Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64535
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1,2, 1,2, 6, 6, 1,2, 1,2, 6, 1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

ERRATUM NOTICE

Summary

Burada, akut lenfoblastik lösemi hastası kaynaklı ksenogreft modelinin, CD19 hedefli kimerik antijen reseptörü T hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek ve izlemek için bir strateji olarak kullanıldığı bir protokol tanımlanmıştır.

Abstract

Kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, birden fazla CD19 + malignite tipinin tedavisi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır ve bu da yakın zamanda birkaç CD19 hedefli CART (CART19) hücre tedavisinin FDA onayına yol açmıştır. Bununla birlikte, CART hücre tedavisi, kendi morbidite ve mortalitelerini taşıyan benzersiz bir dizi toksisite ile ilişkilidir. Buna sitokin salınım sendromu (CRS) ve nöroinflamasyon (NI) dahildir. Klinik öncesi fare modellerinin kullanımı, hem CART etkinliğini hem de CART toksisitesini değerlendirmek için CART teknolojisinin araştırılması ve geliştirilmesinde çok önemli olmuştur. Bu adoptif hücresel immünoterapiyi test etmek için mevcut preklinik modeller arasında sinjeneik, ksenogreft, transgenik ve insanlaştırılmış fare modelleri bulunur. İnsan bağışıklık sistemini sorunsuz bir şekilde yansıtan tek bir model yoktur ve her modelin güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bu yöntem makalesi, CART19 ile ilişkili toksisiteleri, CRS ve NI'yi değerlendirmek için bir strateji olarak akut lenfoblastik lösemili hastalardan lösemik blastlar kullanan hasta kaynaklı bir ksenogreft modelini tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu modelin, klinikte görüldüğü gibi terapötik etkinliğin yanı sıra CART19 ile ilişkili toksisiteleri özetlediği gösterilmiştir.

Introduction

Kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, kanser immünoterapisi alanında devrim yaratmıştır. Nüks/refrakter akut lenfoblastik lösemi (ALL), büyük B hücreli lenfoma, manto hücreli lenfoma, foliküler lenfoma ve multipl miyelom 1,2,3,4,5,6,7 tedavisinde başarılı olduğu kanıtlanmıştır ve bu da son FDA onaylarına yol açmıştır. Klinik çalışmalardaki ilk başarıya rağmen, CART hücre tedavisi ile tedavi, genellikle şiddetli ve bazen ölümcül olan toksisitelere neden olur. CART hücre tedavisinden sonra en yaygın toksisiteler, immün efektör hücre ile ilişkili nörotoksisite sendromu (ICANS) olarak da adlandırılan CRS ve NI'nin gelişimini içerir8,9. CRS, CART hücrelerinin in vivo aşırı aktivasyonu ve büyük genişlemesi nedeniyle ortaya çıkar ve daha sonra interferon-γ, tümör nekroz faktörü-α, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve interlökin-6 (IL-6) dahil olmak üzere çoklu inflamatuar sitokinlerin salgılanmasına yol açar. Bu durum hipotansiyon, yüksek ateş, kılcal damar kaçağı sendromu, solunum yetmezliği, çoklu organ yetmezliği ve bazı durumlarda ölümle sonuçlanır10,11. CRS, CART19 hücre tedavisinden sonra vakaların% 50-100'ünde gelişir11,12,13. ICANS, CART hücre tedavisi ile ilişkili bir başka benzersiz advers olaydır ve genelleştirilmiş serebral ödem, konfüzyon, obtundasyon, afazi, motor güçsüzlük ve bazen nöbetler ile karakterizedir 9,14. Hastaların %70'ine kadar herhangi bir ICANS derecesi görülür ve hastaların %20-30'unda Derece 3-4 bildirilir 5,10,15,16. Genel olarak, CRS ve ICANS yaygındır ve ölümcül olabilir.

CART hücre tedavisinden sonra ICANS'ın yönetimi zordur. ICANS'lı hastaların çoğu, genellikle IL-6 reseptör antagonisti tocilizumab veya steroidler18 ile tedavi edilebilen CRS17'yi de yaşar. Önceki bir rapor, tocilizumab ile erken müdahalenin şiddetli CRS oranını azalttığını, ancak ICANS19'un insidansını veya şiddetini etkilemediğini ortaya koydu. Şu anda, ICANS için etkili bir tedavi veya profilaktik ajan yoktur ve önleyici stratejilerin araştırılması çok önemlidir20.

Miyeloid hücrelerin ve ilişkili sitokinlerin/kemokinlerin, CRS ve ICANS21'in gelişiminin ana itici güçleri olduğu düşünülmektedir. KRS, sitokinlerin aşırı yükselmesi ve T hücre genişlemesi ile doğrudan ilişkili olsa da, ICANS'ın patofizyolojisi büyük ölçüde bilinmemektedir22,23. Bu nedenle, mekanizmaları incelemek ve önleyici stratejiler geliştirmek için CART hücre tedavisinden sonra bu toksisiteleri özetleyen bir fare modeli oluşturmak zorunludur.

Şu anda CART hücrelerinin etkinliğini incelemek, optimize etmek ve doğrulamak ve ayrıca ilişkili toksisitelerini izlemek için kullanılan çok sayıda klinik öncesi hayvan modeli vardır. Bunlar, primat modellerine ek olarak sinjeneik, ksenogreft, immünokompetan transgenik, insanlaştırılmış transgenik ve hasta kaynaklı ksenogreft farelerini içerir. Bununla birlikte, bu modellerin her birinin dezavantajları vardır ve bazıları CART hücrelerinin gerçek etkinliğini veya güvenlik endişelerini yansıtmamaktadır24,25. Bu nedenle, çalışmanın amaçlanan hedefleri için en iyi modeli dikkatlice seçmek zorunludur.

Bu makale, ALL hastadan türetilmiş bir ksenogreft (PDX) in vivo model kullanarak CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri, CRS ve NI'yi değerlendirmek için kullanılan metodolojiyi açıklamayı amaçlamaktadır (Şekil 1). Spesifik olarak, burada açıklanan yöntemlerde, yazarların laboratuvarında üretilen CART19 hücreleri, daha önce açıklanan protokoller izlenerek kullanılır. Kısaca, insan T hücreleri, sağlıklı donör periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) bir yoğunluk gradyan tekniği ile izole edilir, 0. günde CD3/CD28 boncukları ile uyarılır ve 1. günde 4-1BB ve CD3ζ sinyal alanlarına kaynaşmış bir CD19 hedefli tek zincirli değişken fragmandan oluşan CAR'larla lentiviral olarak transdüksiyona tabi tutulur. Bu CART hücreleri daha sonra genişletilir, 6. günde boncukları çıkarılır ve 8. günde 26,27,28,29,30. günde dondurularak saklanır. Daha önce belirtildiği gibi, fareler lenfodeplesyon tedavisine tabi tutulur, ardından hasta kaynaklı lösemik blastlar (ALL) uygulanır28. İlk olarak, tümör aşılaması submandibular kan alma yoluyla doğrulanır. Uygun bir tümör yükünün oluşturulmasını takiben, CART19 hücreleri farelere uygulanır. Daha sonra, fareler refahı değerlendirmek için günlük olarak tartılır. NI'yi değerlendirmek için küçük hayvan manyetik rezonans görüntüleme (MRI), T hücresi genişlemesini ve sitokin / kemokin üretimini değerlendirmek için kuyruk kanaması ile birlikte yapılır. Aşağıda açıklanan tekniklerin, bir PDX modelinde CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri incelemek için bir model olarak kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC A00001767) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC, Bios00000006.04) yönergelerini takip eder.

NOT: Farelerle çalışmak için kullanılan tüm malzemeler steril olmalıdır.

1. NSG farelerine busulfan enjeksiyonu

  1. Erkek, 8-12 haftalık, bağışıklığı baskılanmış, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) fareler edinin ve enjeksiyondan önce tartın.
    NOT: İstatistiksel anlamlılık için, grup başına en az beş fare kullanılması ve bu deneyin dişi farelerle en az bir kez daha tekrarlanması önerilir.
  2. Busulfan'ı intraperitoneal (i.p.) enjeksiyon için hazırlayın. 1 mL'lik bir insülin şırıngası kullanarak, şırıngayı tam olarak 30 mg / kg busulfan ile yavaş ve dikkatli bir şekilde doldurun, ardından farelere i.p enjeksiyonu yapın ve tekrar kafese yerleştirin.

2. NSG farelerine TÜM hasta kaynaklı blastların (CD19+) enjeksiyonu

NOT: Bu protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC, Bios00000006.04) yönergelerini takip eder.

  1. Nüks ve refrakter ALL'li hastaların periferik kanından primer lösemik patlamaları toplayın.
  2. Hedef hücreleri intravenöz (i.v.) enjeksiyon için hazırlayın.
    1. Bir hemositometre kullanarak CD19 + hedef hücrelerini sayın ve hücrelerin son hacmini ve konsantrasyonunu kaydedin.
      NOT: Hücre canlılığını belirlemek için, hücreleri sayarken tripan mavisi kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
    2. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyerek pelet haline getirin.
    3. Hücre peletini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 50 ×10 6 hücre/mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin ve buz üzerine yerleştirin.
    4. Hedef hücreleri içeren 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpünü, hücreler tamamen homojen hale gelene kadar parmakla girdaplayın.
    5. 1 mL'lik bir insülin şırıngası kullanarak, şırıngayı tam olarak 100 μL hazırlanan hedef hücrelerle yavaşça ve dikkatlice doldurun ve kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı hafifçe vurun.
      NOT: 100 μL'lik hacim, her fareye 5 × 106 hücre uygulayacaktır.
    6. Fareleri 5-10 dakika ılık ışık altına koyun. Kuyruk damarı tıkandığında ve çıplak gözle daha görünür hale geldiğinde, fareleri uygun bir hapsetme/kısıtlama odasına yerleştirin.
    7. Farenin kuyruğunu alkollü bir bezle silin. Hedef hücreleri doğrudan kuyruk damarına (i.v.) enjekte edin ve fareyi kafese geri yerleştirin. Hedef hücrelerin aşılanmasından sonra, fareleri günlük olarak veya yerel hayvan etik komitesi tarafından önerildiği şekilde izleyin.

3. Tümör aşılama değerlendirmesi

  1. Hedef hücre enjeksiyonundan 6 hafta sonra başlayarak, periferik kandaki CD19 + hücrelerinin ekspresyonunu ölçmek için akış sitometrisi kullanarak tümör aşılamasını değerlendirin.
  2. CD19 + genişlemesini değerlendirmek için periferik kan testi
    1. CART19 hücre enjeksiyonundan 6-8 hafta sonra farelerden kan alın.
      NOT: Kan almak için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Bu protokol için submandibular kan alma tercih edilen yöntemdir.
    2. Fareyi% 5 izofluran içeren bir indüksiyon odasında izofluran ile uyuşturun. Anestezi sağlandıktan sonra, bir burun konisinden solunan izofluranın% 1-3'ünde tutun.
      NOT: Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürülmesi şiddetle tavsiye edilir.
    3. Fareyi hazneden çıkarın ve gevşek deriyi boynundan kavrayarak baskın olmayan elinizle tutun. Damarı mandibulanın biraz arkasında bir neşter ile delin.
      NOT: Damara girmek için sadece iğne ucu (1-2 mm) gereklidir.
    4. Kan damlarken, heparin kaplı bir tüpte en az 50 μL toplayın ve tüpü birkaç kez yukarı ve aşağı çevirerek iyice karıştırın. 30 μL kanı 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polistiren tüpe aktarın.
      NOT: Kalan kan için, tüpü 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17.000 × g'da döndürün. Serumu (süpernatan tabaka) temiz ve etiketli 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve −80 ° C'de saklayın (sitokin testinde kullanım için).
    5. Kanı içeren 5 mL'lik yuvarlak tabanlı tüpe 2 mL lizis tamponu (nükleaz içermeyen su kullanılarak 1x'e seyreltilmiş 10x amonyum klorür bazlı parçalama tamponu) ekleyin. Tüpü girdaplayarak çok iyi karıştırın. Kırmızı kan hücrelerinin uygun şekilde parçalanmasını sağlamak için tüpü oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
    6. 2 mL akış tamponu ekleyin (PBS, 0.2 g / L potasyum klorür, 0.2 g / L potasyum fosfat monobazik, 8 g / L sodyum klorür ve 1.15 g / L sodyum fosfat dibazik % 2 fetal sığır serumu ve% 1 sodyum azid içerir).
    7. Tüpü 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve 2 mL akış tamponu ekleyin. Bu yıkama adımını 2 kez tekrarlayın.
    8. Tüpün içeriğini dikkatlice boşaltın. Tüpte kalan bir pelet ile az miktarda sıvıyı gözlemleyin. 100 μL akış tamponu ekleyin ve çok iyi bir şekilde yeniden süspanse edin.
    9. 5 mL akış tüpünde kalan tüm sıvıyı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Her numunenin uygun şekilde etiketlendiğinden emin olun. İlgili kuyucuklara 100 μL akış tamponu ekleyin ve 96 oyuklu plakayı 650 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
  3. Akış sitometrisi ile CD19+ hedef hücrelerinin genişlemesini değerlendirin (Şekil 2).
    1. 0.3 μL canlı/ölü leke, 0.13 μg (2.5 μL) anti-insan CD19 antikoru, 0.06 μg (2.5 μL) anti-insan CD45 antikoru, 5 μg (2.5 μL) anti-fare CD45 ve 42.2 μL akış tamponu içeren bir ana karışım hazırlayın ve numune başına toplam 50 μL. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
    2. 150 μL akış tamponu ile yıkayın, ardından 650 × g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve peleti 195 μL akış tamponu ve 5 μL sayma boncuğu içinde yeniden süspanse edin.
    3. CD19 + hücre ekspresyonunun seviyesini belirlemek için bir akış sitometresinde edinin. Geçit ve analiz amacıyla, önce ileri ve yan saçılma özelliklerine dayalı olarak ilgilenilen popülasyonu (CD19+), ardından tek bir geçit popülasyonu ve ardından canlı hücreler geçit sağlar. Canlı hücreler kapılandıktan sonra, insan CD45 ile fare CD45 popülasyonunu değerlendirin ve insan popülasyonundan CD19 + hedef popülasyonunu kapılayın.
  4. 70 μL'de bulunan miktarı belirlemek için nicelleştirin ve ardından denklem (1)'i kullanarak hücreler/μL cinsinden ifade edin:
    Mutlak CD19+ hücre sayısı = ([CD19+ hücreler/boncuk sayma] × 5 μL içindeki boncuk sayma sayısı)/70
    NOT: CD19 + hücre genişlemesini değerlendirmek için periferik kan testini her 5 günde bir tekrarlayın. Yerel hayvan etik komitesi yönergelerine uygun olarak her 2 haftada bir kümülatif olarak 200 μL'den fazla kan toplamayın. Fareler ≥10 hücre/μL'lik bir hastalık yüküne ulaştığında, CART19 hücresine veya kontrol gruplarına randomize edin (bölüm 4).

4. CART19 hücrelerinin in vivo olarak uygulanması

  1. CART19 hücrelerinin hazırlanması (~ Gün 80):
    NOT: CART19 hücrelerinin oluşturulması daha önce 27,30,31 yayınlanmıştır. Bu prosedür, aseptik teknik ve kişisel koruyucu ekipman kullanılarak Seviye 2+ Biyogüvenlik Kabini içinde gerçekleştirilmelidir.
    1. CART19 hücrelerini bir su banyosu kabında (37 °C) çözdürün. Ardından, dimetil sülfoksiti çıkarmak için hücreleri ılık T hücresi ortamında (TCM) yıkayın.
      NOT: TCM, %10 insan AB serumu (h/v), %1 penisilin-streptomisin-glutamin (h/v) ve serumsuz hematopoietik hücre ortamından 27,30'dan yapılmıştır.
    2. CART19 hücrelerini 300 × g'da 8 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin ve ılık TCM'de 2 × 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin. CART hücrelerinin bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) gece boyunca dinlenmesine izin verin, ancak 16 saatten fazla olmamalıdır.
  2. CART19 hücrelerinin i.v. enjeksiyonu ile uygulanması (Gün ~ 80)
    1. CART19 hücrelerini sayın ve 300 ° C'de 8 dakika boyunca 4 × g'da döndürün.
    2. CART19 hücrelerini 10 mL PBS ile yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 8 dakika boyunca 300 × g'da döndürün.
    3. CART19 hücrelerini PBS ile 40 × 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin, hücreleri steril bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin.
    4. 100 μL yeniden süspanse hücre iv enjekte ederek CART19 hücre kuyruk damarı enjeksiyonlarını (yukarıda detaylandırıldığı gibi) gerçekleştirin.
      NOT: 100 μL'lik bir hacim, her fareye 4 × 106 hücre uygulayacaktır. Negatif kontrol olarak bir grup tedavi edilmemiş fareyi dahil edin.

5. CART19 hücresi ile ilişkili toksisitelerin değerlendirilmesi

  1. CART19 hücre uygulamasından sonra, motor zayıflığı, kambur vücut ve vücut ağırlığı kaybı gibi sağlıklarındaki değişiklikleri değerlendirmek için fareleri günde 2 kez izleyin.
    NOT: Tüm bu fiziksel değişiklikler, bu modeldeki KRS semptomları ile ilişkilidir28.
  2. Fareler motor güçsüzlük ve kilo kaybı geliştirmeye başladığında (taban çizgisinden% 10-20 azalma), tümör yükünü analiz etmek için periferik kan toplayın ve bölüm 3'te açıklanan metodolojiye göre sitokinler için serum izolasyonu yapın (Şekil 3).
  3. Serum mikrosantrifüj tüplerini −80 °C'de saklayın ve serumları bir Multipleks testi kullanarak kemokinleri ve sitokinleri analiz etmek için kullanın (Şekil 4).
    NOT: Fareler arka bacak felci belirtileri gösteriyorsa, can çekişiyor veya uyuşuk görünüyorsa ve kilo kaybı, yiyecek ve / veya suya ulaşma yeteneklerini sınırlayan noktaya kadar vücut ağırlıklarının >% 20'si ise, ötenaziye tabi tutulacaklardır.

6. MRI görüntüleme

NOT: İn vivo manyetik rezonans ve görüntü elde etmek için dikey delikli mıknatıslı klinik öncesi (küçük hayvanlar için) bir MRI tarayıcı kullanıldı32,33.

  1. 120 μL Gadolinyum + 880 μL salin solüsyonunu karıştırın ve 1 mL'lik bir insülin şırıngasına yükleyin. Her fareye 100 μL enjekte edin (i.p.).
    NOT: Gadolinyum, deneyin başlamasından 15-20 dakika önce enjekte edilmelidir.
  2. Fareyi 10-15 dakika boyunca bir indüksiyon odasında izofluran (% 2-3) kullanarak uyuşturun.
    NOT: Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürülmesi şiddetle tavsiye edilir.
  3. Fare omurgasını kemirgenlerle uyumlu yuva probunun üzerine yerleştirin. Ardından, dişlerini ısırma çubuğuna asarak fareyi konumlandırmaya devam edin.
  4. Farenin kafasını 25 mm hacimli bobine çekin ve izofluran anestezi sistemine bağlı burun konisini ayarlayın. Tarama süresince konumu korumak için ısırma çubuğunun düğmesini sıkın.
    NOT: Kontrastlı bir MRI taraması yapıyorsanız, cihazı delik mıknatısına yerleştirmeden en az 10 dakika önce gadolinyum (bu durumda) veya kontrast maddenin enjekte edildiğinden emin olun. Görüntüleme süresi boyunca, fareler burun konisi yoluyla havada% 2-3 izofluran solunarak uyuşturulacak ve solunum hızları eş zamanlı olarak izlenecektir.
  5. Solunum değerlendirmesi için bir solunum/solunum izleme cihazı kullanın.
    NOT: Anesteziye uzun süre maruz kalma nedeniyle olası hipotermiyi önlemek için vücut ısısının da değerlendirilmesi önemlidir. Vücut ısısını kontrol etmek için ısı yastıklarının kullanılması tavsiye edilir.
    1. Solunum monitörü probunu diyaframa yakın bir yere takın ve cerrahi bantla sabitleyin. Farenin durumunun stabil olması için solunum hızını dakikada 20-60 nefes arasında tutun.
      NOT: Bu oran daha stabil MRI görüntüleri sağlar ve elde edilen görüntüde hareket artefaktlarını önler. Solunum hızı dakikada 20-60 nefes aralığından yüksekse, izofluran konsantrasyonunu arttırın. Solunum hızı dakikada 20 nefesten azsa, anestezi çok derindir; Bu nedenle konsantrasyonun azaltılması gerekir.
  6. Hayvan sondasını dikey delikli küçük hayvan MRI sistemi içindeki küçük deliğe yerleştirin. Hayvanın kafasını bobinin ortasına ayarlayın. Dik durabilmesi için cihazı kilitle sabitleyin ve cihazı bilgisayara bağlayın.
  7. Tarama konumlarını ve tarama türlerini ayarlamak için yazılımı (örneğin, Paravision) açın ve kullanın. Tüm deney grupları için tutarlı tutarken optimal eksenel ve sagital pozisyonları belirleyin.
    NOT: Gerçek tam uzunlukta MRI taramalarından önce referans olarak bir deneme taramasının alınması önerilir.
  8. MRG veri toplamaya devam edin (daha önce açıklandığı gibi32,34,35,36). Aşağıda belirtilen önerilen kurulumu kullanarak hem T1 ağırlıklı hem de T2 ağırlıklı MRI görüntüleri elde edin.
    1. T1 ağırlıklı MRG görüntüleri için, 300 ms tekrarlama süresi (TR), 9,5 ms yankı süresi (TE), 4 cm x 2 cm x 2 cm görüş alanı (FOV) ve 192 x 96 x 96 matris ile T1 ağırlıklı çok kesitli multiecho (MSME) dizisi kullanın.
    2. T2 ağırlıklı MRG görüntüleri için, TR 300 ms, TE 9.5 ms, FOV 4 cm x 2 cm x 2 cm ve 192 x 96 x 96 matris ile Çok Kesitli Multiecho (MSME) dizisi kullanın.
  9. Taramalar tamamlandıktan sonra probu delikten çıkarın. Dişleri ısırma çubuğundan çıkararak fareyi nazikçe çıkarın. Hayvanı tamamen bilinçli olana ve yeterli motor fonksiyonunu yeniden kazanana kadar ayrı bir kafeste izleyin.
  10. Yazılımdan verilerin çıkarılmasından sonra, hiperyoğunluk bölgelerinin nicelleştirilmesi ve 3B hacim oluşturma (Şekil 4) için analiz yazılımı kullanın.
    NOT: Mümkünse, veri analizi için iki ayrı kör gözlemcinin olması şiddetle tavsiye edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolün amacı, ALL'li hastaların tümör hücrelerinden bir PDX fare modeli kullanarak CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmektir (Şekil 1). İlk olarak, NSG fareleri, immünosupresif hale getirmek ve CART hücre aşılamasını kolaylaştırmak amacıyla i.p. busulfan (30 mg / kg) enjeksiyonları aldı28. Ertesi gün, TÜM hastalardan türetilen ~ 5 × 106 PBMC (i.v.) aldılar. Fareler, kuyruk kanaması testi ile ~ 13 hafta boyunca aşılama açısından izlendi. Kırmızı kan hücreleri toplandı ve parçalandı, ardından CD19+ tümör hücrelerinin ekspresyonunu değerlendirmek için akış sitometrisi preparatı yapıldı (Şekil 2).

Fareler ≥10 tümör hücresi / μL'ye ulaştığında, randomize edildi ve 4 × 106 CART19 hücresi (i.v.) almaya hazırlandı. CART19 ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek için fareler günde bir kez tartıldı (Şekil 3A). Kilo kaybı, daha önce CART hücresi ile ilişkili toksisiteler28,37 ile ilişkili olduğu ortaya çıktığı için KRS görünümünün bir belirtisi olarak seçilmiştir. İnsan CD19+ tümör hücrelerinin ve insan CD3+ T hücrelerinin akış sitometri analizi ile tümör yükünü ve CART hücre genişlemesini değerlendirmek için periferik kan tahlilleri (submandibular kan toplama yoluyla) gerçekleştirildi. Ek olarak, serum toplandı ve inflamatuar sitokinlerin bir değerlendirmesi yapıldı. Testler, CART19 hücre infüzyonundan bir gün önce ve CART19 hücre infüzyonundan 5 ve 10 gün sonra yapıldı, çünkü bu zaman noktaları özellikle CRS başlangıcı ve semptomların gelişimi ile ilgilidir.

Burada, özellikle, en temsili sitokinlerin ve kemokinlerin GM-CSF, IL-18, MIP-1α ve IP-10 olduğu CART19 hücre uygulamasından önce ve sonra bir Multipleks testi gerçekleştirildi (Şekil 3B). Bununla birlikte, serumdaki bu proteinlerin konsantrasyonlarını değerlendirmek için başka testler de yapılabilir. Alternatif olarak, fareler, merkezi sinir sistemindeki (CNS) vasküler geçirgenliği değerlendirmek için MRI taramasına tabi tutuldu. Farelere, beyin iltihabını ve kan-beyin bariyeri bozulmasını ölçmek için kontrast reaktif gadolinyum (ip) enjekte edildi38. Daha sonra izofluran ile uyuşturuldular ve kontrastlı T1 ağırlıklı ve T2 ağırlıklı görüntüler alındı (Şekil 4). T2 görüntülerinde (Şekil 4, solda) daha parlak olan bölüm (beyaz), daha çok beyin tümörlerinde ve iltihabında görülen ödem veya sıvının varlığını gösterir. T1 görüntülerinde (Şekil 4, ortada), daha parlak bölümler kan sızıntısı veya kan-beyin bariyerinin bozulması olan alanları gösterir. Son olarak, yazılım yardımıyla, 3D rekonstrüksiyon görüntüleri (Şekil 4, sağda), beyindeki gadolinyum sızıntısının hacmini oluşturan vasküler geçirgenliğe karşılık gelen hiperyoğunluk sinyallerine dayanan gadolinyumla güçlendirilmiş T1 görüntüleri kullanılarak birleştirildi34.

Figure 1
Şekil 1: CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri, sitokin salınım sendromunu ve nöroinflamasyonu değerlendirmek için kullanılan hasta kaynaklı bir ksenogreft modelinin deneysel şeması. NSG fareleri 30 mg / kg busulfan (i.p.) ile şartlandırıldı ve ALL'li hastaların periferik kanından elde edilen 3 × 10 6-5 × 106 blast (i.v.) aldı. Daha sonra, fareler submandibular kan toplama yoluyla tümör aşılaması açısından izlendi, ardından CD19 + patlamalarını değerlendirmek için akış sitometrisi yapıldı. Periferik kan CD19+ hücreleri ≥10 hücre / μL olduğunda, fareler 2 × 10 6-5 × 106 CART19 hücresi aldı. Fareler, refahlarının bir ölçüsü olarak günlük olarak tartıldı. CART19 hücre infüzyonundan 10 gün sonra, nöroinflamasyonu tespit etmek için fare beyni MRI'ları yapıldı. Sitokin/kemokin üretimini ve T hücre genişlemesini değerlendirmek için kuyruk kanaması, CART19 hücre enjeksiyonundan sonra haftalık olarak gerçekleştirildi. Kısaltmalar: CART = kimerik antijen reseptörü T hücresi; CART19 = CD19 hedefli CART; ALL = akut lenfoblastik lösemi; i.v. = intravenöz; i.p. = intraperitoneal; PB = periferik kan; NSG = NOD-SCID IL2rγnull. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek için bir ALL PDX modelinde tümör yükünün bir göstergesi olarak CD19+ tümör hücrelerinin analizi. (A) Hastadan türetilen ALL patlamaları enjekte edilen bir farenin periferik kan örneğinden alınan CD19+ hücre popülasyonunu analiz etmek için geçit stratejisini gösteren temsili akış sitometrik analizi. (B) Akış sitometrisi analizinden elde edilen ham verilere dayalı olarak CART19 ile tedavi edilen fareler ile tedavi edilmeyen fareler arasındaki CD19 + hücre popülasyonlarının ölçülmesi ve karşılaştırılması. (tek yönlü ANOVA; n = grup başına 3 fare; hata çubukları, SEM). Kısaltmalar: ns = anlamlı değil; ALL = akut lenfoblastik lösemi; PDX = hasta kaynaklı ksenogreft; CART = kimerik antijen reseptörü T hücresi; CART19 = CD19 hedefli CART; SSC-H = yan saçılma-tepe yüksekliği; FSC-H = ileri saçılma-tepe yüksekliği; SSC-A = yan saçılma-tepe alanı; FSC-A = ileri saçılma-tepe alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: ALL PDX modeli kullanılarak CART19 ile ilişkili toksisitelerin değerlendirilmesi. (A) CART'tan sonraki ilk 6 gün boyunca CART19 hücreleri ile tedavi edilen veya transdüksiyona uğramamış T hücrelerini kontrol eden farelerde ağırlık azaltma yüzdesinin temsili grafiği (iki yönlü ANOVA, ***p < 0.001, ****p < 0.00001; hata çubukları, SEM). (B) CART19 hücre uygulamasından önce ve sonra NSG fare serumunda sitokinlerin ve kemokinlerin ekspresyonu. NSG fareleri, serumlarını toplamak ve aşağıdaki sitokinlerin ve kemokinlerin ekspresyonunu değerlendirmek için CART19 hücre uygulamasından (i.v.) önce ve sonra submandibular kanamaya maruz bırakıldı: GM-CSF, IL-18, MIP-1α, IP-10, IL-1β ve IL-6 (iki yönlü ANOVA, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; n =3 fare; dokuz teknik kopya; hata çubukları, SEM) olarak adlandırılır. Kısaltmalar: ns = anlamlı değil; ALL = akut lenfoblastik lösemi; PDX = hasta kaynaklı ksenogreft; CART = kimerik antijen reseptörü T hücresi; CART19 = CD19 hedefli CART; NSG = NOD-SCID IL2rγnull; GM-CSF = granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör; IL-18 = interlökin-18; MIP-1α = makrofaj inflamatuar protein-1 alfa; IP-10 = interferon gama kaynaklı protein 10; IL-1β = interlökin-1β; IL-6 = interlökin-6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Bir PDX modelinde CART19 hücre tedavisi sırasında nöroinflamasyonu değerlendirmek için kullanılan manyetik rezonans görüntüleme. TÜM hastalardan türetilen tümör hücreleri ile aşılanmış NSG farelerine CART19 hücreleri aşılandı ve fareler CART infüzyonundan sonraki 10 gün içinde nörolojik semptomlar gösterdikten sonra beyinler gadolinyumla zenginleştirilmiş MRI ile görüntülendi. (Solda) CART19 ile tedavi edilen farelerde NI sırasında ödem ve olası inflamatuar infiltrasyon kanıtlarını ortaya çıkaran T2 ağırlıklı görüntü (kırmızı ok). (Ortada) CART19 ile tedavi edilen farelerde artmış vasküler geçirgenliği gösteren, beyin parankimi içinde kontrast artışı gösteren T1 ağırlıklı MRG'nin temsili eksenel kesiti (kırmızı ok). (Sağda) Kemirgen beyninin T1-hiperintensite bölgeleri (kırmızı) ile üç boyutlu rekonstrüksiyonları Analyze 12.0 yazılımı kullanılarak oluşturuldu. Kısaltmalar: MRI = manyetik rezonans görüntüleme; ALL = akut lenfoblastik lösemi; PDX = hasta kaynaklı ksenogreft; CART = kimerik antijen reseptörü T hücresi; CART19 = CD19 hedefli CART. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İnsan Fare
Sitokin / Kemokin İnsan miyeloid sitokinleri (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1) İnsan miyeloid sitokinleri (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1)
CRS'ye Kadar Geçen Süre (Gün) 2-5 4-6
NI'ye Kadar Geçen Süre (Gün) 5-7 6-8
BBB durumu BBB kesintisi BBB kesintisi
Dokuda yerleşik makrofaj Mikroglial aktivasyon Mikroglial aktivasyon
CNS'de CART hücresi Beyin infiltrasyonu Beyin infiltrasyonu

Tablo 1: ALL PDX modeli ile klinik olarak gözlenen CART hücresi ile ilişkili toksisitelerin özetlenmesi. Kısaltmalar: GM-CSF = granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör; IL = interlökin; CRS = sitokin salınım sendromu; NI = nöroinflamasyon; BBB = kan-beyin bariyeri; CNS = merkezi sinir sistemi; MCP-1 = monosit kemoatraktan protein 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu raporda, bir ALL PDX modeli kullanarak CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek için bir metodoloji tanımlanmıştır. Daha spesifik olarak, bu model, hastaların CART hücrelerinin infüzyonundan sonra sıklıkla yaşadığı yaşamı tehdit eden iki toksisiteyi, CRS ve NI'yi taklit etmeyi amaçlamaktadır. Klinikte gözlenen CART toksisitelerinin birçok ayırt edici özelliğini özetler: kilo kaybı, motor disfonksiyon, nöroinflamasyon, inflamatuar sitokin ve kemokin üretimi ve farklı efektör hücrelerin merkezi sinir sistemine infiltrasyonu 8,20,28. Daha önce, bu PDX modeli, CRS ve NI'nin ilk gelişimini taklit etmek ve toksisitenin önlenmesi ve tedavisi için farklı stratejileri değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu PDX modelindeki bir çalışmada, GM-CSF'den yoksun CART19 hücreleri kullanılmıştır. Daha spesifik olarak, bu sonuçlar, GM-CSF tükenmesinin, CRS'ye bağlı sitokinlerin ve kemokinlerin salgılanmasının azalmasına neden olduğunu gösterdi ve bu, bu ALL PDX fare modeli29 kullanılarak açıkça gösterildi. Bu PDX modeli, bir görüntüleme platformu olarak bir sodyum iyodür sempatörü (NIS) kullanılarak CART19 hücre infüzyonundan sonra CRS gelişimi ile ilişkili CART hücresinin in vivo genişlemesini değerlendirmek için de başarıyla kullanılmıştır26. Bu nedenle, önerilen bu model, CART hücrelerinden kaynaklanan potansiyel toksisiteleri değerlendirmek için kullanılabilecek yararlı bir aracı temsil etmektedir.

CART hücrelerini in vivo olarak incelemek için başka birçok modelin kullanıldığını belirtmek önemlidir. Bunlar, ksenojenik modellere ek olarak sinjeneik, transgenik ve insanlaştırılmış fare modellerini içerir24. İmmünkompetan allogreft fare modeli olarak da adlandırılan sinjeneik fare modeli, CART hücrelerini, tümörü ve murin kökenli hedef antijenleri kullanır. Bu, CART hücrelerinin tamamen işlevsel bir bağışıklık sisteminde incelenmesine izin verdiği ve ayrıca hedefte, tümör dışı toksisiteleri ortaya çıkarabildiği için avantajlıdır. Bu modelin dezavantajı, fare biyolojisi ve bağışıklığının insanlarınkinden farklı olmasıdır ve bu nedenle, amacın klinik araştırmalara devam etmek olduğu translasyonel çalışmalar için uygun bir model değildir24,39.

İmmünkompetan transgenik fare modelleri, insan dokularında bulunanları taklit eden desenlerde hem sağlıklı doku hem de tümörler üzerinde bir insan tümörü ile ilişkili antijen (TAA) transgenini eksprese eder. Bu fareler, hedef tümör dışı etkileri ortaya çıkararak CART hücrelerinin güvenliğini daha iyi değerlendirmek için CART çalışmalarında da kullanılmıştır40,41. CD34+ insan hematopoietik kök hücreleri ile implante edilen insanlaştırılmış fareler, insan hematopoietik sistemi üzerindeki CART etkinliğini ve toksisitesini incelemek için avantajlı bir model olabilir, çünkü sulandırılmış bağışıklık sistemi CART inhibisyonunu taklit edebilir ve klinikte görülen CRS'yi özetleyen bir sitokin fırtınasını indükleyebilir42,43,44. Bu modeller, CART etkinliği ile ilgili olarak spesifik bağışıklık hücrelerinin incelenmesine izin verse de, insanlaştırılmış sistem hala ilkeldir ve daha fazla optimizasyona ihtiyaç duyar. Ek olarak, sağlıklı doku üzerindeki konakçı antijenlerin çoğu murin kökenli olduğundan, hedef dışı etkilerin incelenmesinde kullanımları sınırlıdır. Ayrıca, CD34+ insanlaştırılmış fare modelinin geliştirilmesi teknik olarak zordur45. Bununla birlikte, bağışıklığı baskılanmış farelerde insan ksenogreft modelleri, klinik çalışmalara geçmeden önce insan CART hücre etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır ve bu yazıda gösterildiği gibi, CART hücre aktivitesi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek için kullanılabilirler. Bununla birlikte, bağışıklık sistemi ve T hücreleri ve NK hücreleri gibi bağışıklık hücrelerinin eksikliği, tümör dışı hedef toksisitesini, CART hücrelerinin doğuştan gelen bağışıklık hücreleri ile etkileşimlerini ve tümör mikroçevresi tarafından CART hücre inhibisyonunu değerlendirmek için uygulamalarını sınırlar.

Burada açıklanan protokolün avantajı, CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri gözlemlemek ve değerlendirmek için NSG farelerini kullanan basit prosedürler gerektirmesidir. İlk olarak, çoğaltılması kolaydır ve GM-CSF nötralizasyonu yoluyla CART toksisitelerini önleme stratejilerini değerlendirmek ve CRS başlangıcı ile ilişkili olarak CART hücre genişlemesini görselleştirmek için optimize edilmiştir. Bu yeni PDX modelini kullanırken, ALL patlamalarının uygun şekilde aşılandığını doğrulamak ve CART uygulamasından hemen sonra CRS başlangıcının erken izlenmesi gibi kritik adımların doğru bir şekilde gerçekleştirilmesi önemlidir. Sitokinlerin değerlendirilmesi ve kilo izleme, CART ile ilişkili toksisiteleri belirlemek için çok önemlidir ve MRG, NI'nin başlangıcını tanımlar. Bu modelin dezavantajları aşağıdaki gibidir: 1) PDX ALL hücrelerinin aşılanması ve yüksek bir tümör yüküne ulaşması daha uzun sürdüğünden, tümör hücresi inokülasyonundan CART19 hücre tedavisine kadar yaklaşık 2-3 ay gerekir; 2) birincil PDX modeli olarak, aşılama süresi ve CART hücre tedavisine yanıt açısından hastadan hastaya önemli değişkenlik vardır; 3) tümör yükü biyolüminesans görüntüleme ile değerlendirilemez ve sık periferik kan değerlendirmesi gerektirir; ve 4) doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin eksikliği, bu modelin bağışıklık hücreleri veya tümör mikroçevresi ile CART etkileşimlerini inceleme yeteneğini sınırlar.

Evlat edinen hücrelerin daha karmaşık fare modellerinde test edilmesine olan ilgi, basit immün yetmezliği olan fare modellerinin ideal klinik öncesi modeller olmadığı ortaya çıktıkça son on yılda artmıştır. CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek için burada açıklanan PDX fare modeli, klinikte görüldüğü gibi CART hücre infüzyonundan sonra CRS ve NI'nin zaman çizelgesini, semptomlarını ve belirteçlerini taklit ettiği için CART hücre tedavisi alanında umut verici bir klinik öncesi modeli temsil eder. Genel olarak, burada açıklanan metodoloji, CART19 hücresi ile ilişkili toksisitelerin yanı sıra etkinliği değerlendirmek için sağlam bir platform sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.S.K., OCAR immünoterapisi alanında Novartis'e (Mayo Clinic, Pennsylvania Üniversitesi ve Novartis arasındaki bir anlaşma yoluyla) ve Mettaforge'a (Mayo Clinic aracılığıyla) lisanslanan patentlerin mucididir. R.L.S. ve S.S.K., CAR immünoterapisi alanında Humanigen'e lisanslı patentlerin mucitleridir. S.S.K. Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs ve Lentigen'den araştırma fonu alıyor.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R37CA266344, 1K99CA273304), Savunma Bakanlığı (CA201127), Mayo Clinic K2R boru hattı (SSK), Mayo Clinic Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi (SSK) ve Predolin Vakfı (RLS) aracılığıyla desteklenmiştir. Ayrıca, Mayo Clinic NMR Çekirdek Tesis personeline teşekkür ederiz. Şekil 1 BioRender.com'de oluşturuldu

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Cancer Research. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

Kanser Araştırmaları Sayı 192 CART hücresi CART hücresi ile ilişkili toksisiteler hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modeli kanser tedavisi in vivo preklinik model

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manriquez Roman, C., Sakemura, R.… More

Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter