En skalbar, cellbaserad metod för funktionsbedömning av Ube3a-varianter
Summary
En enkel och skalbar metod utvecklades för att bedöma den funktionella betydelsen av missensevarianter i Ube3a, en gen vars förlust och funktionsförstärkning är kopplad till både Angelmans syndrom och autismspektrumstörning.
Abstract
Den ökade användningen av sekvensering inom medicin har identifierat miljontals kodande varianter i det mänskliga genomet. Många av dessa varianter förekommer i gener associerade med neurodevelopmental störningar, men den funktionella betydelsen av de allra flesta varianter är fortfarande okänd. Det nuvarande protokollet beskriver studien av varianter för Ube3a, en gen som kodar för en E3 ubiquitin-ligas kopplad till både autism och Angelmans syndrom. Duplicering eller tredubbling av Ube3a är starkt kopplad till autism, medan dess radering orsakar Angelmans syndrom. Således är det viktigt för kliniska resultat att förstå valensen av förändringar i UBE3A-proteinaktivitet. Här beskrivs en snabb, cellbaserad metod som parar ihop Ube3a-varianter med en Wnt-vägreporter. Denna enkla analys är skalbar och kan användas för att bestämma valensen och storleken på aktivitetsförändringar i alla Ube3a-varianter . Dessutom möjliggör anläggningen för denna metod generering av en mängd strukturfunktionsinformation, som kan användas för att få djupa insikter i de enzymatiska mekanismerna för UBE3A.
Introduction
De senaste tekniska framstegen har gjort sekvenseringen av exomer och genom rutin i kliniska miljöer 1,2. Detta har lett till upptäckten av ett stort antal genetiska varianter, inklusive miljontals missense-varianter som vanligtvis förändrar en aminosyra i ett protein. Att förstå den funktionella betydelsen av dessa varianter är fortfarande en utmaning, och endast en liten bråkdel (~ 2%) av de kända missense-varianterna har en klinisk tolkning 1,3.
Ett framträdande exempel på detta problem är Ube3a, en gen som kodar för en E3 ubiquitin-ligas som riktar sig mot substratproteiner för nedbrytning4. Ube3a finns inom kromosom 15q11-13 och uttrycks uteslutande från den moderligt ärvda allelen 5,6,7. Observationer från sjukdomsgenetik tyder starkt på att otillräcklig eller överdriven aktivitet hos UBE3A-enzymet orsakar distinkta neuroutvecklingsstörningar. Radering av moderns kromosom 15q11-13 orsakar Angelmans syndrom (AS)8, en störning som kännetecknas av allvarlig intellektuell funktionsnedsättning, motoriska funktionsnedsättningar, anfall, ett lyckligt uppträdande med frekvent leende och dysmorfa ansiktsdrag 8,9,10. Däremot orsakar duplicering eller tredubbling av moderns kromosom 15q11-13 Dup15q syndrom, ett heterogent tillstånd som erkänns som en av de vanligaste syndromiska formerna av autism11,12,13. Dessutom finns det hundratals missense-varianter identifierade i Ube3a, varav de flesta betraktas som varianter av osäker betydelse (VUS) eftersom deras funktionella och kliniska betydelse är okänd. Det finns således ett stort intresse för att utveckla metoder som empiriskt kan bedöma Ube3a-varianter för att avgöra om de bidrar till utvecklingsneurologisk sjukdom.
UBE3A-enzymet tillhör HECT-domänfamiljen (homolog till E6-AP C-terminus) av E3-ubiquitin-ligaser som alla har den eponymous HECT-domänen, som innehåller det biokemiska maskineriet som är nödvändigt för att acceptera aktiverat ubiquitin från E2-enzymer och överföra det till substratproteiner14. Historiskt sett har karakteriseringen av E3-enzymer förlitat sig på rekonstituerade in vitro-system som kräver en ensemble av renade proteiner 4,15,16. Sådana metoder är långsamma och arbetsintensiva och inte mottagliga för att bedöma aktiviteten hos ett stort antal varianter. I tidigare arbete identifierades UBE3A för att aktivera Wnt-vägen i HEK293T-celler genom att modulera proteasomens funktion för att bromsa nedbrytningen av β-catenin-17. Denna insikt gör det möjligt att använda Wnt-vägreportrar som en effektiv och snabb metod för att identifiera både förlust- och förstärkningsvarianter av Ube3a18. Protokollet nedan beskriver i detalj en metod för att generera Ube3a-varianter samt en luciferasbaserad reporter för att bedöma förändringar i aktiviteten hos Ube3a-varianter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger en effektiv och skalbar metod för att bedöma den enzymatiska aktiviteten hos Ube3a-varianter. Det finns flera tekniska detaljer som motiverar noggrant övervägande när du använder denna analys. Ett övervägande är valet av Wnt-reporterplasmider som används i denna analys. Protokollet som beskrivs här använder specifikt β-catenin-aktiverad reporter (BAR)21, en reporter som innehåller en sammanfogare av 12 T-cellfaktorsvarselement (TCF) separera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; JJY), ett NARSAD Young Investigator Award från Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), ett forskningsstipendium från Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.) och forskningsbidrag från Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), Whitehall Foundation (J.J.Y.) och NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
