Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تقييم السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري باستخدام نموذج فأر Xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64535
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1,2, 1,2, 6, 6, 1,2, 1,2, 6, 1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

ERRATUM NOTICE

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا يتم فيه استخدام نموذج xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد كاستراتيجية لتقييم ومراقبة السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري التي تستهدف CD19.

Abstract

برز العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CART) كأداة قوية لعلاج أنواع متعددة من الأورام الخبيثة CD19 + ، مما أدى إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية مؤخرا على العديد من علاجات الخلايا CART (CART19) التي تستهدف CD19. ومع ذلك ، يرتبط العلاج بالخلايا CART بمجموعة فريدة من السميات التي تحمل معدلات المراضة والوفيات الخاصة بها. وهذا يشمل متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والالتهاب العصبي (NI). كان استخدام نماذج الفئران قبل السريرية أمرا حاسما في البحث والتطوير لتكنولوجيا CART لتقييم كل من فعالية CART وسمية CART. تشمل النماذج قبل السريرية المتاحة لاختبار هذا العلاج المناعي الخلوي بالتبني نماذج الفئران الجينية ، و xenograft ، والمعدلة وراثيا ، والإنسانية. لا يوجد نموذج واحد يعكس بسلاسة جهاز المناعة البشري ، ولكل نموذج نقاط قوة وضعف. تهدف ورقة الطرق هذه إلى وصف نموذج xenograft المشتق من المريض باستخدام أرومات اللوكيميا من المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي الحاد كاستراتيجية لتقييم السمية المرتبطة ب CART19 ، CRS ، و NI. وقد ثبت أن هذا النموذج يلخص السمية المرتبطة ب CART19 بالإضافة إلى الفعالية العلاجية كما رأينا في العيادة.

Introduction

أحدث العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CART) ثورة في مجال العلاج المناعي للسرطان. لقد أثبت نجاحه في علاج سرطان الدم الليمفاوي الحاد الانتكاسي / المقاوم (ALL) ، وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح ، وسرطان الغدد الليمفاوية الجريبي ، والورم النقوي المتعدد1،2،3،4،5،6،7 ، مما أدى إلى موافقات إدارة الغذاء والدواء الأخيرة. على الرغم من النجاح الأولي في التجارب السريرية ، فإن العلاج بخلايا CART يؤدي إلى سميات غالبا ما تكون شديدة ومميتة في بعض الأحيان. تشمل السميات الأكثر شيوعا بعد العلاج بخلايا CART تطوير CRS و NI ، والتي يشار إليها أيضا باسم متلازمة السمية العصبية المرتبطة بالخلايا المستجيبة المناعية (ICANS) 8,9. يحدث CRS بسبب الإفراط في التنشيط والتوسع الهائل لخلايا CART في الجسم الحي ، مما يؤدي إلى إفراز لاحق للعديد من السيتوكينات الالتهابية ، بما في ذلك γ الإنترفيرون ، وعامل نخر الورم α ، وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) ، والإنترلوكين -6 (IL-6). هذا يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم ، وارتفاع في درجة الحرارة ، ومتلازمة تسرب الشعيرات الدموية ، وفشل الجهاز التنفسي ، وفشل متعدد الأعضاء ، وفي بعض الحالات ، الموت10,11. يتطور CRS في 50-100٪ من الحالات بعد العلاج بالخلايا CART1911،12،13. ICANS هو حدث ضار فريد آخر مرتبط بالعلاج بخلايا CART ويتميز بالوذمة الدماغية المعممة ، والارتباك ، والانقطاع ، وفقدان القدرة على الكلام ، والضعف الحركي ، وأحيانا النوبات 9,14. تحدث أي درجة من ICANS في ما يصل إلى 70٪ من المرضى ، ويتم الإبلاغ عن الدرجات 3-4 في 20-30٪ من المرضى5،10،15،16. بشكل عام ، CRS و ICANS شائعان ويمكن أن يكونا قاتلين.

تمثل إدارة ICANS بعد العلاج بالخلايا CART تحديا. يعاني معظم المرضى الذين يعانون من ICANS أيضا من CRS17 ، والذي يمكن علاجه غالبا باستخدام مضاد مستقبلات IL-6 توسيليزوماب أو المنشطات18. كشف تقرير سابق أن التدخل المبكر مع توسيليزوماب قلل من معدل CRS الشديد ولكنه لم يؤثر على حدوث أو شدة ICANS19. في الوقت الحالي ، لا يوجد علاج فعال أو عامل وقائي ل ICANS ، ومن الأهمية بمكان التحقيق في الاستراتيجيات الوقائية20.

يعتقد أن الخلايا النخاعية والسيتوكينات / الكيموكينات المرتبطة بها هي الدوافع الرئيسية لتطوير CRS و ICANS21. في حين أن CRS يرتبط ارتباطا مباشرا بالارتفاع الشديد للسيتوكينات وتوسع الخلايا التائية ، فإن الفيزيولوجيا المرضية ل ICANS غير معروفة إلى حد كبير22,23. لذلك ، من الضروري إنشاء نموذج فأر يلخص هذه السميات بعد العلاج بخلايا CART لدراسة الآليات وتطوير الاستراتيجيات الوقائية.

هناك العديد من النماذج الحيوانية قبل السريرية المستخدمة حاليا لدراسة وتحسين والتحقق من فعالية خلايا CART ، وكذلك لمراقبة السمية المرتبطة بها. وتشمل هذه الفئران الوراثية ، والطعم الأجنبي ، والمعدلة وراثيا ذات الكفاءة المناعية ، والمعدلة وراثيا المتوافقة مع البشر ، والفئران المشتقة من المريض ، بالإضافة إلى نماذج الرئيسيات. ومع ذلك ، فإن كل نموذج من هذه النماذج له عيوب ، وبعضها لا يعكس الفعالية الحقيقية أو مخاوف السلامة لخلايا CART24,25. لذلك ، لا بد من اختيار أفضل نموذج بعناية للأهداف المقصودة من الدراسة.

تسعى هذه المقالة إلى وصف المنهجية المستخدمة لتقييم السميات المرتبطة بخلايا CART ، CRS و NI ، باستخدام نموذج xenograft المشتق من المريض (PDX) في الجسم الحي (الشكل 1). على وجه التحديد ، في الطرق الموضحة هنا ، يتم استخدام خلايا CART19 التي تم إنشاؤها في مختبر المؤلفين باتباع البروتوكولات الموصوفة مسبقا. باختصار ، يتم عزل الخلايا التائية البشرية من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية من متبرع سليم (PBMCs) عبر تقنية تدرج الكثافة ، ويتم تحفيزها بخرز CD3 / CD28 في اليوم 0 ، ويتم تحويلها عدسيا في اليوم الأول مع CARs المكونة من جزء متغير أحادي السلسلة يستهدف CD19 يندمج في مجالات إشارات 4-1BB و CD3ζ. ثم يتم توسيع خلايا CART هذه ، وإزالة الخرز في اليوم 6 ، وحفظها بالتبريد في اليوم 826،27،28،29،30. كما هو موضح سابقا ، تخضع الفئران للعلاج اللمفاوي المستنفد ، يليه إعطاء أرومات اللوكيميا المشتقة من المريض (ALL)28. أولا ، يتم التحقق من تطعيم الورم عن طريق جمع الدم تحت الفك السفلي. بعد إنشاء عبء الورم المناسب ، يتم إعطاء خلايا CART19 للفئران. بعد ذلك ، يتم وزن الفئران يوميا لتقييم الرفاهية. يتم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة (MRI) لتقييم NI ، جنبا إلى جنب مع نزيف الذيل لتقييم توسع الخلايا التائية وإنتاج السيتوكين / الكيموكين. يوصى بشدة باستخدام التقنيات الموضحة أدناه كنموذج لدراسة السميات المرتبطة بخلايا CART في نموذج PDX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع ل Mayo Clinic، واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC A00001767)، واللجنة المؤسسية للسلامة الحيوية (IBC، Bios00000006.04).

ملاحظة: يجب أن تكون جميع المواد المستخدمة للعمل مع الفئران معقمة.

1. حقن بوسلفان لفئران NSG

  1. احصل على ذكور ، من عمر 8-12 أسبوعا ، تعاني من نقص المناعة ، NOD-SCID IL2rγnull (NSG) الفئران ، ووزنها قبل الحقن.
    ملاحظة: للدلالة الإحصائية ، يوصى باستخدام خمسة فئران على الأقل لكل مجموعة وتكرار هذه التجربة مرة أخرى على الأقل مع إناث الفئران.
  2. تحضير بوسلفان للحقن داخل الصفاق (i.p.) باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل ، املأ المحقنة ببطء وبعناية ب 30 مجم / كجم بالضبط من بوسلفان ، متبوعا بحقن i.p للفئران ، وضعها مرة أخرى في القفص.

2. حقن جميع الانفجارات المشتقة من المريض (CD19 +) لفئران NSG

ملاحظة: يتبع هذا البروتوكول إرشادات لجنة السلامة الحيوية المؤسسية في Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

  1. جمع أرومات اللوكيميا الأولية من الدم المحيطي للمرضى الذين يعانون من ابيضاض الدم العضلي الحاد الانتكاسي والمقاوم للحرارة.
  2. تحضير الخلايا المستهدفة للحقن في الوريد (IV).
    1. عد الخلايا المستهدفة CD19 + باستخدام مقياس الدم ، وسجل الحجم النهائي وتركيز الخلايا.
      ملاحظة: لتحديد صلاحية الخلية ، يوصى بشدة باستخدام التريبان الأزرق أثناء عد الخلايا.
    2. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي يبلغ 50 × 106 خلايا / مل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وضعها على الجليد.
    4. دوامة الإصبع أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل الذي يحتوي على الخلايا المستهدفة حتى يتم تجانس الخلايا تماما.
    5. باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل ، املأ المحقنة ببطء وبعناية ب 100 ميكرولتر بالضبط من الخلايا المستهدفة المحضرة ، وحرك المحقنة لإزالة الفقاعات.
      ملاحظة: حجم 100 ميكرولتر سيدير 5 × 106 خلايا لكل ماوس.
    6. ضع الفئران تحت ضوء دافئ لمدة 5-10 دقائق. بمجرد أن يصبح الوريد الذيل محتقنا وأكثر وضوحا للعين المجردة ، ضع الفئران في غرفة حبس / تقييد مناسبة.
    7. امسح ذيل الماوس بمسحة كحول. حقن الخلايا المستهدفة مباشرة في الوريد الذيل (IV) ، ووضع الماوس مرة أخرى في القفص. بعد تلقيح الخلايا المستهدفة ، راقب الفئران يوميا أو على النحو الموصى به من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية.

3. تقييم تطعيم الورم

  1. بدءا من 6 أسابيع بعد حقن الخلية المستهدفة ، قم بتقييم تطعيم الورم باستخدام قياس التدفق الخلوي لقياس تعبير خلايا CD19 + في الدم المحيطي.
  2. فحص الدم المحيطي لتقييم توسع CD19 +
    1. سحب الدم من الفئران بعد 6-8 أسابيع من حقن خلية CART19.
      ملاحظة: يمكن استخدام عدة طرق لسحب الدم. بالنسبة لهذا البروتوكول ، فإن جمع الدم تحت الفك السفلي هو الطريقة المفضلة للاختيار.
    2. تخدير الماوس مع isoflurane في غرفة التعريفي مع 5 ٪ isoflurane. بمجرد الحصول على التخدير ، حافظ على 1-3٪ إيزوفلوران يستنشق من خلال مخروط الأنف.
      ملاحظة: يوصى بشدة بوضع مرهم العيون لمنع جفاف العين.
    3. أخرج الفأر من الحجرة ، وأمسك الماوس باليد غير المهيمنة عن طريق إمساك الجلد الرخو على الرقبة. ثقب الوريد مع لانسيت خلف الفك السفلي قليلا.
      ملاحظة: مطلوب فقط طرف الإبرة (1-2 مم) لدخول الوريد.
    4. أثناء تقطير الدم ، اجمع ما لا يقل عن 50 ميكرولتر في أنبوب مغلف بالهيبارين ، واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب لأعلى ولأسفل عدة مرات. انقل 30 ميكرولتر من الدم إلى أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل.
      ملاحظة: بالنسبة للدم المتبقي، قم بتدوير الأنبوب لأسفل عند 17000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المصل (طبقة طافت) إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وموسوم سعة 1.5 مل ، وقم بتخزينه في -80 درجة مئوية (للاستخدام في فحص السيتوكين).
    5. أضف 2 مل من محلول التحلل (10x محلول تحلل قائم على كلوريد الأمونيوم مخفف إلى 1x باستخدام ماء خال من النيوكلياز) في الأنبوب القاعي المستدير سعة 5 مل الذي يحتوي على الدم. تخلط جيدا عن طريق دوامة الأنبوب. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لضمان التحلل السليم لخلايا الدم الحمراء.
    6. أضف 2 مل من محلول التدفق (PBS ، 0.2 جم / لتر من كلوريد البوتاسيوم ، 0.2 جم / لتر من فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، 8 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 1.15 جم / لتر من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني و 1٪ أزيد الصوديوم).
    7. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية ، وأضف 2 مل من المخزن المؤقت للتدفق. كرر خطوة الغسيل هذه 2x.
    8. صب بعناية محتويات الأنبوب. راقب كمية صغيرة من السوائل مع وجود حبيبات متبقية في الأنبوب. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتدفق ، وأعد التعليق جيدا.
    9. انقل كل السائل المتبقي في أنبوب التدفق سعة 5 مل إلى صفيحة 96 بئرا. تأكد من تسمية كل عينة بشكل صحيح. أضف 100 ميكرولتر من مخزن التدفق إلى الآبار المقابلة وأجهزة الطرد المركزي لوحة 96 بئرا عند 650 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. تقييم توسع الخلايا المستهدفة CD19 + عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 2).
    1. قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على 0.3 ميكرولتر من البقع الحية / الميتة ، و 0.13 ميكروغرام (2.5 ميكرولتر) من الجسم المضاد CD19 المضاد للإنسان ، و 0.06 ميكروغرام (2.5 ميكرولتر) من الجسم المضاد CD45 المضاد للإنسان ، و 5 ميكروغرام (2.5 ميكرولتر) من CD45 المضاد للفأر ، و 42.2 ميكرولتر من مخزن التدفق المؤقت لما مجموعه 50 ميكرولتر لكل عينة. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    2. يغسل ب 150 ميكرولتر من محلول التدفق متبوعا بالطرد المركزي عند 650 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات في 195 ميكرولتر من مخزن التدفق و 5 ميكرولتر من عد الخرز.
    3. الحصول على مقياس التدفق الخلوي لتحديد مستوى تعبير خلية CD19 + . لأغراض البوابات والتحليل ، قم أولا ببوابة السكان محل الاهتمام (CD19 +) بناء على خصائص التشتت الأمامي مقابل الجانبي ، متبوعا بمجموعة بوابات واحدة ، ثم الخلايا الحية. بمجرد بوابة الخلايا الحية ، قم بتقييم CD45 البشري مقابل مجموعة CD45 للفأر ، ومن السكان البشريين ، قم ببوابة السكان المستهدفين CD19 + .
  4. حدد الكمية لتحديد الكمية الموجودة في 70 ميكرولتر ، ثم عبر عنها في الخلايا / ميكرولتر باستخدام المعادلة (1):
    عدد خلايا CD19 + المطلق = ([خلايا CD19 + / عد الخرزات] × عدد حبات العد في حدود 5 ميكرولتر) / 70
    ملاحظة: كرر فحص الدم المحيطي كل 5 أيام لتقييم توسع خلايا CD19 + . جمع ما لا يزيد عن 200 ميكرولتر من الدم بشكل تراكمي كل أسبوعين وفقا لإرشادات لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية. بمجرد أن تصل الفئران إلى عبء المرض البالغ ≥10 خلايا / ميكرولتر ، يتم اختيارها عشوائيا إلى خلية CART19 أو مجموعات التحكم (القسم 4).

4. إدارة خلايا CART19 في الجسم الحي

  1. تحضير خلايا CART19 (~ يوم 80):
    ملاحظة: تم نشر جيل خلايا CART19 مسبقا27،30،31. يجب تنفيذ هذا الإجراء داخل خزانة السلامة البيولوجية المستوى 2+ باستخدام تقنية التعقيم ومعدات الحماية الشخصية.
    1. قم بإذابة خلايا CART19 في وعاء حمام مائي (37 درجة مئوية). ثم اغسل الخلايا في وسط الخلايا التائية الدافئة (TCM) لإزالة ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
      ملاحظة: يتكون الطب الصيني التقليدي من 10٪ مصل AB البشري (v / v) ، و 1٪ البنسلين - الستربتومايسين - الجلوتامين (v / v) ، ووسط الخلية المكونة للدم الخالي من المصل27،30.
    2. قم بطرد خلايا CART19 عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وأعد تعليقها في TCM الدافئ إلى تركيز نهائي قدره 2 × 106 خلايا / مل. اترك خلايا CART ترتاح في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) طوال الليل ولكن لمدة لا تزيد عن 16 ساعة.
  2. إعطاء خلايا CART19 عن طريق الحقن الوريدي (يوم ~ 80)
    1. عد خلايا CART19 ، وقم بتدويرها لأسفل عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. أعد تعليق خلايا CART19 ب 10 مل من PBS ، وقم بتدويرها لأسفل عند 300 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. أعد تعليق خلايا CART19 إلى تركيز نهائي يبلغ 40 × 106 خلايا / مل باستخدام برنامج تلفزيوني ، وانقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل ، وضعها على الجليد.
    4. قم بإجراء حقن الوريد الذيل للخلايا CART19 (كما هو مفصل أعلاه) عن طريق حقن 100 ميكرولتر من الخلايا المعلقة i.v.
      ملاحظة: حجم 100 ميكرولتر سيدير 4 × 106 خلايا لكل ماوس. قم بتضمين مجموعة من الفئران غير المعالجة كعنصر تحكم سلبي.

5. تقييم السمية المرتبطة بالخلايا CART19

  1. بعد إعطاء خلية CART19 ، راقب الفئران 2x يوميا لتقييم أي تغييرات في رفاهيتها ، مثل ضعف الحركة والجسم المنحني وفقدان وزن الجسم.
    ملاحظة: كل هذه التغييرات الجسدية ترتبط بأعراض CRS في هذا النموذج28.
  2. بمجرد أن تبدأ الفئران في تطوير ضعف الحركة وانخفاض الوزن (انخفاض بنسبة 10-20٪ من خط الأساس) ، قم بجمع الدم المحيطي لتحليل عبء الورم وإجراء عزل المصل للسيتوكينات وفقا للمنهجية الموضحة في القسم 3 (الشكل 3).
  3. قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في المصل عند -80 درجة مئوية ، واستخدم الأمصال لتحليل الكيموكينات والسيتوكينات باستخدام مقايسة Multiplex (الشكل 4).
    ملاحظة: إذا ظهرت على الفئران علامات شلل الأطراف الخلفية ، وبدت محتضرة أو خاملة ، وكان فقدان الوزن > 20٪ من وزن الجسم حتى النقطة التي تحد من قدرتها على الوصول إلى الطعام و / أو الماء ، فستتعرض للقتل الرحيم.

6. التصوير بالرنين المغناطيسي

ملاحظة: تم استخدام ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي قبل السريري (للحيوانات الصغيرة) مع مغناطيس تجويف عمودي للرنين المغناطيسي في الجسم الحي والحصول على الصور32،33.

  1. امزج 120 ميكرولتر من الجادولينيوم + 880 ميكرولتر من محلول ملحي ، وقم بتحميله في حقنة أنسولين سعة 1 مل. حقن 100 ميكرولتر في كل فأر (أي p.).
    ملاحظة: يجب حقن الجادولينيوم قبل 15-20 دقيقة من بدء التجربة.
  2. تخدير الماوس باستخدام الأيزوفلوران (2-3٪) في غرفة الحث لمدة 10-15 دقيقة.
    ملاحظة: يوصى بشدة بوضع مرهم العيون لمنع جفاف العين.
  3. ضع العمود الفقري للفأر على مسبار المهد المتوافق مع القوارض. ثم ، تابع وضع الماوس عن طريق ربط أسنانه على شريط اللدغة.
  4. اسحب رأس الماوس إلى ملف الحجم 25 مم ، واضبط مخروط الأنف المربوط بنظام التخدير isoflurane. أحكم ربط مقبض شريط العضة للحفاظ على الوضع طوال مدة الفحص.
    ملاحظة: في حالة إجراء فحص التصوير بالرنين المغناطيسي المعزز بالتباين ، تأكد من حقن الجادولينيوم (في هذه الحالة) أو عامل التباين قبل 10 دقائق على الأقل من وضع الجهاز في مغناطيس التجويف. طوال فترة التصوير ، سيتم تخدير الفئران عن طريق استنشاق 2-3 ٪ إيزوفلوران في الهواء عبر مخروط الأنف ، وسيتم مراقبة معدل التنفس في وقت واحد.
  5. لتقييم التنفس ، استخدم جهاز مراقبة التنفس / التنفس.
    ملاحظة: من المهم تقييم درجة حرارة الجسم أيضا من أجل منع انخفاض حرارة الجسم المحتمل بسبب التعرض الطويل للتخدير. يوصى باستخدام منصات الحرارة للتحكم في درجة حرارة الجسم.
    1. قم بتوصيل مسبار مراقبة التنفس بالقرب من الحجاب الحاجز ، وقم بتثبيته بشريط جراحي. حافظ على معدل التنفس بين 20-60 نفسا في الدقيقة حتى تكون حالة الفأر مستقرة.
      ملاحظة: يوفر هذا المعدل صور تصوير بالرنين المغناطيسي أكثر استقرارا ويمنع حدوث آثار الحركة في الصورة التي تم الحصول عليها. إذا كان معدل التنفس أعلى من 20-60 نفسا في الدقيقة ، فقم بزيادة تركيز الأيزوفلوران. إذا كان معدل التنفس أقل من 20 نفسا في الدقيقة ، يكون التخدير عميقا جدا. لذلك ، يجب تقليل التركيز.
  6. أدخل مسبار الحيوان في التجويف الصغير داخل نظام التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة ذو التجويف الرأسي. اضبط رأس الحيوان في وسط الملف. قم بتأمين الجهاز بالقفل حتى يتمكن من الوقوف في وضع مستقيم ، وقم بتوصيل الجهاز بالكمبيوتر.
  7. افتح البرنامج واستخدمه (على سبيل المثال ، Paravision) لإعداد مواضع الفحص وأنواع عمليات الفحص. تحديد المواضع المحورية والسهمية المثلى مع الحفاظ على اتساقها لجميع المجموعات التجريبية.
    ملاحظة: يوصى باستخدام الحصول على فحص تجريبي كمرجع قبل فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي الفعلية كاملة الطول.
  8. تابع جمع بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي (كما هو موضح سابقا32،34،35،36). احصل على كل من صور التصوير بالرنين المغناطيسي المرجحة T1 و T2 باستخدام الإعداد المقترح المذكور أدناه.
    1. بالنسبة لصور التصوير بالرنين المغناطيسي المرجحة T1 ، استخدم تسلسل متعدد الصدى متعدد الشرائح (MSME) مرجح T1 مع وقت تكرار (TR) يبلغ 300 مللي ثانية ، وزمن صدى (TE) يبلغ 9.5 مللي ثانية ، ومجال رؤية (FOV) يبلغ 4 سم × 2 سم × 2 سم ، ومصفوفة 192 × 96 × 96.
    2. بالنسبة لصور التصوير بالرنين المغناطيسي المرجحة T2 ، استخدم تسلسل Multislice Multiecho (MSME) مع TR من 300 مللي ثانية ، و TE من 9.5 مللي ثانية ، ومجال الرؤية من 4 سم × 2 سم × 2 سم ، ومصفوفة من 192 × 96 × 96 تم استخدامها.
  9. بمجرد اكتمال عمليات الفحص ، قم بإزالة المسبار من التجويف. استخراج الماوس برفق عن طريق إزالة الأسنان من شريط اللدغة. راقب الحيوان في قفص منفصل حتى يصبح واعيا تماما ويستعيد الوظيفة الحركية الكافية.
  10. بعد استخراج البيانات من البرنامج ، استخدم برنامج التحليل للقياس الكمي وتقديم حجم 3D (الشكل 4) لمناطق فرط الكثافة.
    ملاحظة: إذا أمكن، يشجع بشدة على وجود مراقبين منفصلين أعمى لتحليل البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الهدف من هذا البروتوكول هو تقييم السمية المرتبطة بخلايا CART باستخدام نموذج الفئران PDX من الخلايا السرطانية للمرضى الذين يعانون من ALL (الشكل 1). أولا ، تلقت الفئران NSG حقن i.p. من بوسلفان (30 ملغم / كغم) بهدف كبت المناعة لهم وتسهيل تطعيم خلايا CART28. في اليوم التالي ، تلقوا ~ 5 × 106 PBMCs (IV) مشتقة من جميع المرضى. تمت مراقبة الفئران من أجل النقش لمدة ~ 13 أسبوعا عن طريق مقايسة نزيف الذيل. تم جمع خلايا الدم الحمراء وتحليلها ، متبوعا بإعداد قياس التدفق الخلوي لتقييم تعبير الخلايا السرطانية CD19 + (الشكل 2).

بمجرد وصول الفئران إلى ≥10 خلايا سرطانية / ميكرولتر ، تم اختيارها عشوائيا وإعدادها لتلقي 4 × 106 خلايا CART19 (i.v.). لتقييم السمية المرتبطة ب CART19 ، تم وزن الفئران مرة واحدة يوميا (الشكل 3 أ). تم اختيار فقدان الوزن كعرض من أعراض مظهر CRS ، حيث تم الكشف سابقا عن ارتباطه بالسمية المرتبطة بخلايا CART28,37. تم إجراء فحوصات الدم المحيطية (عن طريق جمع الدم تحت الفك السفلي) لتقييم عبء الورم وتوسع خلايا CART عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا السرطانية البشرية CD19 + والخلايا التائية CD3 + البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، تم جمع المصل ، وتم إجراء تقييم للسيتوكينات الالتهابية. تم إجراء الفحوصات قبل يوم واحد من ضخ خلايا CART19 وكذلك في 5 و 10 أيام بعد ضخ خلية CART19 ، حيث أن هذه النقاط الزمنية ذات صلة خاصة ببداية CRS وتطور الأعراض.

هنا ، على وجه الخصوص ، تم إجراء اختبار Multiplex قبل وبعد إدارة خلية CART19 ، حيث كانت السيتوكينات والكيموكينات الأكثر تمثيلا هي GM-CSF و IL-18 و MIP-1α و IP-10 (الشكل 3 ب). ومع ذلك ، يمكن إجراء فحوصات أخرى لتقييم تركيزات هذه البروتينات في المصل. بدلا من ذلك ، خضعت الفئران لمسح التصوير بالرنين المغناطيسي لتقييم نفاذية الأوعية الدموية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). تم حقن الفئران بكاشف التباين الجادولينيوم (i.p.) لقياس التهاب الدماغ واضطراب حاجز الدمفي الدماغ 38. بعد ذلك ، تم تخديرهم باستخدام الأيزوفلوران ، وتم التقاط صور مرجحة T1 و T2 معززة بالتباين (الشكل 4). مع صور T2 (الشكل 4 ، يسار) ، يشير القسم الأكثر إشراقا (الأبيض) إلى وجود وذمة أو سائل ، والذي يظهر في الغالب في أورام المخ والالتهابات. مع صور T1 (الشكل 4 ، الوسط) ، تشير الأقسام الأكثر إشراقا إلى المناطق التي يوجد بها تسرب للدم أو اضطراب في الحاجز الدموي الدماغي. أخيرا ، بمساعدة البرنامج ، تم تجميع صور إعادة البناء ثلاثية الأبعاد (الشكل 4 ، يمين) باستخدام صور T1 المحسنة بالجادولينيوم بناء على إشارات فرط الكثافة المقابلة لنفاذية الأوعية الدموية ، مما يجعل حجم تسرب الجادولينيوم في الدماغ34.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تجريبي لنموذج xenograft مشتق من المريض يستخدم لتقييم السمية المرتبطة بخلايا CART ، ومتلازمة إطلاق السيتوكين ، والتهاب الأعصاب. تم تكييف الفئران NSG ب 30 ملغم / كغم من بوسلفان (i.p.) وتلقوا 3 × 10 6-5 × 106 انفجارات (IV) مشتقة من الدم المحيطي للمرضى الذين يعانون من ALL. بعد ذلك ، تمت مراقبة الفئران لتطعيم الورم عن طريق جمع الدم تحت الفك السفلي ، تليها قياس التدفق الخلوي لتقييم انفجارات CD19 +. عندما كانت خلايا CD19 + في الدم المحيطي ≥10 خلايا / ميكرولتر ، تلقت الفئران 2 × 10 6-5 × 106 خلايا CART19. تم وزن الفئران يوميا كمقياس لرفاهيتها. في 10 أيام بعد ضخ خلايا CART19 ، تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي لدماغ الفأر للكشف عن التهاب الأعصاب. تم إجراء نزيف الذيل لتقييم إنتاج السيتوكين / الكيموكين وتوسيع الخلايا التائية أسبوعيا بعد حقن الخلايا CART19. الاختصارات: CART = خلية T لمستقبلات المستضد الخيمري ؛ CART19 = عربة التسوق المستهدفة CD19 ؛ ALL = سرطان الدم الليمفاوي الحاد. i.v. = عن طريق الوريد. i.p. = داخل الصفاق. PB = الدم المحيطي. NSG = NOD-SCID IL2rγnull. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل الخلايا السرطانية CD19 + كمؤشر لعبء الورم في نموذج ALL PDX لتقييم السمية المرتبطة بخلايا CART. (أ) تحليل قياس التدفق الخلوي التمثيلي الذي يوضح استراتيجية البوابات لتحليل عدد خلايا CD19 + المأخوذة من عينة دم محيطية لفأر محقون بأرومات ALL مشتقة من المريض. (ب) تحديد كمية ومقارنة مجموعات خلايا CD19 + بين الفئران المعالجة ب CART19 مقابل الفئران غير المعالجة بناء على البيانات الخام التي تم الحصول عليها من تحليل قياس التدفق الخلوي. (ANOVA أحادي الاتجاه ؛ n = 3 فئران لكل مجموعة ؛ أشرطة الخطأ ، SEM). الاختصارات: ns = غير مهم ؛ ALL = سرطان الدم الليمفاوي الحاد. PDX = xenograft المشتقة من المريض ؛ CART = خلية تائية لمستقبلات المستضد الخيمري ؛ CART19 = عربة التسوق المستهدفة CD19 ؛ SSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الجانبي ؛ FSC-H = ارتفاع ذروة التشتت الأمامي ؛ SSC-A = منطقة ذروة التشتت الجانبية ؛ FSC-A = منطقة ذروة التشتت الأمامية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تقييم السمية المرتبطة ب CART19 باستخدام نموذج ALL PDX. (أ) رسم بياني تمثيلي لانخفاض الوزن في النسبة المئوية للفئران المعالجة بخلايا CART19 أو التحكم في الخلايا التائية غير المنقولة لأول 6 أيام بعد CART (ثنائي الاتجاه ANOVA ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.00001 ؛ أشرطة الخطأ ، SEM). (ب) التعبير عن السيتوكينات والكيموكينات في مصل الفئران NSG قبل وبعد إعطاء خلية CART19. تعرضت الفئران NSG لنزيف تحت الفك السفلي قبل وبعد إعطاء خلية CART19 (IV) لجمع مصلها وتقييم تعبير السيتوكينات والكيموكينات التالية: GM-CSF ، IL-18 ، MIP-1α ، IP-10 ، IL-1β و IL-6 (ثنائي الاتجاه ANOVA ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.0001 ؛ n = 3 فئران ؛ تسعة تكرارات تقنية ؛ أشرطة الخطأ ، سيم). الاختصارات: ns = غير مهم ؛ ALL = سرطان الدم الليمفاوي الحاد. PDX = xenograft المشتقة من المريض ؛ CART = خلية تائية لمستقبلات المستضد الخيمري ؛ CART19 = عربة التسوق المستهدفة CD19 ؛ NSG = NOD-SCID IL2rγnull ؛ GM-CSF = عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم ؛ IL-18 = إنترلوكين -18 ؛ MIP-1α = بروتين التهاب البلاعم -1 ألفا ؛ IP-10 = البروتين الناجم عن الإنترفيرون غاما 10 ؛ IL-1β = إنترلوكين -1β ؛ IL-6 = إنترلوكين -6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التصوير بالرنين المغناطيسي المستخدم لتقييم الالتهاب العصبي أثناء العلاج بالخلايا CART19 في نموذج PDX. تم غرس الفئران NSG المطعمة بالخلايا السرطانية المشتقة من جميع مرضى ابيضاض الدم اللمفاوي الحاد بخلايا CART19 ، وتم تصوير الأدمغة بالتصوير بالرنين المغناطيسي المعزز بالجادولينيوم بعد أن أظهرت الفئران أعراضا عصبية في غضون 10 أيام بعد ضخ CART. (يسار) صورة مرجحة T2 تكشف عن دليل على الوذمة والتسلل الالتهابي المحتمل أثناء NI في الفئران المعالجة ب CART19 (السهم الأحمر). (الوسط) يظهر القسم المحوري التمثيلي للتصوير بالرنين المغناطيسي المرجح T1 تحسنا في التباين داخل حمة الدماغ ، مما يشير إلى زيادة نفاذية الأوعية الدموية في الفئران المعالجة ب CART19 (السهم الأحمر). (يمين) تم إنشاء عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لدماغ القوارض مع مناطق فرط الكثافة T1 (الحمراء) باستخدام برنامج Analyze 12.0. الاختصارات: التصوير بالرنين المغناطيسي = التصوير بالرنين المغناطيسي. ALL = سرطان الدم الليمفاوي الحاد. PDX = xenograft المشتقة من المريض ؛ CART = خلية تائية لمستقبلات المستضد الخيمري ؛ CART19 = عربة التسوق المستهدفة CD19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بشري فأر
السيتوكين / الكيموكين السيتوكينات النخاعية البشرية (IL-6 ، GM-CSF ، IL-1 ، MCP-1) السيتوكينات النخاعية البشرية (IL-6 ، GM-CSF ، IL-1 ، MCP-1)
الوقت ل CRS (يوم) 2-5 4-6
الوقت إلى NI (يوم) 5-7 6-8
حالة BBB اضطراب BBB اضطراب BBB
البلاعم المقيمة في الأنسجة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة
خلية CART في الجهاز العصبي المركزي تسلل الدماغ تسلل الدماغ

الجدول 1: تلخيص السمية المرتبطة بخلايا CART المرصودة سريريا بواسطة نموذج ALL PDX. الاختصارات: GM-CSF = عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم ؛ IL = إنترلوكين ؛ CRS = متلازمة إطلاق السيتوكين. NI = التهاب الأعصاب. BBB = حاجز الدم في الدماغ. الجهاز العصبي المركزي = الجهاز العصبي المركزي. MCP-1 = بروتين جاذب كيميائي أحادي الخلية 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا التقرير ، تم وصف منهجية لتقييم السمية المرتبطة بخلايا CART باستخدام نموذج ALL PDX. وبشكل أكثر تحديدا ، يسعى هذا النموذج إلى تقليد سميتين تهددان الحياة ، CRS و NI ، والتي غالبا ما يعاني منها المرضى بعد ضخ خلايا CART. يلخص العديد من السمات المميزة لسمية CART التي لوحظت في العيادة: فقدان الوزن ، والخلل الحركي ، والتهاب الأعصاب ، وإنتاج السيتوكين الالتهابي والكيموكين ، وتسلل الخلايا المستجيبة المختلفة إلى الجهاز العصبي المركزي8،20،28. في السابق ، تم استخدام نموذج PDX هذا لتقليد التطوير الأولي ل CRS و NI (الجدول 1) وتقييم الاستراتيجيات المختلفة للوقاية من السمية وعلاجها. استخدمت إحدى الدراسات في نموذج PDX هذا خلايا CART19 المستنفدة من GM-CSF. وبشكل أكثر تحديدا ، أظهرت هذه النتائج أن استنفاد GM-CSF أدى إلى انخفاض إفراز السيتوكينات والكيموكينات المرتبطة ب CRS ، والتي تم إثباتها بوضوح باستخدام نموذج الماوس ALL PDX29. كما تم استخدام نموذج PDX هذا بنجاح لتقييم توسع خلية CART في الجسم الحي المرتبط بتطوير CRS بعد ضخ خلية CART19 باستخدام سيمبورتر يوديد الصوديوم (NIS) كمنصة تصوير26. لذلك ، يمثل هذا النموذج المقترح أداة مفيدة يمكن استخدامها لتقييم السميات المحتملة الناشئة عن خلايا CART.

من المهم الإشارة إلى أنه تم استخدام العديد من النماذج الأخرى لدراسة خلايا CART في الجسم الحي. وتشمل هذه النماذج نماذج الفئران المتجانسة والمحورة وراثيا والإنسانية ، بالإضافة إلى النماذج الغريبة24. يستخدم نموذج الفأر الجيني ، الذي يطلق عليه أيضا نموذج الفأر الخيفي المناعي ، خلايا CART والورم والمستضدات المستهدفة التي هي الفئران في الأصل. هذا مفيد لأنه يسمح بدراسة خلايا CART في نظام مناعي يعمل بكامل طاقته ويمكن أن يكشف أيضا عن سمية مستهدفة خارج الورم. عيب هذا النموذج هو أن بيولوجيا الفئران والمناعة تختلف عن تلك الخاصة بالبشر ، وبالتالي ، فهي ليست نموذجا مناسبا للدراسات الانتقالية حيث يكون الهدف هو المضي قدما في التجارب السريرية24,39.

تعبر نماذج الفئران المعدلة وراثيا ذات الكفاءة المناعية عن جين التحوير المرتبط بالورم البشري (TAA) على كل من الأنسجة السليمة والأورام في أنماط تحاكي تلك الموجودة في الأنسجة البشرية. كما تم استخدام هذه الفئران في دراسات CART لتقييم سلامة خلايا CART بشكل أفضل من خلال الكشف عن التأثيرات المستهدفة خارج الورم40,41. يمكن أن تكون الفئران البشرية المزروعة بالخلايا الجذعية المكونة للدم CD34 + نموذجا مفيدا لدراسة فعالية CART والسمية على نظام المكونة للدم البشري ، حيث يمكن للجهاز المناعي المعاد تشكيله أن يحاكي تثبيط CART ويحفز عاصفة السيتوكين التي تلخص CRS التي شوهدت في العيادة42،43،44. على الرغم من أن هذه النماذج تسمح بدراسة خلايا مناعية محددة فيما يتعلق بفعالية CART ، إلا أن النظام المتوافق مع البشر لا يزال بدائيا ويحتاج إلى مزيد من التحسين. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدامها في دراسة التأثيرات غير المستهدفة محدود لأن معظم المستضدات المضيفة على الأنسجة السليمة هي الفئران في الأصل. علاوة على ذلك ، فإن نموذج الماوس المتوافق مع البشر CD34 + يمثل تحديا تقنيا لتطوير45. ومع ذلك ، تستخدم نماذج الطعم الأجنبي البشري في الفئران التي تعاني من نقص المناعة بشكل شائع لتقييم فعالية خلايا CART البشرية قبل ترجمتها إلى التجارب السريرية ، وكما هو موضح في هذه الورقة ، يمكن استخدامها لتقييم السميات المرتبطة بنشاط خلايا CART. ومع ذلك ، فإن نقص الجهاز المناعي والخلايا المناعية مثل الخلايا التائية والخلايا القاتلة الطبيعية يحد من تطبيقها لتقييم السمية خارج الورم على الهدف ، وتفاعلات خلايا CART مع الخلايا المناعية الفطرية ، وتثبيط خلايا CART بواسطة البيئة المكروية للورم.

ميزة البروتوكول الموصوف هنا هي أنه يتطلب إجراءات بسيطة باستخدام الفئران NSG لمراقبة وتقييم السمية المرتبطة بخلايا CART. أولا ، من السهل إعادة إنتاجه ، وقد تم تحسينه لتقييم استراتيجيات منع سمية CART من خلال تحييد GM-CSF وتصور توسع خلايا CART بالارتباط مع بداية CRS. عند استخدام نموذج PDX الجديد هذا ، من المهم تنفيذ الخطوات الحاسمة بشكل صحيح ، مثل تأكيد النقش المناسب لانفجارات ALL والمراقبة المبكرة لظهور CRS مباشرة بعد إدارة CART. يعد تقييم السيتوكينات ومراقبة الوزن أمرا بالغ الأهمية لتحديد السمية المرتبطة ب CART ، ويحدد التصوير بالرنين المغناطيسي بداية NI. سلبيات هذا النموذج هي كما يلي: 1) نظرا لأن خلايا PDX ALL تستغرق وقتا أطول للنقش والوصول إلى عبء ورم مرتفع ، فإنها تتطلب ما يقرب من 2-3 أشهر من تلقيح الخلايا السرطانية إلى علاج خلايا CART19 ؛ 2) كنموذج PDX أساسي ، هناك تباين كبير بين المريض والمريض فيما يتعلق بوقت التطعيم والاستجابة للعلاج بخلايا CART ؛ 3) لا يمكن تقييم حمل الورم بتصوير التلألؤ الحيوي ويتطلب تقييما متكررا للدم المحيطي ؛ و 4) يحد نقص الخلايا المناعية الفطرية من قدرة هذا النموذج على دراسة تفاعلات CART مع الخلايا المناعية أو البيئة المكروية للورم.

نما الاهتمام باختبار الخلايا المتبنية ضمن نماذج الفئران الأكثر تعقيدا على مدى العقد الماضي حيث أصبح من الواضح أن نماذج الفئران البسيطة التي تعاني من نقص المناعة ليست نماذج مثالية قبل السريرية. يمثل نموذج الماوس PDX الموصوف هنا لتقييم السمية المرتبطة بخلايا CART نموذجا قبل سريريا واعدا في مجال العلاج بخلايا CART لأنه يحاكي الجدول الزمني والأعراض وعلامات CRS و NI بعد ضخ خلايا CART كما هو موضح في العيادة. بشكل عام ، توفر المنهجية الموضحة هنا منصة قوية لتقييم السمية المرتبطة بخلايا CART19 بالإضافة إلى الفعالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.S.K. هو مخترع براءات الاختراع في مجال العلاج المناعي CAR المرخص لشركة Novartis (من خلال اتفاقية بين Mayo Clinic وجامعة بنسلفانيا وشركة Novartis) وشركة Mettaforge (من خلال Mayo Clinic). R.L.S. و S.S.K. مخترعون على براءات اختراع في مجال العلاج المناعي CAR المرخصة لشركة Humanigen. تتلقى SSK تمويلا بحثيا من Kite و Gilead و Juno و Celgene و Novartis و Humanigen و MorphoSys و Tolero و Sunesis و Leahlabs و Lentigen.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المعاهد الوطنية للصحة (R37CA266344 ، 1K99CA273304) ، ووزارة الدفاع (CA201127) ، وخط أنابيب Mayo Clinic K2R (SSK) ، ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK) ، ومؤسسة Predolin (R.L.S.). بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر موظفي مرفق الرنين المغناطيسي النووي الأساسي في Mayo Clinic. تم إنشاء الشكل 1 في عام BioRender.com

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Cancer Research. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 192 ، خلية CART ، السمية المرتبطة بخلايا CART ، نموذج xenograft المشتق من المريض (PDX) ، علاج السرطان ، النموذج قبل السريري في الجسم الحي

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

تقييم السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري باستخدام نموذج فأر Xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manriquez Roman, C., Sakemura, R.… More

Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter