Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64535
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1,2, 1,2, 6, 6, 1,2, 1,2, 6, 1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

ERRATUM NOTICE

Summary

Hier beschrijven we een protocol waarin een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmodel wordt gebruikt als een strategie om CD19-gerichte chimere antigeenreceptor T-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen en te monitoren.

Abstract

Chimere antigeenreceptor T (CART) celtherapie is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor de behandeling van meerdere soorten CD19 + maligniteiten, wat heeft geleid tot de recente FDA-goedkeuring van verschillende CD19-gerichte CART (CART19) celtherapieën. CART-celtherapie wordt echter geassocieerd met een unieke reeks toxiciteiten die hun eigen morbiditeit en mortaliteit met zich meebrengen. Dit omvat cytokine release syndrome (CRS) en neuro-inflammatie (NI). Het gebruik van preklinische muismodellen is cruciaal geweest in het onderzoek en de ontwikkeling van CART-technologie voor het beoordelen van zowel CART-werkzaamheid als CART-toxiciteit. De beschikbare preklinische modellen om deze adoptieve cellulaire immunotherapie te testen omvatten syngene, xenograft, transgene en gehumaniseerde muismodellen. Er is geen enkel model dat naadloos het menselijk immuunsysteem weerspiegelt, en elk model heeft sterke en zwakke punten. Dit methodedocument heeft tot doel een van de patiënt afgeleid xenograftmodel te beschrijven met behulp van leukemische blasten van patiënten met acute lymfatische leukemie als een strategie om CART19-geassocieerde toxiciteiten, CRS en NI te beoordelen. Van dit model is aangetoond dat het CART19-geassocieerde toxiciteiten en therapeutische werkzaamheid zoals gezien in de kliniek samenvat.

Introduction

Chimere antigeenreceptor T (CART) celtherapie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van kankerimmunotherapie. Het heeft bewezen succesvol te zijn bij de behandeling van recidiverende / refractaire acute lymfatische leukemie (ALL), grootcellig B-cellymfoom, mantelcellymfoom, folliculair lymfoom en multipel myeloom 1,2,3,4,5,6,7, wat leidt tot recente FDA-goedkeuringen. Ondanks het aanvankelijke succes in klinische onderzoeken, resulteert behandeling met CART-celtherapie in toxiciteiten die vaak ernstig en soms dodelijk zijn. De meest voorkomende toxiciteiten na CART-celtherapie zijn de ontwikkeling van CRS en NI, ook wel immuuneffectorcelgeassocieerd neurotoxiciteitssyndroom (ICANS) genoemd8,9. CRS wordt veroorzaakt door de overactivatie en massale expansie van CART-cellen in vivo, wat leidt tot de daaropvolgende secretie van meerdere inflammatoire cytokines, waaronder interferon-γ, tumornecrosefactor-α, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine-6 (IL-6). Dit resulteert in hypotensie, hoge koorts, capillair leksyndroom, respiratoire insufficiëntie, multi-orgaanfalen en in sommige gevallen de dood10,11. CRS ontwikkelt zich in 50-100% van de gevallen na CART19 celtherapie11,12,13. ICANS is een andere unieke bijwerking geassocieerd met CART-celtherapie en wordt gekenmerkt door gegeneraliseerd hersenoedeem, verwarring, obtundatie, afasie, motorische zwakte en af en toe aanvallen 9,14. Elke graad van ICANS komt voor bij maximaal 70% van de patiënten, en graad 3-4 wordt gemeld bij 20-30% van de patiënten 5,10,15,16. Over het algemeen komen CRS en ICANS vaak voor en kunnen ze fataal zijn.

Het beheer van ICANS na CART-celtherapie is een uitdaging. De meeste patiënten met ICANS ervaren ook CRS17, dat vaak kan worden behandeld met de IL-6-receptorantagonist tocilizumab of steroïden18. Een eerder rapport toonde aan dat vroege interventie met tocilizumab de snelheid van ernstige CRS verminderde, maar geen invloed had op de incidentie of ernst van ICANS19. Momenteel is er geen effectieve behandeling of profylactisch middel voor ICANS, en het is cruciaal om preventieve strategieën te onderzoeken20.

Myeloïde cellen en bijbehorende cytokines/chemokines worden beschouwd als de belangrijkste aanjagers van de ontwikkeling van CRS en ICANS21. Terwijl CRS direct gerelateerd is aan de extreme verhoging van cytokines en T-celexpansie, is de pathofysiologie van ICANS grotendeels onbekend22,23. Daarom is het noodzakelijk om een muismodel op te stellen dat deze toxiciteiten na CART-celtherapie samenvat om de mechanismen te bestuderen en preventieve strategieën te ontwikkelen.

Er zijn meerdere preklinische diermodellen die momenteel worden gebruikt om de werkzaamheid van CART-cellen te bestuderen, te optimaliseren en te valideren, en om hun bijbehorende toxiciteiten te controleren. Deze omvatten syngene, xenograft, immunocompetente transgene, gehumaniseerde transgene en patiënt-afgeleide xenograftmuizen, naast primatenmodellen. Elk van deze modellen heeft echter nadelen en sommige weerspiegelen niet de werkelijke werkzaamheid of veiligheidsproblemen van CART-cellen24,25. Daarom is het noodzakelijk om zorgvuldig het beste model te kiezen voor de beoogde doelen van het onderzoek.

Dit artikel beoogt de methodologie te beschrijven die wordt gebruikt om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten, CRS en NI te beoordelen, met behulp van een ALL patient-derived xenograft (PDX) in vivo model (Figuur 1). In het bijzonder worden in de hier beschreven methoden CART19-cellen gebruikt die in het laboratorium van de auteurs zijn gegenereerd volgens eerder beschreven protocollen. Kortom, menselijke T-cellen worden geïsoleerd uit gezonde donor perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) via een dichtheidsgradiënttechniek, gestimuleerd met CD3 / CD28-kralen op dag 0 en lentiviraal getransduceerd op dag 1 met CARs samengesteld uit een CD19-gericht enkelvoudig keten variabel fragment gefuseerd met 4-1BB- en CD3ζ-signaleringsdomeinen. Deze CART-cellen worden vervolgens uitgebreid, ont-beaded op dag 6 en gecryopreserveerd op dag 8 26,27,28,29,30. Zoals eerder beschreven, worden muizen onderworpen aan een lymfodepleterende behandeling, gevolgd door de toediening van van de patiënt afgeleide leukemische blasten (ALL)28. Eerst wordt tumortransplantatie geverifieerd via submandibulaire bloedafname. Na het vaststellen van een geschikte tumorlast worden CART19-cellen toegediend aan de muizen. Vervolgens worden de muizen dagelijks gewogen om het welzijn te beoordelen. Beeldvorming van magnetische resonantie van kleine dieren (MRI) wordt uitgevoerd om NI te beoordelen, samen met staartbloedingen om T-celexpansie en cytokine / chemokineproductie te beoordelen. De hieronder beschreven technieken worden ten zeerste aanbevolen om te worden gebruikt als een model om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten in een PDX-model te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Review Board (IRB), Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) en Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) van Mayo Clinic.

OPMERKING: Alle materialen die worden gebruikt om met muizen te werken, moeten steriel zijn.

1. Injectie van busulfan op NSG-muizen

  1. Verkrijg mannelijke, 8-12 weken oude, immuungecompromitteerde, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) muizen en weeg ze vóór de injectie.
    OPMERKING: Voor statistische significantie wordt aanbevolen om ten minste vijf muizen per groep te gebruiken en dit experiment ten minste eenmaal nogmaals te herhalen met vrouwelijke muizen.
  2. Bereid busulfan voor intraperitoneale (i.p.) injectie. Gebruik een insulinespuit van 1 ml en vul de spuit langzaam en voorzichtig met precies 30 mg / kg busulfan, gevolgd door i.p-injectie op de muizen, en plaats ze terug in de kooi.

2. Injectie van ALLE patiënt-afgeleide blasten (CD19+) op de NSG-muizen

OPMERKING: Dit protocol volgt de richtlijnen van het Institutional Biosafety Committee van Mayo Clinic (IBC, Bios00000006.04).

  1. Verzamel primaire leukemische blasten uit het perifere bloed van patiënten met recidiverende en refractaire ALL.
  2. Bereid doelcellen voor op intraveneuze (i.v.) injectie.
    1. Tel CD19+ doelcellen met behulp van een hemocytometer en registreer het uiteindelijke volume en de uiteindelijke concentratie van cellen.
      OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van cellen te bepalen, wordt het sterk aanbevolen om trypan blue te gebruiken tijdens het tellen van de cellen.
    2. Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    3. Resuspendeer de celpellet in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 50 × 106 cellen / ml in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats op ijs.
    4. Vingervortex de 1,5 ml microcentrifugebuis met de doelcellen totdat de cellen volledig gehomogeniseerd zijn.
    5. Gebruik een insulinespuit van 1 ml en vul de spuit langzaam en voorzichtig met precies 100 μL van de voorbereide doelcellen en veeg met de spuit om bubbels te verwijderen.
      OPMERKING: Het volume van 100 μL zal 5 × 106 cellen aan elke muis toedienen.
    6. Plaats de muizen onder warm licht gedurende 5-10 minuten. Zodra de staartader gezwollen raakt en beter zichtbaar is voor het blote oog, plaatst u de muizen in een geschikte opsluitings- / fixatiekamer.
    7. Veeg de staart van de muis af met een alcoholdoekje. Injecteer de doelcellen rechtstreeks in de staartader (i.v.) en plaats de muis terug in de kooi. Na de inenting van de doelcellen, controleer de muizen dagelijks of zoals aanbevolen door de lokale dierethische commissie.

3. Tumor engraftment beoordeling

  1. Vanaf 6 weken na de doelcelinjectie, beoordeelt u tumortransplantatie met behulp van flowcytometrie om de expressie van CD19 + -cellen in het perifere bloed te meten.
  2. Perifere bloedtest om CD19+ expansie te beoordelen
    1. Onttrek bloed uit de muizen 6-8 weken na CART19-celinjectie.
      OPMERKING: Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om bloed op te nemen. Voor dit protocol is submandibulaire bloedafname de voorkeursmethode.
    2. Verdoof de muis met isofluraan in een inductiekamer met 5% isofluraan. Zodra anesthesie is bereikt, handhaaft u 1-3% isofluraan geïnhaleerd door een neuskegel.
      OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om oogzalf aan te brengen om droge ogen te voorkomen.
    3. Verwijder de muis uit de kamer en houd de muis vast met de niet-dominante hand door de losse huid over de nek te grijpen. Prik de ader door met een lancet iets achter de onderkaak.
      OPMERKING: Alleen de punt van de naald (1-2 mm) is nodig om de ader binnen te gaan.
    4. Terwijl het bloed druipt, verzamelt u ten minste 50 μL in een met heparine gecoate buis en mengt u goed door de buis meerdere keren op en neer te keren. Breng 30 μL bloed over in een polystyreenbuis met ronde bodem van 5 ml.
      OPMERKING: Draai voor het resterende bloed de buis gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 17.000 × g naar beneden. Breng het serum (bovennatuurlijke laag) over in een schone en gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar deze bij −80 °C (voor gebruik in de cytokinetest).
    5. Voeg 2 ml lysisbuffer (10x op ammoniumchloride gebaseerde lyseerbuffer verdund tot 1x met nucleasevrij water) toe aan de 5 ml ronde bodembuis met het bloed. Meng heel goed door de buis te vortexen. Incubeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om een goede lysis van de rode bloedcellen te garanderen.
    6. Voeg 2 ml stroombuffer toe (PBS, 0,2 g/l kaliumchloride, 0,2 g/l kaliumfosfaatmonobasisch, 8 g/l natriumchloride en 1,15 g/l natriumfosfaatdibasisch met 2% foetaal runderserum en 1% natriumazide).
    7. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 300 × g bij 4 °C. Decanteer het supernatant en voeg 2 ml stroombuffer toe. Herhaal deze wasstap 2x.
    8. Decanteer voorzichtig de inhoud van de buis. Observeer de kleine hoeveelheid vloeistof met een pellet die in de buis achterblijft. Voeg 100 μL debietbuffer toe en resuspensie zeer goed.
    9. Breng alle resterende vloeistof in de 5 ml stroombuis over in een plaat met 96 putten. Zorg ervoor dat elk monster correct is geëtiketteerd. Voeg 100 μL debietbuffer toe aan de overeenkomstige putten en centrifugeer de 96-putplaat bij 650 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  3. Beoordeel de uitbreiding van de CD19+ doelcellen door middel van flowcytometrie (figuur 2).
    1. Bereid een hoofdmengsel met 0,3 μl levend/dode vlek, 0,13 μg (2,5 μl) antimenselijk CD19-antilichaam, 0,06 μg (2,5 μl) antimenselijk CD45-antilichaam, 5 μg (2,5 μl) antimuis-CD45 en 42,2 μl stroombuffer voor een totaal van 50 μl per monster. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
    2. Wassen met 150 μL stroombuffer gevolgd door centrifugeren bij 650 × g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Decanteer het supernatant en resuspensie van de pellet in 195 μL stroombuffer en 5 μL telparels.
    3. Verkrijg op een flowcytometer om het niveau van CD19+ celexpressie te bepalen. Voor gating- en analysedoeleinden moet eerst de populatie van belang (CD19+) worden gegate op basis van de voorwaartse versus zijwaartse spreidingskenmerken, gevolgd door een enkele gatingpopulatie en vervolgens levende cellen. Zodra de levende cellen zijn omheind, beoordeelt u de menselijke CD45 versus muis CD45-populatie en van de menselijke populatie, gaten de CD19 + -doelpopulatie.
  4. Kwantificeren om de hoeveelheid aanwezig in 70 μL te bepalen en vervolgens uit te drukken in cellen / μL met behulp van vergelijking (1):
    Absoluut CD19+ celgetal = ([CD19+ cellen/telkralen] × aantal telparels binnen 5 μL)/70
    OPMERKING: Herhaal de perifere bloedtest om de 5 dagen om de CD19+ celexpansie te beoordelen. Verzamel niet meer dan 200 μL bloed cumulatief om de 2 weken in overeenstemming met de richtlijnen van de lokale ethische commissie voor dieren. Zodra de muizen een ziektelast van ≥10 cellen / μL hebben bereikt, randomiseert u naar CART19-cellen of controlegroepen (sectie 4).

4. Toediening van CART19-cellen in vivo

  1. Bereiding van CART19-cellen (~Dag 80):
    OPMERKING: De generatie van CART19-cellen is eerder gepubliceerd 27,30,31. Deze procedure moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast niveau 2+ met behulp van aseptische techniek en persoonlijke beschermingsmiddelen.
    1. Ontdooi de CART19-cellen in een waterbadcontainer (37 °C). Was vervolgens de cellen in warm T-celmedium (TCM) om het dimethylsulfoxide te verwijderen.
      OPMERKING: TCM is gemaakt van 10% humaan AB-serum (v / v), 1% penicilline-streptomycine-glutamine (v / v) en serumvrij hematopoietisch celmedium27,30.
    2. Centrifugeer de CART19-cellen gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 300 × g en resuspensie in warme TCM tot een eindconcentratie van 2 × 106 cellen/ml. Laat de CART-cellen 's nachts rusten in een incubator (37 °C, 5% CO2) maar niet langer dan 16 uur.
  2. Toediening van CART19-cellen via i.v.-injectie (dag ~80)
    1. Tel de CART19-cellen en draai gedurende 8 minuten bij 4 °C terug bij 300 × g .
    2. Resuspendeer de CART19-cellen met 10 ml PBS en draai gedurende 8 minuten bij 4 °C terug bij 300 × g .
    3. Resuspendeer de CART19-cellen tot een eindconcentratie van 40 × 106 cellen / ml met PBS, breng de cellen over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats ze op ijs.
    4. Voer CART19-celstaartaderinjecties uit (zoals hierboven beschreven) door 100 μL geresuspendeerde cellen i.v. te injecteren.
      OPMERKING: Een volume van 100 μL zal 4 × 106 cellen aan elke muis toedienen. Neem een groep onbehandelde muizen op als negatieve controle.

5. Beoordeling van CART19 celgeassocieerde toxiciteiten

  1. Na toediening van CART19-cellen, controleer de muizen 2x per dag om eventuele veranderingen in hun welzijn te beoordelen, zoals motorische zwakte, gebogen lichaam en verlies van lichaamsgewicht.
    OPMERKING: Al deze fysieke veranderingen correleren met CRS-symptomen in dit model28.
  2. Zodra de muizen motorische zwakte en gewichtsvermindering beginnen te ontwikkelen (10-20% reductie ten opzichte van de uitgangswaarde), verzamelt u perifeer bloed om de tumorlast te analyseren en serumisolatie voor cytokines uit te voeren volgens de methodologie beschreven in sectie 3 (figuur 3).
  3. Bewaar de serummicrocentrifugebuizen bij −80 °C en gebruik de sera om de chemokines en cytokines te analyseren met behulp van een multiplextest (figuur 4).
    OPMERKING: Als de muizen tekenen van verlamming van de achterpoten vertonen, stervende of lusteloos lijken en het gewichtsverlies > 20% van hun lichaamsgewicht is tot het punt dat hun vermogen om voedsel en / of water te bereiken beperkt, dan zullen ze worden onderworpen aan euthanasie.

6. MRI-beeldvorming

OPMERKING: Een preklinische (voor kleine dieren) MRI-scanner met een verticale boringsmagneet werd gebruikt voor in vivo magnetische resonantie en beeldacquisitie32,33.

  1. Meng 120 μL Gadolinium + 880 μL zoutoplossing en laad in een insulinespuit van 1 ml. Injecteer 100 μL in elke muis (i.p.).
    OPMERKING: Gadolinium moet 15-20 minuten voor aanvang van het experiment worden geïnjecteerd.
  2. Verdoof de muis met isofluraan (2-3%) in een inductiekamer gedurende 10-15 minuten.
    OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om oogheelkundige zalf aan te brengen om droge ogen te voorkomen.
  3. Plaats de ruggengraat van de muis op de met knaagdieren compatibele wiegsonde. Ga vervolgens verder met het positioneren van de muis door zijn tanden op de bijtbalk te haken.
  4. Trek de kop van de muis in de 25 mm volumespoel en stel de neuskegel aan die is vastgemaakt aan het isofluraananesthesiesysteem. Draai de knop van de bijtbalk vast om de positie te behouden voor de duur van de scan.
    OPMERKING: Als u een contrastversterkte MRI-scan uitvoert, zorg er dan voor dat het gadolinium (in dit geval) of contrastmiddel ten minste 10 minuten voordat u het apparaat in de boormagneet plaatst, wordt geïnjecteerd. Gedurende de tijd van de beeldvorming worden de muizen verdoofd door de inademing van 2-3% isofluraan in de lucht via de neuskegel en wordt hun ademhalingsfrequentie tegelijkertijd gecontroleerd.
  5. Gebruik voor de ademhalingsbeoordeling een ademhalings- / ademhalingsbewakingsapparaat.
    OPMERKING: Het is belangrijk om ook de lichaamstemperatuur te beoordelen om mogelijke onderkoeling als gevolg van langdurige blootstelling aan anesthesie te voorkomen. Het wordt aanbevolen om warmtekussens te gebruiken om de lichaamstemperatuur te regelen.
    1. Bevestig de ademmonitorsonde dicht bij het diafragma en zet deze vast met chirurgische tape. Houd de ademhalingssnelheid tussen 20-60 ademhalingen per minuut, zodat de toestand van de muis stabiel is.
      OPMERKING: Deze snelheid biedt stabielere MRI-beelden en voorkomt bewegingsartefacten in het verkregen beeld. Als de ademhalingsfrequentie hoger is dan het bereik van 20-60 ademhalingen per minuut, verhoog dan de concentratie isofluraan. Als de ademhalingsfrequentie minder dan 20 ademhalingen per minuut is, is de anesthesie te diep; Daarom moet de concentratie worden verlaagd.
  6. Plaats de dierensonde in de kleine boring in het verticaal verticaal gedragen MRI-systeem voor kleine dieren. Pas het hoofd van het dier in het midden van de spoel aan. Bevestig het apparaat met het slot zodat het rechtop kan staan en sluit het instrument aan op de computer.
  7. Open en gebruik de software (bijv. Paravision) om de scanposities en soorten scans in te stellen. Bepaal de optimale axiale en sagittale posities terwijl u ze consistent houdt voor alle experimentele groepen.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de verwerving van een testscan als referentie te gebruiken voorafgaand aan de daadwerkelijke MRI-scans van volledige lengte.
  8. Ga verder met de MRI-gegevensverzameling (zoals eerder beschreven32,34,35,36). Verkrijg zowel T1-gewogen als T2-gewogen MRI-beelden met behulp van de hieronder genoemde voorgestelde instelling.
    1. Gebruik voor T1-gewogen MRI-beelden de T1-gewogen multislice multiecho (MSME)-sequentie met een herhalingstijd (TR) van 300 ms, een echotijd (TE) van 9,5 ms, een gezichtsveld (FOV) van 4 cm x 2 cm x 2 cm en een matrix van 192 x 96 x 96.
    2. Gebruik voor T2-gewogen MRI-beelden een Multislice Multiecho (MSME)-sequentie met een TR van 300 ms, een TE van 9,5 ms, een FOV van 4 cm x 2 cm x 2 cm en een matrix van 192 x 96 x 96.
  9. Zodra de scans zijn voltooid, verwijdert u de sonde uit de boring. Trek de muis voorzichtig uit door de tanden van de bijtbalk te verwijderen. Houd het dier in een aparte kooi in de gaten totdat het volledig bij bewustzijn is en weer voldoende motoriek heeft.
  10. Gebruik na de extractie van gegevens uit de software analysesoftware voor de kwantificering en 3D-volumeweergave (figuur 4) van de hyperintensiteitsgebieden.
    OPMERKING: Indien mogelijk wordt het sterk aangemoedigd om twee afzonderlijke geblindeerde waarnemers te hebben voor de gegevensanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het doel van dit protocol is om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen met behulp van een PDX-muizenmodel van tumorcellen van patiënten met ALL (figuur 1). Ten eerste kregen NSG-muizen i.p. injecties met busulfan (30 mg/kg) met als doel ze immunosuppressief te maken en CART-celtransplantatiete vergemakkelijken 28. De volgende dag ontvingen ze ~5 × 106 PBMC's (i.v.) afkomstig van ALLE patiënten. De muizen werden gedurende ~ 13 weken gecontroleerd op engraftment via de staartbloedingstest. Rode bloedcellen werden verzameld en gelyseerd, gevolgd door flowcytometrievoorbereiding om de expressie van CD19+ tumorcellen te beoordelen (figuur 2).

Zodra de muizen ≥10 tumorcellen / μL bereikten, werden ze gerandomiseerd en voorbereid om 4 × 106 CART19-cellen (i.v.) te ontvangen. Om CART19-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen, werden de muizen eenmaal per dag gewogen (figuur 3A). Gewichtsverlies werd gekozen als een symptoom van CRS-uiterlijk, omdat eerder is aangetoond dat het verband houdt met CART-cel-geassocieerde toxiciteiten28,37. Perifere bloedtesten (via submandibulaire bloedafname) werden uitgevoerd om tumorbelasting en CART-celexpansie te beoordelen door flowcytometrie-analyse van menselijke CD19 + tumorcellen en menselijke CD3 + T-cellen. Daarnaast werd serum verzameld en werd een beoordeling van inflammatoire cytokines uitgevoerd. Assays werden uitgevoerd een dag voorafgaand aan CART19-celinfusie en op 5 en 10 dagen na CART19-celinfusie, omdat deze tijdstippen bijzonder relevant zijn voor het begin van CRS en de ontwikkeling van symptomen.

Hier werd in het bijzonder een Multiplex-test uitgevoerd voor en na CART19-celtoediening, waarbij de meest representatieve cytokines en chemokines GM-CSF, IL-18, MIP-1α en IP-10 waren (figuur 3B). Er kunnen echter andere testen worden gedaan om de concentraties van deze eiwitten in het serum te beoordelen. Als alternatief werden muizen onderworpen aan MRI-scans om de vasculaire permeabiliteit in het centrale zenuwstelsel (CZS) te evalueren. Muizen werden geïnjecteerd met het contrastreagens gadolinium (i.p.) om hersenontsteking en verstoring van de bloed-hersenbarrière te meten38. Vervolgens werden ze verdoofd met isofluraan en werden contrastversterkte T1-gewogen en T2-gewogen beelden gemaakt (figuur 4). Bij T2-beelden (figuur 4, links) duidt het helderdere gedeelte (wit) op de aanwezigheid van oedeem of vloeistof, wat meestal wordt gezien bij hersentumoren en ontstekingen. Met T1-beelden (figuur 4, midden) geven de helderdere secties gebieden aan waar bloed lekt of de bloed-hersenbarrière wordt verstoord. Ten slotte werden met behulp van software de 3D-reconstructiebeelden (figuur 4, rechts) samengesteld met behulp van gadolinium-versterkte T1-beelden op basis van hyperintensiteitssignalen die overeenkomen met vasculaire permeabiliteit, waardoor het volume van gadoliniumlekkage in de hersenen34 wordt.

Figure 1
Figuur 1: Experimenteel schema van een patiënt-afgeleid xenograftmodel dat wordt gebruikt om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten, cytokine release syndroom en neuro-inflammatie te beoordelen. NSG-muizen werden geconditioneerd met 30 mg/kg busulfan (i.p.) en kregen 3 × 10 6-5 × 106 blasten (i.v.) afkomstig van het perifere bloed van patiënten met ALL. Vervolgens werden de muizen gecontroleerd op tumortransplantatie via submandibulaire bloedafname, gevolgd door flowcytometrie om CD19+ blasten te beoordelen. Wanneer de CD19+ cellen in het perifere bloed ≥10 cellen/μL waren, ontvingen de muizen 2 × 10 6-5 × 106 CART19-cellen. De muizen werden dagelijks gewogen als een maat voor hun welzijn. 10 dagen na CART19-celinfusie werden MRI's van muizenhersenen uitgevoerd om neuro-inflammatie te detecteren. Staartbloedingen om de cytokine/chemokineproductie en T-celexpansie te beoordelen werden wekelijks uitgevoerd na CART19-celinjectie. Afkortingen: CART = chimere antigeenreceptor T-cel; CART19 = CD19-gerichte WINKELWAGEN; ALL = acute lymfatische leukemie; i.v. = intraveneus; i.p. = intraperitoneaal; PB = perifeer bloed; NSG = NOD-SCID IL2rγnull. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Analyse van CD19+ tumorcellen als indicator van tumorbelasting in een ALL PDX-model om CART-cel geassocieerde toxiciteiten te beoordelen. (A) Representatieve flowcytometrische analyse die de gating-strategie toont om de CD19+ celpopulatie te analyseren, genomen van een perifeer bloedmonster van een muis geïnjecteerd met patiënt-afgeleide ALL-blasten. (B) De kwantificering en vergelijking van de CD19+ celpopulaties tussen muizen behandeld met CART19 versus onbehandelde muizen op basis van ruwe gegevens verkregen uit flowcytometrie-analyse. (eenrichtings-ANOVA; n = 3 muizen per groep; foutbalken, SEM). Afkortingen: ns = niet significant; ALL = acute lymfatische leukemie; PDX = van de patiënt afgeleide xenograft; CART = chimere antigeenreceptor T-cel; CART19 = CD19-gerichte WINKELWAGEN; SSC-H = zijverstrooiing-piekhoogte; FSC-H = voorwaartse verstrooiing-piekhoogte; SSC-A = zijwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-A = voorwaarts verstrooid-piekgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Beoordeling van CART19-geassocieerde toxiciteiten met behulp van een ALL PDX-model. (A) Representatieve grafiek van het percentage gewichtsvermindering bij muizen behandeld met CART19-cellen of controle niet-getransduceerde T-cellen gedurende de eerste 6 dagen na CART (tweeweg ANOVA, ***p < 0,001, ****p < 0,00001; foutbalken, SEM). (B) Expressie van cytokines en chemokines in NSG muizen serum voor en na CART19 celtoediening. NSG-muizen werden onderworpen aan submandibulaire bloedingen voor en na CART19-celtoediening (i.v.) om hun serum te verzamelen en de expressie van de volgende cytokines en chemokines te beoordelen: GM-CSF, IL-18, MIP-1α, IP-10, IL-1β en IL-6 (tweeweg ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; n = 3 muizen; negen technische replicaties; foutbalken, SEM). Afkortingen: ns = niet significant; ALL = acute lymfatische leukemie; PDX = van de patiënt afgeleide xenograft; CART = chimere antigeenreceptor T-cel; CART19 = CD19-gerichte WINKELWAGEN; NSG = NOD-SCID IL2rγnull; GM-CSF = granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor; IL-18 = interleukine-18; MIP-1α = macrofaag inflammatoir eiwit-1 alfa; IP-10 = interferon gamma-geïnduceerd eiwit 10; IL-1β = interleukine-1β; IL-6 = interleukine-6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Magnetische resonantie beeldvorming gebruikt om neuro-inflammatie te beoordelen tijdens CART19 celbehandeling in een PDX-model. NSG-muizen geënt met tumorcellen afkomstig van ALLE patiënten werden geïnfundeerd met CART19-cellen en de hersenen werden in beeld gebracht met gadolinium-versterkte MRI nadat de muizen neurologische symptomen vertoonden binnen 10 dagen na CART-infusie. (Links) T2-gewogen beeld dat bewijs onthult van oedeem en mogelijk inflammatoir infiltraat tijdens NI bij met CART19 behandelde muizen (rode pijl). (Midden) Representatieve axiale sectie van T1-gewogen MRI met contrastverbetering binnen het hersenparenchym, wat wijst op verhoogde vasculaire permeabiliteit bij met CART19 behandelde muizen (rode pijl). (Rechts) Driedimensionale reconstructies van het knaagdierbrein met T1-hyperintensiteitsgebieden (rood) werden gegenereerd met behulp van Analyze 12.0-software. Afkortingen: MRI = magnetische resonantie beeldvorming; ALL = acute lymfatische leukemie; PDX = van de patiënt afgeleide xenograft; CART = chimere antigeenreceptor T-cel; CART19 = CD19-gerichte WINKELWAGEN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Menselijk Muis
Cytokine/Chemokine Humane myeloïde cytokines (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1) Humane myeloïde cytokines (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1)
Tijd tot CRS (dag) 2-5 4-6
Tijd tot NI (dag) 5-7 6-8
BBB-status BBB-storing BBB-storing
Weefselresidente macrofaag Microgliale activering Microgliale activering
CART-cel in CNS Herseninfiltratie Herseninfiltratie

Tabel 1: Recapitulatie van de klinisch waargenomen CART-cel-geassocieerde toxiciteiten door het ALL PDX-model. Afkortingen: GM-CSF = granulocyt-macrofaag kolonie stimulerende factor; IL = interleukine; CRS = cytokine release syndroom; NI = neuro-inflammatie; BBB = bloed-hersenbarrière; CNS = centraal zenuwstelsel; MCP-1 = monocyt chemoattractant eiwit 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit rapport is een methodologie beschreven om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen met behulp van een ALL PDX-model. Meer specifiek probeert dit model twee levensbedreigende toxiciteiten na te bootsen, CRS en NI, die patiënten vaak ervaren na de infusie van CART-cellen. Het vat vele kenmerken van CART-toxiciteiten samen die in de kliniek zijn waargenomen: gewichtsverlies, motorische disfunctie, neuro-inflammatie, inflammatoire cytokine- en chemokineproductie en de infiltratie van verschillende effectorcellen in het centrale zenuwstelsel 8,20,28. Eerder werd dit PDX-model gebruikt om de initiële ontwikkeling van CRS en NI na te bootsen (tabel 1) en verschillende strategieën voor toxiciteitspreventie en -behandeling te beoordelen. Een studie in dit PDX-model gebruikte CART19-cellen die uitgeput waren van GM-CSF. Meer specifiek toonden deze resultaten aan dat GM-CSF-depletie resulteerde in de verminderde secretie van CRS-gebonden cytokines en chemokines, wat duidelijk werd aangetoond met behulp van dit ALL PDX-muismodel29. Dit PDX-model is ook met succes gebruikt om cart-cel in vivo expansie te beoordelen die correleert met CRS-ontwikkeling na CART19-celinfusie met behulp van een natriumjodidesymporter (NIS) als beeldvormingsplatform26. Daarom is dit voorgestelde model een nuttig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de potentiële toxiciteiten die voortvloeien uit CART-cellen te beoordelen.

Het is belangrijk om te vermelden dat veel andere modellen zijn gebruikt om CART-cellen in vivo te bestuderen. Deze omvatten syngene, transgene en gehumaniseerde muismodellen, naast xenogene modellen24. Het syngenetische muismodel, ook wel het immunocompetente allograft-muismodel genoemd, maakt gebruik van CART-cellen, tumoren en doelantigenen die van muizen afkomstig zijn. Dit is voordelig omdat het de studie van CART-cellen in een volledig functioneel immuunsysteem mogelijk maakt en ook on-target, off-tumor toxiciteiten kan onthullen. Het nadeel van dit model is dat de biologie en immuniteit van muizen verschillen van die van mensen, en daarom is het geen relevant model voor translationele studies waarbij het doel is om door te gaan naar klinische studies24,39.

Immunocompetente transgene muismodellen drukken een humaan tumorgeassocieerd antigeen (TAA) transgen uit op zowel gezond weefsel als tumoren in patronen die die in menselijke weefsels nabootsen. Deze muizen zijn ook gebruikt in CART-studies om de veiligheid van CART-cellen beter te evalueren door on-target off-tumoreffecten te onthullen40,41. Gehumaniseerde muizen geïmplanteerd met CD34+ menselijke hematopoietische stamcellen kunnen een voordelig model zijn om de werkzaamheid en toxiciteit van CART op het menselijke hematopoietische systeem te bestuderen, omdat het gereconstitueerde immuunsysteem CART-remming kan nabootsen en een cytokinestorm kan induceren die CRS samenvat die in de kliniek wordt gezien42,43,44. Hoewel deze modellen de studie van specifieke immuuncellen in relatie tot CART-werkzaamheid mogelijk maken, is het gehumaniseerde systeem nog steeds primitief en moet het verder worden geoptimaliseerd. Bovendien is hun gebruik bij het bestuderen van off-target effecten beperkt, omdat de meeste gastheerantigenen op gezond weefsel van muizen afkomstig zijn. Bovendien is het CD34+ gehumaniseerde muismodel technisch uitdagend om45 te ontwikkelen. Menselijke xenograftmodellen in immuungecompromitteerde muizen worden echter vaak gebruikt om de werkzaamheid van menselijke CART-cellen te beoordelen voordat ze worden vertaald naar klinische onderzoeken, en zoals aangetoond in dit artikel, kunnen ze worden gebruikt om de toxiciteiten geassocieerd met CART-celactiviteit te evalueren. Het gebrek aan immuunsysteem en immuuncellen zoals T-cellen en NK-cellen beperkt echter hun toepassing voor het beoordelen van off-tumor on-target toxiciteit, interacties van CART-cellen met aangeboren immuuncellen en CART-celremming door de tumormicro-omgeving.

Het voordeel van het hier beschreven protocol is dat het eenvoudige procedures vereist met behulp van NSG-muizen om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten te observeren en te beoordelen. Ten eerste is het gemakkelijk te reproduceren en is het geoptimaliseerd om strategieën te beoordelen om CART-toxiciteiten te voorkomen door GM-CSF-neutralisatie en om CART-celexpansie te visualiseren in correlatie met CRS-begin. Bij het gebruik van dit nieuwe PDX-model is het belangrijk om de kritieke stappen correct uit te voeren, zoals het bevestigen van de juiste engraftment van de ALL-ontploffingen en de vroege monitoring van CRS-aanvang direct na CART-toediening. De beoordeling van cytokines en gewichtsmonitoring zijn cruciaal voor het bepalen van CART-geassocieerde toxiciteiten, en MRI definieert het begin van NI. De nadelen van dit model zijn als volgt: 1) omdat PDX ALL-cellen er langer over doen om te enten en een hoge tumorlast te bereiken, duurt het ongeveer 2-3 maanden van tumorcelinenting tot CART19-celbehandeling; 2) als primair PDX-model is er een significante variabiliteit van patiënt tot patiënt met betrekking tot de tijd tot transplantatie en respons op CART-celtherapie; 3) tumorbelasting kan niet worden beoordeeld met bioluminescentiebeeldvorming en vereist frequente perifere bloedbeoordeling; en 4) het gebrek aan aangeboren immuuncellen beperkt het vermogen van dit model om CART-interacties met immuuncellen of de micro-omgeving van de tumor te bestuderen.

De interesse in het testen van adoptieve cellen binnen complexere muismodellen is het afgelopen decennium gegroeid, omdat het duidelijk is geworden dat eenvoudige immunodeficiënte muismodellen geen ideale preklinische modellen zijn. Het PDX-muismodel dat hier wordt beschreven om CART-celgerelateerde toxiciteiten te beoordelen, vertegenwoordigt een veelbelovend preklinisch model op het gebied van CART-celtherapie, omdat het de tijdlijn, symptomen en markers van CRS en NI na CART-celinfusie nabootst, zoals gezien in de kliniek. Over het algemeen biedt de hier beschreven methodologie een robuust platform voor het beoordelen van CART19-celgeassocieerde toxiciteiten en werkzaamheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.S.K. is een uitvinder van patenten op het gebied van CAR-immunotherapie die in licentie zijn gegeven aan Novartis (via een overeenkomst tussen Mayo Clinic, University of Pennsylvania en Novartis) en aan Mettaforge (via Mayo Clinic). R.L.S. en S.S.K. zijn uitvinders van patenten op het gebied van CAR-immunotherapie die in licentie zijn gegeven aan Humanigen. S.S.K. ontvangt onderzoeksfinanciering van Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs en Lentigen.

Acknowledgments

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Department of Defense (CA201127), Mayo Clinic K2R-pijplijn (SSK), het Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) en de Predolin Foundation (R.L.S.). Daarnaast willen we de medewerkers van Mayo Clinic NMR Core Facility bedanken. Figuur 1 is gemaakt in BioRender.com

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Cancer Research. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

Cancer Research CART cell CART cell-associated toxicities patient-derived xenograft (PDX) model cancer therapy in vivo preclinical model

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manriquez Roman, C., Sakemura, R.… More

Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter