 95 °С | 30 с |
| Отжиг | 50 °С | 20 с |
| Расширение | 72 °С | 35 с |
| (30 циклов) | ||
| Окончательное продление | 72 °С | 1 мин |
| Держать | 4 °С | Бесконечный |
Таблица 3: Параметры программы ПЦР при мутагенезе.
| Реагент | Рабочая концентрация | 1x трансфекция | 3.5x мастер-микс |
| плазмида pGL3 BAR | 100 нг/мкл | 0.5 мкл | 1.75 мкл |
| pTK Плазмида Рениллы | 100 нг/мкл | 0.05 мкл | 0.175 мкл |
| Плазмида Ube3a | 100 нг/мкл | 0.4 мкл | 1.4 мкл |
| DMEM с добавлением глутамина | 8.65 мкл | 30.275 мкл | |
| Трансфекционный реагент | 0.4 мкл | 1.4 мкл |
Таблица 4: Трансфекционные смеси.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, обеспечивает эффективный и масштабируемый метод оценки ферментативной активности вариантов Ube3a. Есть несколько технических деталей, которые требуют тщательного рассмотрения при использовании этого анализа. Одним из соображений является выбор плазмид репортера Wnt, используемых в этом анализе. Протокол, описанный здесь, специально использует β-катенин-активированный репортер (BAR)21, репортер, который содержит конкатемер 12 элементов ответа Т-клеточного фактора (TCF), разделенных специально разработанными последовательностями компоновщика для минимизации рекомбинации и потери сайтов связывания TCF. Существуют дополнительные репортерные плазмиды Wnt на основе люциферазы, описанные в литературе23, и хотя предыдущие исследования показывают, что некоторые из них могут быть использованы для оценки активности UBE3A, плазмида BAR была наиболее тщательно охарактеризована для этой цели17,18. Во-вторых, выбор плазмиды Люциферазы Рениллы имеет решающее значение. Плазмида, кодирующая renilla luciferase, включается на стадии трансфекции для нормализации эффективности трансфекции. Плазмида, используемая в этом протоколе, конститутивно экспрессирует люциферазу Renilla под контролем промотора тимидинкиназы (TK) (TK-Renilla). Использование плазмид, содержащих другие промоторы, такие как широко используемый промотор цитомегаловируса (ЦМВ), может привести к переменным результатам в экспрессии люциферазы Renilla.
Вторым соображением является поведение клеток в зависимости от типа и количества FBS, используемых для клеточной культуры. Например, FBS может по-разному влиять на скорость роста клеток HEK293T. Текущий протокол был оптимизирован с ячейками, демонстрирующими типичное время удвоения 18-24 ч, что делает плотность клеток во время трансфекции примерно ~ 4 × 104 ячейки на лунку. Поскольку плотность клеток может влиять на эффективность трансфекции, скорость роста клеток должна быть тщательно оценена пользователем, а количество клеток соответствующим образом скорректировано во время покрытия. Кроме того, UBE3A-зависимый BAR-ответ требует некоторого количества Wnt лиганда, присутствующего во время эксперимента. В большинстве стандартных условий в FBS достаточно Wnt для управления этим ответом; однако эта реакция также может варьироваться. Титрование соотношений плазмид, используемых для трансфекции, рекомендуется для обеспечения того, чтобы реакция BAR измерялась в соответствующем линейном диапазоне. Альтернативный подход заключается в стимуляции передачи сигналов Wnt с использованием рекомбинантного лиганда Wnt или Wnt-дополненной среды роста17.
Преимущество анализа BAR заключается в том, что он может сообщать об активности убиквитин-лигазы всех изоформ Ube3a . Люди экспрессируют три изоформы Ube3a , которые отличаются в своем крайнем N-термине из-за использования альтернативных транскрипционных стартовых сайтов24. Анализ BAR обеспечивает одинаковое считывание, не зависящее от изоформ, и, таким образом, этот анализ может быть использован для оценки всех вариантов Ube3a . Кроме того, крупномасштабная характеристика вариантов Ube3a предоставляет глубокие структурно-функциональные данные, которые могут раскрыть новые домены и механизмы, которые имеют решающее значение для функции фермента. Предыдущее исследование использовало вариантные данные для обнаружения убиквитин-связывающего домена в UBE3A, который облегчает удлинение цепи убиквитина18. Дополнительные исследования структуры и функции, вероятно, дадут новое представление о биохимических механизмах UBE3A, которые могут быть использованы для терапевтического развития.
Существуют некоторые ограничения для анализа BAR, которые требуют тщательного рассмотрения при определении патогенности варианта. Из-за эпигенетического импринтинга Ube3a в нейронах этот анализ не может различать материнские и отцовские аллели, и дополнительные генетические доказательства должны быть взвешены вместе с функциональными данными для определения патогенности варианта. Кроме того, дополнительные переменные, выходящие за рамки активности убиквитин-лигазы UBE3A, должны рассматриваться в контексте заболевания. Например, предыдущая работа показала, что ядерно-локализованный UBE3A способствует патологии синдрома Ангельмана25 и что некоторые варианты нарушают эту схему локализации фермента26. Таким образом, необходимо выполнить дополнительные последующие характеристики, чтобы получить полное представление о вкладе вариантов Ube3a в патологию развития нервной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана премией Фонда Саймонса «Мост к независимости» (SFARI Award #387972; J.J.Y.), премия NARSAD Young Investigator Award от Фонда исследований мозга и поведения (J.J.Y.), исследовательская стипендия от Фонда Альфреда. Слоуна (J.J.Y.) и исследовательские гранты от Фонда синдрома Ангельмана (J.J.Y.), Фонда Уайтхолла (J.J.Y.) и NIMH (R01MH122786; Д.Ж.Ю.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
