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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

एक तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का उपयोग करके चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल-संबद्ध विषाक्तता का आकलन

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64535
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1,2, 1,2, 6, 6, 1,2, 1,2, 6, 1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

ERRATUM NOTICE

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें एक तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल का उपयोग सीडी 19-लक्षित चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन और निगरानी करने के लिए एक रणनीति के रूप में किया जाता है।

Abstract

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (सीएआरटी) सेल थेरेपी कई प्रकार की सीडी 19 + विकृतियों के उपचार के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरी है, जिसके कारण हाल ही में कई सीडी 19-लक्षित कार्ट (सीएआरटी 19) सेल थेरेपी के एफडीए अनुमोदन हुए हैं। हालांकि, कार्ट सेल थेरेपी विषाक्तता के एक अद्वितीय सेट से जुड़ी है जो अपनी रुग्णता और मृत्यु दर को वहन करती है। इसमें साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम (सीआरएस) और न्यूरोइन्फ्लेमेशन (एनआई) शामिल हैं। सीएआरटी प्रभावकारिता और कार्ट विषाक्तता दोनों का आकलन करने के लिए कार्ट प्रौद्योगिकी के अनुसंधान और विकास में प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल का उपयोग महत्वपूर्ण रहा है। इस दत्तक सेलुलर इम्यूनोथेरेपी का परीक्षण करने के लिए उपलब्ध प्रीक्लिनिकल मॉडल में सिंजेनिक, जेनोग्राफ्ट, ट्रांसजेनिक और मानवकृत माउस मॉडल शामिल हैं। कोई भी मॉडल नहीं है जो मानव प्रतिरक्षा प्रणाली को मूल रूप से प्रतिबिंबित करता है, और प्रत्येक मॉडल में ताकत और कमजोरियां हैं। इस विधि पत्र का उद्देश्य सीएआरटी 19 से जुड़े विषाक्तताओं, सीआरएस और एनआई का आकलन करने की रणनीति के रूप में तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया वाले रोगियों से ल्यूकेमिक विस्फोटों का उपयोग करके रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल का वर्णन करना है। इस मॉडल को कार्ट 19 से जुड़े विषाक्त पदार्थों के साथ-साथ चिकित्सीय प्रभावकारिता को पुन: उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है जैसा कि क्लिनिक में देखा गया है।

Introduction

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (सीएआरटी) सेल थेरेपी ने कैंसर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में क्रांति ला दी है। दुर्दम्य तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (एएलएल), बड़े बी सेल लिम्फोमा, मेंटल सेल लिम्फोमा, कूपिक लिंफोमा और मल्टीपल मायलोमा 1,2,3,4,5,6,7 के इलाज में सफल साबित हुआ है, जिससे हाल ही में एफडीए अनुमोदन प्राप्त हुआ है। नैदानिक परीक्षणों में प्रारंभिक सफलता के बावजूद, कार्ट सेल थेरेपी के साथ उपचार के परिणामस्वरूप विषाक्तता होती है जो अक्सर गंभीर और कभी-कभी घातक होती है। कार्ट सेल थेरेपी के बाद सबसे आम विषाक्तता में सीआरएस और एनआई का विकास शामिल है, जिसे प्रतिरक्षा प्रभावक सेल से जुड़े न्यूरोटॉक्सिसिटी सिंड्रोम (आईसीएएनएस) 8,9 के रूप में भी जाना जाता है। सीआरएस विवो में सीएआरटी कोशिकाओं के अतिसक्रियण और बड़े पैमाने पर विस्तार के कारण होता है, जिससे इंटरफेरॉन-γ, ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α, ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ), और इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6) सहित कई भड़काऊ साइटोकिन्स का स्राव होता है। इसके परिणामस्वरूप हाइपोटेंशन, उच्च बुखार, केशिका रिसाव सिंड्रोम, श्वसन विफलता, बहु-अंग विफलता, और कुछ मामलों में, मृत्यु10,11 होती है। सीआरएस कार्ट 19 सेल थेरेपी 11,12,13 के बाद 50-100% मामलों में विकसित होता है। ICANS कार्ट सेल थेरेपी से जुड़ी एक और अनूठी प्रतिकूल घटना है और इसे सामान्यीकृत सेरेब्रल एडिमा, भ्रम, भ्रम, अफसिया, मोटर कमजोरी और कभी-कभी, दौरे 9,14 की विशेषता है। ICANS का कोई भी ग्रेड 70% रोगियों में होता है, और ग्रेड 3-4 20-30% रोगियों में 5,10,15,16 में रिपोर्ट किए जाते हैं। कुल मिलाकर, सीआरएस और आईसीएएनएस आम हैं और घातक हो सकते हैं।

कार्ट सेल थेरेपी के बाद ICANS का प्रबंधन चुनौतीपूर्ण है। ICANS वाले अधिकांश रोगी भी सीआरएस17 का अनुभव करते हैं, जिसे अक्सर IL-6 रिसेप्टर विरोधी टोसिलिज़ुमाब या स्टेरॉयड18 के साथ इलाज किया जा सकता है। एक पिछली रिपोर्ट से पता चला है कि टोसिलिज़ुमाब के साथ शुरुआती हस्तक्षेप ने गंभीर सीआरएस की दर को कम कर दिया लेकिन आईसीएएनएस19 की घटनाओं या गंभीरता को प्रभावित नहीं किया। वर्तमान में, ICANSs के लिए कोई प्रभावी उपचार या रोगनिरोधी एजेंट नहीं है, और निवारक रणनीतियोंकी जांच करना महत्वपूर्ण है।

माइलॉयड कोशिकाओं और संबंधित साइटोकिन्स / केमोकाइन ्स को सीआरएस और आईसीएएनएस21 के विकास के मुख्य चालक माना जाता है। जबकि सीआरएस सीधे साइटोकिन्स और टी सेल विस्तार की चरम ऊंचाई से संबंधित है, आईसीएएनएस का पैथोफिज़ियोलॉजी काफी हदतक अज्ञात है। इसलिए, एक माउस मॉडल स्थापित करना अनिवार्य है जो तंत्र का अध्ययन करने और निवारक रणनीतियों को विकसित करने के लिए कार्ट सेल थेरेपी के बाद इन विषाक्तताओं को पुन: उत्पन्न करता है।

वर्तमान में सीएआरटी कोशिकाओं की प्रभावकारिता का अध्ययन, अनुकूलन और सत्यापन करने के साथ-साथ उनके संबंधित विषाक्तताओं की निगरानी के लिए कई प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल हैं। इनमें प्राइमेट मॉडल के अलावा सिंजेनिक, जेनोग्राफ्ट, इम्यूनोकॉम्पिटेंट ट्रांसजेनिक, मानवकृत ट्रांसजेनिक और रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट चूहे शामिल हैं। हालांकि, इनमें से प्रत्येक मॉडल में कमियां हैं, और कुछ सीएआरटी कोशिकाओं24,25 की वास्तविक प्रभावकारिता या सुरक्षा चिंताओं को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इसलिए, अध्ययन के इच्छित लक्ष्यों के लिए सबसे अच्छा मॉडल ध्यान से चुनना अनिवार्य है।

यह लेख उस पद्धति का वर्णन करना चाहता है जिसका उपयोग सीएआरटी सेल से जुड़े विषाक्तताओं, सीआरएस और एनआई का आकलन करने के लिए किया जाता है, जो विवो मॉडल (चित्रा 1) में सभी रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) का उपयोग करता है। विशेष रूप से, यहां वर्णित विधियों में, लेखकों की प्रयोगशाला में उत्पन्न सीएआरटी 19 कोशिकाओं का उपयोग पहले वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके किया जाता है। संक्षेप में, मानव टी कोशिकाओं को घनत्व ढाल तकनीक के माध्यम से स्वस्थ दाता परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से अलग किया जाता है, जो दिन 0 पर सीडी 3 / सीडी 28 मोतियों के साथ उत्तेजित होता है, और पहले दिन सीडी 19-लक्षित एकल श्रृंखला चर टुकड़े से बने सीएआर के साथ लेंटिवायरल रूप से ट्रांसड्यूस किया जाता है। इन कार्ट कोशिकाओं को तब विस्तारित किया जाता है, 6 वें दिन डी-बीड किया जाता है, और 8 वें दिन 26,27,28,29,30 पर क्रायोसंरक्षित किया जाता है। जैसा कि पहले उल्लिखित है, चूहों को लिम्फोडेसिंग उपचार के अधीन किया जाता है, इसके बाद रोगी-व्युत्पन्न ल्यूकेमिक ब्लास्ट (एएलएल)28 का प्रशासन होता है। सबसे पहले, ट्यूमर एन्ग्राफमेंट को सबमैंडिबुलर रक्त संग्रह के माध्यम से सत्यापित किया जाता है। एक उपयुक्त ट्यूमर बोझ की स्थापना के बाद, सीएआरटी 19 कोशिकाओं को चूहों को प्रशासित किया जाता है। फिर, कल्याण का आकलन करने के लिए चूहों को दैनिक रूप से तौला जाता है। टी सेल विस्तार और साइटोकिन / केमोकाइन उत्पादन का आकलन करने के लिए पूंछ के रक्तस्राव के साथ एनआई का आकलन करने के लिए छोटे पशु चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का प्रदर्शन किया जाता है। नीचे वर्णित तकनीकों को पीडीएक्स मॉडल में कार्ट सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल मेयो क्लिनिक के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी), संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी A00001767), और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी, बायोएस00000006.04) के दिशानिर्देशों का पालन करता है।

नोट: चूहों के साथ काम करने के लिए उपयोग की जाने वाली सभी सामग्री बाँझ होनी चाहिए।

1. एनएसजी चूहों को बुसल्फान का इंजेक्शन

  1. नर, 8-12 सप्ताह के, इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड, एनओडी-एससीआईडी आईएल 2 आर ओनल (एनएसजी) चूहों को प्राप्त करें, और इंजेक्शन से पहले उनका वजन करें।
    नोट: सांख्यिकीय महत्व के लिए, प्रति समूह कम से कम पांच चूहों का उपयोग करने और मादा चूहों के साथ कम से कम एक बार इस प्रयोग को दोहराने की सिफारिश की जाती है।
  2. इंट्रापरिटोनियल (यानी) इंजेक्शन के लिए बुसल्फान तैयार करें। 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके, धीरे-धीरे और सावधानी से सिरिंज को ठीक 30 मिलीग्राम / किग्रा बुसल्फान से भरें, इसके बाद चूहों को इंजेक्शन दें, और उन्हें पिंजरे में वापस रखें।

2. एनएसजी चूहों को सभी रोगी-व्युत्पन्न विस्फोटों (सीडी 19 +) का इंजेक्शन।

नोट: यह प्रोटोकॉल मेयो क्लिनिक की संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी, बायोएस00000006.04) के दिशानिर्देशों का पालन करता है।

  1. रिलैप्स और दुर्दम्य सभी वाले रोगियों के परिधीय रक्त से प्राथमिक ल्यूकेमिक विस्फोट एकत्र करें।
  2. अंतःशिरा (यानी) इंजेक्शन के लिए लक्ष्य कोशिकाओं को तैयार करें।
    1. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सीडी 19 + लक्षित कोशिकाओं की गणना करें, और कोशिकाओं की अंतिम मात्रा और एकाग्रता रिकॉर्ड करें।
      नोट: सेल व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं की गिनती करते समय ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें।
    3. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में सेल गोली को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 50 ×10 6 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पुन: निलंबित करें, और बर्फ पर रखें।
    4. फिंगर-भंवर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब है जिसमें लक्ष्य कोशिकाएं होती हैं जब तक कि कोशिकाएं पूरी तरह से समरूप न हो जाएं।
    5. 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके, धीरे-धीरे और सावधानी से तैयार लक्ष्य कोशिकाओं के ठीक 100 μL के साथ सिरिंज भरें, और बुलबुले को हटाने के लिए सिरिंज को फ्लिक करें।
      नोट: 100 μL की मात्रा प्रत्येक माउस को 5 × 106 कोशिकाओं का प्रशासन करेगी।
    6. चूहों को 5-10 मिनट के लिए गर्म रोशनी में रखें। एक बार जब पूंछ की नस सिकुड़ जाती है और नग्न आंखों के लिए अधिक दिखाई देती है, तो चूहों को एक उचित कारावास / निरोधक कक्ष में रखें।
    7. अल्कोहल स्वैब से माउस की पूंछ पोंछें। लक्ष्य कोशिकाओं को सीधे पूंछ की नस (यानी) में इंजेक्ट करें, और माउस को पिंजरे में वापस रखें। लक्षित कोशिकाओं के टीकाकरण के बाद, चूहों की दैनिक निगरानी करें या स्थानीय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुशंसित हों।

3. ट्यूमर एनग्राफमेंट मूल्यांकन

  1. लक्ष्य सेल इंजेक्शन के 6 सप्ताह बाद शुरू करते हुए, परिधीय रक्त में सीडी 19 + कोशिकाओं की अभिव्यक्ति को मापने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके ट्यूमर एन्ग्राफमेंट का आकलन करें।
  2. सीडी 19 + विस्तार का आकलन करने के लिए परिधीय रक्त परख।
    1. कार्ट 19 सेल इंजेक्शन के 6-8 सप्ताह बाद चूहों से रक्त वापस लें।
      नोट: रक्त निकालने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, सबमैंडिबुलर रक्त संग्रह पसंद का पसंदीदा तरीका है।
    2. 5% आइसोफ्लुरेन के साथ एक प्रेरण कक्ष में आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। एक बार संज्ञाहरण प्राप्त हो जाने के बाद, नाक शंकु के माध्यम से 1-3% आइसोफ्लुरेन को बनाए रखें।
      नोट: आंखों की सूखापन को रोकने के लिए नेत्र मरहम लगाने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।
    3. माउस को कक्ष से हटा दें, और गर्दन पर ढीली त्वचा को पकड़कर माउस को गैर-प्रमुख हाथ से पकड़ें। जबड़े के थोड़ा पीछे लैंसेट से नस को पंचर करें।
      नोट: नस में प्रवेश करने के लिए केवल सुई की नोक (1-2 मिमी) की आवश्यकता होती है।
    4. जैसे ही रक्त टपक रहा हो, हेपरिन-लेपित ट्यूब में कम से कम 50 μL एकत्र करें, और ट्यूब को कई बार ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से मिलाएं। 30 μL रक्त को 5 मिलीलीटर गोल नीचे पॉलीस्टाइनिन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: शेष रक्त के लिए, ट्यूब को 17,000 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं। सीरम (सतह पर तैरनेवाला परत) को एक साफ और लेबल 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे -80 डिग्री सेल्सियस (साइटोकिन परख में उपयोग के लिए) पर स्टोर करें।
    5. रक्त युक्त 5 एमएल गोल तल ट्यूब में 2 एमएल लाइसिस बफर (10 x अमोनियम क्लोराइड-आधारित लाइसिंग बफर को न्यूक्लियस-मुक्त पानी का उपयोग करके 1x तक पतला किया जाता है) जोड़ें। ट्यूब को भंवर करके बहुत अच्छी तरह मिलाएं। लाल रक्त कोशिकाओं के उचित लाइसिस को सुनिश्चित करने के लिए 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    6. 2 एमएल फ्लो बफर (पीबीएस, 0.2 ग्राम / एल पोटेशियम क्लोराइड, 0.2 ग्राम / एल पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबेसिक, 8 ग्राम / एल सोडियम क्लोराइड, और 1.15 ग्राम / एल सोडियम फॉस्फेट डिबासिक जिसमें 2% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% सोडियम एज़ाइड होता है) जोड़ें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला यंत्र डालें, और 2 मिलीलीटर प्रवाह बफर जोड़ें। इस धोने के चरण 2 x को दोहराएं।
    8. ट्यूब की सामग्री को ध्यान से हटा दें। ट्यूब में शेष गोली के साथ तरल पदार्थ की थोड़ी मात्रा का निरीक्षण करें। प्रवाह बफर के 100 μL जोड़ें, और बहुत अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें।
    9. 5 एमएल प्रवाह ट्यूब में शेष सभी तरल को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना ठीक से लेबल किया गया है। संबंधित कुओं में 100 μL प्रवाह बफर जोड़ें और 96-वेल प्लेट को 650 × g पर 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीडी 19+ लक्ष्य कोशिकाओं के विस्तार का आकलन करें (चित्रा 2)।
    1. मृत दाग के 0.3 μL, एंटी-ह्यूमन CD19 एंटीबॉडी के 0.13 μg (2.5 μL), एंटी-ह्यूमन CD45 एंटीबॉडी के 0.06 μg (2.5 μL), एंटी-माउस CD45 के 5 μg (2.5 μL) और प्रति नमूने कुल 50 μL के लिए 42.2 μL प्रवाह बफर युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
    2. 150 μL प्रवाह बफर के साथ धोएं और इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 650 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, और 195 μL प्रवाह बफर और 5 μL काउंटिंग बीड्स में गोली को फिर से निलंबित करें।
    3. सीडी 19 + सेल अभिव्यक्ति के स्तर को निर्धारित करने के लिए एक प्रवाह साइटोमीटर पर प्राप्त करें। गेटिंग और विश्लेषण उद्देश्यों के लिए, पहले फॉरवर्ड बनाम साइड स्कैटर विशेषताओं के आधार पर रुचि की आबादी (सीडी 19 +) को गेट करें, इसके बाद एकल गेटिंग आबादी और फिर जीवित कोशिकाएं। एक बार जब जीवित कोशिकाओं को गेट किया जाता है, तो मानव सीडी 45 बनाम माउस सीडी 45 आबादी का आकलन करें, और मानव आबादी से, सीडी 19 + लक्ष्य आबादी को गेट करें।
  4. 70 μL में मौजूद मात्रा निर्धारित करने के लिए मात्रा निर्धारित करें, और फिर समीकरण (1) का उपयोग करके कोशिकाओं / μL में व्यक्त करें:
    निरपेक्ष CD19+ सेल गिनती = ([CD19+ कोशिकाएं/गिनती मोती] × 5 μL/70 के भीतर मोतियों की गिनती की संख्या।
    नोट: सीडी 19 + सेल विस्तार का आकलन करने के लिए हर 5 दिनों में परिधीय रक्त परख दोहराएं। स्थानीय पशु नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार हर 2 सप्ताह में संचयी रूप से 200 μL से अधिक रक्त एकत्र न करें। एक बार जब चूहे ≥10 कोशिकाओं / μL के रोग बोझ तक पहुंच जाते हैं, तो CART19 सेल या नियंत्रण समूहों (अनुभाग 4) के लिए यादृच्छिक करें।

4. विवो में कार्ट 19 कोशिकाओं का प्रशासन

  1. कार्ट 19 कोशिकाओं की तैयारी (~ दिन 80):
    नोट: CART19 कोशिकाओं की पीढ़ी पहले 27,30,31 प्रकाशित की गई है। इस प्रक्रिया को सड़न रोकनेवाला तकनीक और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट स्तर 2 + के अंदर किया जाना चाहिए।
    1. एक पानी स्नान कंटेनर (37 डिग्री सेल्सियस) में कार्ट 19 कोशिकाओं को पिघलाएं। फिर, डाइमिथाइल सल्फोक्साइड को हटाने के लिए गर्म टी सेल माध्यम (टीसीएम) में कोशिकाओं को धो लें।
      नोट: टीसीएम 10% मानव एबी सीरम (वी / वी), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइन (वी / वी), और सीरम मुक्त हेमटोपोइएटिक सेल माध्यम27,30 से बना है।
    2. कार्ट 19 कोशिकाओं को 300 × ग्राम पर 8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें, और गर्म टीसीएम में 2 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता में फिर से निलंबित करें। कार्ट कोशिकाओं को रात भर एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में आराम करने की अनुमति दें, लेकिन 16 घंटे से अधिक नहीं।
  2. इंजेक्शन के माध्यम से कार्ट 19 कोशिकाओं का प्रशासन (दिन ~ 80)
    1. कार्ट 19 कोशिकाओं की गणना करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर घूमें।
    2. 10 एमएल पीबीएस के साथ कार्ट 19 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर स्पिन करें।
    3. पीबीएस के साथ 40 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए सीएआरटी 19 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, कोशिकाओं को बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और उन्हें बर्फ पर रखें।
    4. 100 μL पुन: निलंबित कोशिकाओं को इंजेक्ट करके CART19 सेल टेल वेन इंजेक्शन (जैसा कि ऊपर बताया गया है) करें।
      नोट: 100 μL की मात्रा प्रत्येक माउस × 410 6 कोशिकाओं का प्रशासन करेगी। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अनुपचारित चूहों के एक समूह को शामिल करें।

5. कार्ट 19 सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन

  1. कार्ट 19 सेल प्रशासन के बाद, चूहों की भलाई में किसी भी बदलाव का आकलन करने के लिए दिन में 2 x की निगरानी करें, जैसे कि मोटर कमजोरी, कूबड़ शरीर और शरीर के वजन का नुकसान।
    नोट: ये सभी शारीरिक परिवर्तन इस मॉडल28 में सीआरएस लक्षणों के साथ सहसंबंधित हैं।
  2. एक बार जब चूहे मोटर कमजोरी और वजन में कमी (बेसलाइन से 10-20% की कमी) विकसित करना शुरू कर देते हैं, तो ट्यूमर के बोझ का विश्लेषण करने के लिए परिधीय रक्त एकत्र करें और धारा 3 (चित्रा 3) में वर्णित पद्धति के अनुसार साइटोकिन्स के लिए सीरम अलगाव का संचालन करें।
  3. सीरम माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और मल्टीप्लेक्स परख (चित्रा 4) का उपयोग करके केमोकाइन और साइटोकिन्स का विश्लेषण करने के लिए सेरा का उपयोग करें।
    नोट: यदि चूहे हिंद अंग पक्षाघात के लक्षण प्रदर्शित करते हैं, मरणासन्न या सुस्त दिखाई देते हैं, और वजन में कमी उनके शरीर के वजन का > 20% उस बिंदु तक होती है जो भोजन और / या पानी तक पहुंचने की उनकी क्षमता को सीमित करती है, तो उन्हें इच्छामृत्यु के अधीन किया जाएगा।

6. एमआरआई इमेजिंग

नोट: एक ऊर्ध्वाधर बोर चुंबक के साथ एक प्रीक्लिनिकल (छोटे जानवरों के लिए) एमआरआई स्कैनर का उपयोग विवो चुंबकीय अनुनाद और छवि अधिग्रहण32,33 में किया गया था।

  1. 120 μL गैडोलीनियम + 880 μL नमकीन घोल मिलाएं, और 1 एमएल इंसुलिन सिरिंज में लोड करें। प्रत्येक माउस (i.p.) में 100 μL इंजेक्ट करें।
    नोट: प्रयोग की शुरुआत से 15-20 मिनट पहले गैडोलीनियम इंजेक्शन दिया जाना चाहिए।
  2. 10-15 मिनट के लिए एक प्रेरण कक्ष में आइसोफ्लुरेन (2-3%) का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: आंखों की सूखापन को रोकने के लिए नेत्र मरहम लगाने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
  3. माउस रीढ़ को कृंतक-संगत क्रैडल जांच पर रखें। फिर, काटने की पट्टी पर अपने दांतों को हुक करके माउस को स्थिति में रखने के लिए आगे बढ़ें।
  4. माउस के सिर को 25 मिमी वॉल्यूम कॉइल में खींचें, और नाक शंकु को आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया सिस्टम से जोड़ कर समायोजित करें। स्कैन की अवधि के लिए स्थिति बनाए रखने के लिए बाइट बार के नॉब को कस लें।
    नोट: यदि कंट्रास्ट-एन्हांस्ड एमआरआई स्कैन का संचालन कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि उपकरण को बोर चुंबक में रखने से कम से कम 10 मिनट पहले गैडोलीनियम (इस मामले में) या कंट्रास्ट एजेंट को इंजेक्ट किया गया है। इमेजिंग के दौरान, चूहों को नाक शंकु के माध्यम से हवा में 2-3% आइसोफ्लुरेन की साँस लेने से एनेस्थेटाइज्ड किया जाएगा, और उनकी श्वसन दर की एक साथ निगरानी की जाएगी।
  5. श्वास मूल्यांकन के लिए, श्वास / श्वसन निगरानी उपकरण का उपयोग करें।
    नोट: संज्ञाहरण के विस्तारित जोखिम के कारण संभावित हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए शरीर के तापमान का आकलन करना महत्वपूर्ण है। शरीर के तापमान को नियंत्रित करने के लिए हीट पैड का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    1. श्वास मॉनिटर जांच को डायाफ्राम के करीब संलग्न करें, और इसे सर्जिकल टेप के साथ सुरक्षित करें। श्वसन दर को 20-60 सांस प्रति मिनट के बीच रखें ताकि माउस की स्थिति स्थिर हो।
      नोट: यह दर अधिक स्थिर एमआरआई छवियां प्रदान करती है और अधिग्रहित छवि में गति कलाकृतियों को रोकती है। यदि श्वसन दर 20-60 सांस प्रति मिनट सीमा से अधिक है, तो आइसोफ्लुरेन की एकाग्रता बढ़ाएं। यदि श्वसन दर प्रति मिनट 20 सांस से कम है, तो संज्ञाहरण बहुत गहरा है; इसलिए, एकाग्रता को कम करने की आवश्यकता है।
  6. ऊर्ध्वाधर-बोर छोटे-पशु एमआरआई सिस्टम के भीतर छोटे बोर में पशु जांच डालें। कुंडली के केंद्र में जानवर के सिर को समायोजित करें। लॉक के साथ उपकरण को सुरक्षित करें ताकि यह सीधा खड़ा हो सके, और उपकरण को कंप्यूटर से कनेक्ट कर सके।
  7. स्कैन की स्थिति और स्कैन के प्रकार सेट करने के लिए सॉफ़्टवेयर (जैसे, पैराविज़न) खोलें और उपयोग करें। सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए उन्हें सुसंगत रखते हुए इष्टतम अक्षीय और धनु स्थितियों का निर्धारण करें।
    नोट: वास्तविक पूर्ण लंबाई एमआरआई स्कैन से पहले एक संदर्भ के रूप में परीक्षण स्कैन के अधिग्रहण का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  8. एमआरआई डेटा संग्रह के साथ आगे बढ़ें (जैसा कि पहले वर्णित32,34,35,36)। नीचे उल्लिखित सुझाए गए सेटअप का उपयोग करके टी 1-भारित और टी 2-भारित एमआरआई चित्र दोनों प्राप्त करें।
    1. टी 1-भारित एमआरआई छवियों के लिए, 300 एमएस के पुनरावृत्ति समय (टीआर), 9.5 एमएस के इको टाइम (टीई), 4 सेमी x 2 सेमी x 2 सेमी के फील्ड ऑफ व्यू (एफओवी) और 192 x 96 x 96 के मैट्रिक्स के साथ टी 1-भारित मल्टीस्लाइस मल्टीइको (एमएसएमई) अनुक्रम का उपयोग करें।
    2. टी 2-भारित एमआरआई छवियों के लिए, 300 एमएस के टीआर के साथ एक मल्टीस्लाइस मल्टीइको (एमएसएमई) अनुक्रम का उपयोग करें, 9.5 एमएस का टीई, 4 सेमी x 2 सेमी x 2 सेमी का एफओवी, और 192 x 96 x 96 के मैट्रिक्स का उपयोग किया गया था।
  9. एक बार स्कैन पूरा हो जाने के बाद, बोर से जांच को हटा दें। काटने की पट्टी से दांत हटाकर धीरे से माउस निकालें। एक अलग पिंजरे में जानवर की निगरानी करें जब तक कि वह पूरी तरह से सचेत न हो जाए और पर्याप्त मोटर फ़ंक्शन हासिल न कर ले।
  10. सॉफ्टवेयर से डेटा के निष्कर्षण के बाद, हाइपरइंटेंसिटी क्षेत्रों के परिमाणीकरण और 3 डी वॉल्यूम रेंडरिंग (चित्रा 4) के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: यदि संभव हो, तो डेटा विश्लेषण के लिए दो अलग-अलग अंधे पर्यवेक्षकों को रखने के लिए दृढ़ता से प्रोत्साहित किया जाता है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एएलएल (चित्रा 1) के रोगियों के ट्यूमर कोशिकाओं से पीडीएक्स चूहों के मॉडल का उपयोग करके कार्ट सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन करना है। सबसे पहले, एनएसजी चूहों को इम्यूनोसप्रेशन और कार्ट सेल एनग्राफमेंट28 की सुविधा के लक्ष्य के साथ बुसल्फान (30 मिलीग्राम / किग्रा) के आईपी इंजेक्शन प्राप्त हुए। अगले दिन, उन्हें सभी रोगियों से प्राप्त ~ 5 × 106 पीबीएमसी (यानी) प्राप्त हुए। चूहों को पूंछ रक्तस्राव परख के माध्यम से ~ 13 सप्ताह के लिए एन्ग्राफमेंट के लिए निगरानी की गई थी। सीडी 19+ ट्यूमर कोशिकाओं की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री तैयारी के बाद लाल रक्त कोशिकाओं को एकत्र और लाइसिस किया गया (चित्रा 2)।

एक बार जब चूहे ≥10 ट्यूमर कोशिकाओं / μL तक पहुंच गए, तो उन्हें यादृच्छिक किया गया और 4 × 106 CART19 कोशिकाओं (यानी) को प्राप्त करने के लिए तैयार किया गया। कार्ट 19 से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन करने के लिए, चूहों को प्रति दिन एक बार तौला गया था (चित्रा 3 ए)। वजन घटाने को सीआरएस उपस्थिति के लक्षण के रूप में चुना गया था, क्योंकि यह पहले सीएआरटी सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों28,37 से संबंधित होने का पता चला है। परिधीय रक्त परीक्षण (सबमैंडिबुलर रक्त संग्रह के माध्यम से) मानव सीडी 19 + ट्यूमर कोशिकाओं और मानव सीडी 3 + टी कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा ट्यूमर के बोझ और कार्ट सेल विस्तार का आकलन करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, सीरम एकत्र किया गया था, और भड़काऊ साइटोकिन्स का मूल्यांकन किया गया था। सीएआरटी 19 सेल इन्फ्यूजन से एक दिन पहले और कार्ट 19 सेल इन्फ्यूजन के 5 और 10 दिनों के बाद परीक्षण किया गया था, क्योंकि ये टाइमपॉइंट विशेष रूप से सीआरएस की शुरुआत और लक्षणों के विकास के लिए प्रासंगिक हैं।

यहां, विशेष रूप से, कार्ट 19 सेल प्रशासन से पहले और बाद में एक मल्टीप्लेक्स परख का प्रदर्शन किया गया था, जहां सबसे अधिक प्रतिनिधि साइटोकिन्स और केमोकाइन जीएम-सीएसएफ, आईएल -18, एमआईपी -1 ए और आईपी -10 (चित्रा 3 बी) थे। हालांकि, सीरम में इन प्रोटीनों की सांद्रता का आकलन करने के लिए अन्य परख की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, चूहों को केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में संवहनी पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए एमआरआई स्कैनिंग के अधीन किया गया था। चूहों को मस्तिष्क की सूजन और रक्त-मस्तिष्क बाधा व्यवधान को मापने के लिए कंट्रास्ट अभिकर्मक गैडोलिनियम (यानी) के साथ इंजेक्शन दिया गयाथा। फिर, उन्हें आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज्ड किया गया, और कंट्रास्ट-एन्हांस्ड टी 1-भारित और टी 2-भारित छवियां ली गईं (चित्रा 4)। टी 2 छवियों (चित्रा 4, बाएं) के साथ, उज्ज्वल खंड (सफेद) एडिमा या तरल पदार्थ की उपस्थिति को इंगित करता है, जो ज्यादातर मस्तिष्क ट्यूमर और सूजन में देखा जाता है। टी 1 छवियों (चित्रा 4, मध्य) के साथ, उज्ज्वल खंड उन क्षेत्रों को इंगित करते हैं जहां रक्त रिसाव या रक्त-मस्तिष्क बाधा व्यवधान होता है। अंत में, सॉफ्टवेयर की मदद से, 3 डी पुनर्निर्माण छवियों (चित्रा 4, दाएं) को संवहनी पारगम्यता के अनुरूप हाइपरइंटेंसिटी संकेतों के आधार पर गैडोलीनियम-एन्हांस्ड टी 1 छवियों का उपयोग करके इकट्ठा किया गया था,जो मस्तिष्क में गैडोलिनियम रिसाव की मात्रा को प्रस्तुत करता है।

Figure 1
चित्रा 1: कार्ट सेल से जुड़े विषाक्तताओं, साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम और न्यूरोइन्फ्लेमेशन का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल की प्रायोगिक योजना। एनएसजी चूहों को 30 मिलीग्राम / किग्रा बुसल्फान (आई.पी.) के साथ वातानुकूलित किया गया था और एएलएल के रोगियों के परिधीय रक्त से प्राप्त 3 × 10 6-5 × 106 विस्फोट (यानी) प्राप्त किए गए थे। इसके बाद, चूहों को सबमैंडिबुलर रक्त संग्रह के माध्यम से ट्यूमर एन्ग्राफमेंट के लिए निगरानी की गई, इसके बाद सीडी 19+ विस्फोटों का आकलन करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री की गई। जब परिधीय रक्त सीडी 19 + कोशिकाएं ≥10 कोशिकाओं / μL थीं, तो चूहों को 2 × 10 6-5 × 106 कार्ट 19 कोशिकाएं मिलीं। चूहों को उनकी भलाई के उपाय के रूप में दैनिक वजन किया गया था। कार्ट 19 सेल इन्फ्यूजन के 10 दिनों के बाद, न्यूरोइन्फ्लेमेशन का पता लगाने के लिए माउस ब्रेन एमआरआई किया गया था। केमोकाइन उत्पादन और टी सेल विस्तार का आकलन करने के लिए पूंछ रक्तस्राव साप्ताहिक रूप से सीएआरटी 19 सेल इंजेक्शन के बाद किया गया था। संक्षेप: कार्ट = चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल; कार्ट 19 = सीडी 19-लक्षित कार्ट; ऑल = तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया; i.v. = अंतःशिरा; i.p. = इंट्रापरिटोनियल; पीबी = परिधीय रक्त; NSG = NOD-SCID IL2rγnull. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कार्ट-सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन करने के लिए एक ऑल पीडीएक्स मॉडल में ट्यूमर के बोझ के संकेतक के रूप में सीडी 19 + ट्यूमर कोशिकाओं का विश्लेषण। (ए) प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण रोगी-व्युत्पन्न ऑल ब्लास्ट के साथ इंजेक्ट किए गए माउस के परिधीय रक्त नमूने से ली गई सीडी 19 + सेल आबादी का विश्लेषण करने के लिए गेटिंग रणनीति को दर्शाता है। (बी) फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से प्राप्त कच्चे डेटा के आधार पर कार्ट 19 बनाम अनुपचारित चूहों के साथ इलाज किए गए चूहों के बीच सीडी 19 + सेल आबादी की मात्रा और तुलना। (एक तरफा एनोवा; एन = 3 चूहे प्रति समूह; त्रुटि सलाखों, एसईएम)। संक्षेप: एनएस = महत्वपूर्ण नहीं; ऑल = तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया; पीडीएक्स = रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट; कार्ट = चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल; कार्ट 19 = सीडी 19-लक्षित कार्ट; एसएससी-एच = साइड स्कैटर-पीक ऊंचाई; एफएससी-एच = आगे स्कैटर-पीक ऊंचाई; एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-ए = फॉरवर्ड स्कैटर-पीक क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एक ऑल पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करके कार्ट 19 से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन। (ए) कार्ट 19 कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए चूहों में प्रतिशत वजन में कमी का प्रतिनिधि ग्राफ या कार्ट के बाद पहले 6 दिनों के लिए अपरिवर्तित टी कोशिकाओं को नियंत्रित करना (दो-तरफा एनोवा, ***पी < 0.001, ***पी < 0.00001; त्रुटि पट्टियाँ, एसईएम)। (बी) सीएआरटी 19 सेल प्रशासन से पहले और बाद में एनएसजी चूहों के सीरम में साइटोकिन्स और केमोकाइन ्स की अभिव्यक्ति। एनएसजी चूहों को उनके सीरम को इकट्ठा करने और निम्नलिखित साइटोकिन्स और केमोकाइन्स की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए कार्ट 19 सेल प्रशासन (यानी) से पहले और बाद में सबमैंडिबुलर रक्तस्राव के अधीन किया गया था: जीएम-सीएसएफ, आईएल -18, एमआईपी -1ए, आईपी -10, आईएल -1 और आईएल -6 (दो-तरफा एनोवा, * पी < 0.05, **पी < 0.01, ***पी < 0.001, ***पी < 0.0001; एन = 3 चूहे; नौ तकनीकी प्रतिकृतियां; त्रुटि पट्टियाँ, एसईएम)। संक्षेप: एनएस = महत्वपूर्ण नहीं; ऑल = तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया; पीडीएक्स = रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट; कार्ट = चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल; कार्ट 19 = सीडी 19-लक्षित कार्ट; एनएसजी = NOD-SCID IL2rγnull; जीएम-सीएसएफ = ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक; आईएल -18 = इंटरल्यूकिन -18; एमआईपी -1 ए = मैक्रोफेज भड़काऊ प्रोटीन -1 अल्फा; आईपी -10 = इंटरफेरॉन गामा-प्रेरित प्रोटीन 10; आईएल -1 = इंटरल्यूकिन -1 आईएल -6 = इंटरल्यूकिन -6। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पीडीएक्स मॉडल में कार्ट 19 सेल उपचार के दौरान न्यूरोइन्फ्लेमेशन का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग। सभी रोगियों से प्राप्त ट्यूमर कोशिकाओं के साथ संलग्न एनएसजी चूहों को सीएआरटी 19 कोशिकाओं के साथ संक्रमित किया गया था, और सीएआरटी इन्फ्यूजन के बाद 10 दिनों के भीतर चूहों के न्यूरोलॉजिकल लक्षण प्रदर्शित करने के बाद मस्तिष्क को गैडोलीनियम-एन्हांस्ड एमआरआई के साथ चित्रित किया गया था। (बाएं) टी 2-भारित छवि कार्ट 19-उपचारित चूहों (लाल तीर) में एनआई के दौरान एडिमा और संभावित भड़काऊ घुसपैठ के सबूत का खुलासा करती है। (मध्य) टी 1-भारित एमआरआई का प्रतिनिधि अक्षीय खंड मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर विपरीत वृद्धि दिखाता है, जो सीएआरटी 19-उपचारित चूहों (लाल तीर) में संवहनी पारगम्यता में वृद्धि का संकेत देता है। (दाएं) विश्लेषण 12.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके टी 1-हाइपरइंटेंसिटी क्षेत्रों (लाल) के साथ कृंतक मस्तिष्क के त्रि-आयामी पुनर्निर्माण उत्पन्न किए गए थे। संक्षेप: एमआरआई = चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग; ऑल = तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया; पीडीएक्स = रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट; कार्ट = चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल; CART19 = CD19-लक्षित CART. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मानवीय चूहा
साइटोकिन/ मानव माइलॉयड साइटोकिन्स (आईएल -6, जीएम-सीएसएफ, आईएल -1, एमसीपी -1) मानव माइलॉयड साइटोकिन्स (आईएल -6, जीएम-सीएसएफ, आईएल -1, एमसीपी -1)
सीआरएस के लिए समय (दिन) 2-5 4-6
एनआई के लिए समय (दिन) 5-7 6-8
BBB की स्थिति BBB व्यवधान BBB व्यवधान
ऊतक निवासी मैक्रोफेज। माइक्रोग्लियल सक्रियण। माइक्रोग्लियल सक्रियण।
सीएनएस में कार्ट सेल मस्तिष्क घुसपैठ मस्तिष्क घुसपैठ

तालिका 1: ऑल पीडीएक्स मॉडल द्वारा नैदानिक रूप से देखे गए सीएआरटी सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का पुन: कैपिट्यूलेशन। संक्षेप: जीएम-सीएसएफ = ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक; आईएल = इंटरल्यूकिन; सीआरएस = साइटोकिन रिलीज सिंड्रोम; एनआई = न्यूरोइन्फ्लेमेशन; बीबीबी = रक्त-मस्तिष्क बाधा; सीएनएस = केंद्रीय तंत्रिका तंत्र; एमसीपी -1 = मोनोसाइट केमोअट्रैक्टेंट प्रोटीन 1।

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Discussion

इस रिपोर्ट में, ऑल पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करके कार्ट सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन किया गया है। अधिक विशेष रूप से, यह मॉडल दो जीवन-धमकाने वाले विषाक्तताओं, सीआरएस और एनआई की नकल करना चाहता है, जो रोगी अक्सर कार्ट कोशिकाओं के जलसेक के बाद अनुभव करते हैं। यह क्लिनिक में देखे गए कार्ट विषाक्तता के कई लक्षणों को पुन: प्रस्तुत करता है: वजन घटाने, मोटर डिसफंक्शन, न्यूरोइन्फ्लेमेशन, भड़काऊ साइटोकिन और केमोकाइन उत्पादन, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विभिन्न प्रभावकारक कोशिकाओं की घुसपैठ 8,20,28। पहले, इस पीडीएक्स मॉडल का उपयोग सीआरएस और एनआई (तालिका 1) के प्रारंभिक विकास की नकल करने और विषाक्तता की रोकथाम और उपचार के लिए विभिन्न रणनीतियों का आकलन करने के लिए किया गया है। इस पीडीएक्स मॉडल में एक अध्ययन ने जीएम-सीएसएफ से कम सीएआरटी 19 कोशिकाओं का उपयोग किया। अधिक विशेष रूप से, इन परिणामों से पता चला कि जीएम-सीएसएफ की कमी के परिणामस्वरूप सीआरएस-लिंक्ड साइटोकिन्स और केमोकाइन ्स का स्राव कम हो गया, जो इस ऑल पीडीएक्स माउस मॉडल29 का उपयोग करके स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया था। इस पीडीएक्स मॉडल का उपयोग इमेजिंग प्लेटफॉर्म26 के रूप में सोडियम आयोडाइड सिम्पोर्टर (एनआईएस) का उपयोग करके कार्ट 19 सेल इन्फ्यूजन के बाद सीआरएस विकास के साथ सहसंबंध विवो विस्तार में कार्ट सेल का आकलन करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है। इसलिए, यह प्रस्तावित मॉडल एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है जिसका उपयोग कार्ट कोशिकाओं से उत्पन्न होने वाली संभावित विषाक्तता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि विवो में कार्ट कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए कई अन्य मॉडलों का उपयोग किया गया है। इनमें क्सीनोजेनिक मॉडल24 के अलावा सिंजेनिक, ट्रांसजेनिक और मानवकृत माउस मॉडल शामिल हैं। सिंजेनिक माउस मॉडल, जिसे इम्यूनोकॉम्पिटेंट एलोग्राफ्ट माउस मॉडल भी कहा जाता है, सीएआरटी कोशिकाओं, ट्यूमर और लक्षित एंटीजन का उपयोग करता है जो मूल में मुराइन हैं। यह फायदेमंद है क्योंकि यह पूरी तरह कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली में सीएआरटी कोशिकाओं के अध्ययन की अनुमति देता है और ऑन-टारगेट, ऑफ-ट्यूमर विषाक्तता को भी प्रकट कर सकता है। इस मॉडल का नुकसान यह है कि माउस जीव विज्ञान और प्रतिरक्षा मनुष्यों से अलग हैं, और इसलिए, यह ट्रांसलेशनल अध्ययनों के लिए एक प्रासंगिक मॉडल नहीं है जहां लक्ष्य नैदानिक परीक्षणों24,39 के लिए आगे बढ़ना है।

इम्यूनोसक्षम ट्रांसजेनिक माउस मॉडल मानव ऊतकों में पाए जाने वाले पैटर्न की नकल करते हुए स्वस्थ ऊतक और ट्यूमर दोनों पर मानव ट्यूमर से जुड़े एंटीजन (टीएए) ट्रांसजीन को व्यक्त करते हैं। इन चूहों का उपयोग कार्ट अध्ययनों में ऑन-टारगेट ऑफ-ट्यूमर प्रभाव40,41 का खुलासा करके कार्ट कोशिकाओं की सुरक्षा का बेहतर मूल्यांकन करने के लिए भी किया गया है। सीडी 34+ मानव हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित मानवकृत चूहे मानव हेमटोपोइएटिक प्रणाली पर सीएआरटी प्रभावकारिता और विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद मॉडल हो सकते हैं, क्योंकि पुनर्गठित प्रतिरक्षा प्रणाली कार्ट निषेध की नकल कर सकती है और एक साइटोकिन तूफान को प्रेरित कर सकती है जो क्लिनिक42,43,44 में देखे गए सीआरएस को पुन: उत्पन्न करती है।. यद्यपि ये मॉडल कार्ट प्रभावकारिता के संबंध में विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अध्ययन की अनुमति देते हैं, मानवीकृत प्रणाली अभी भी आदिम है और आगे अनुकूलन की आवश्यकता है। इसके अलावा, ऑफ-टारगेट प्रभावों का अध्ययन करने में उनका उपयोग सीमित है क्योंकि स्वस्थ ऊतक पर अधिकांश मेजबान एंटीजन मूल में मुराइन हैं। इसके अलावा, सीडी 34 + मानवकृत माउस मॉडल तकनीकी रूप से45 विकसित करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में मानव जेनोग्राफ्ट मॉडल आमतौर पर नैदानिक परीक्षणों में अनुवाद करने से पहले मानव कार्ट सेल प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं, और जैसा कि इस पेपर में दिखाया गया है, उनका उपयोग कार्ट सेल गतिविधि से जुड़े विषाक्त पदार्थों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, प्रतिरक्षा प्रणाली और प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे टी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं की कमी ऑफ-ट्यूमर ऑन-टारगेट विषाक्तता, जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ कार्ट कोशिकाओं की बातचीत और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट द्वारा कार्ट सेल अवरोध का आकलन करने के लिए उनके आवेदन को सीमित करती है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि इसमें सीएआरटी सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का निरीक्षण और आकलन करने के लिए एनएसजी चूहों का उपयोग करके सरल प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, पुन: उत्पन्न करना आसान है, और इसे जीएम-सीएसएफ न्यूट्रलाइजेशन के माध्यम से सीएआरटी विषाक्तता को रोकने के लिए रणनीतियों का आकलन करने और सीआरएस शुरुआत के साथ सहसंबंध में कार्ट सेल विस्तार की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया गया है। इस नए पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करते समय, महत्वपूर्ण चरणों को सही ढंग से निष्पादित करना महत्वपूर्ण है, जैसे कि सभी विस्फोटों के उचित सत्यापन की पुष्टि करना और कार्ट प्रशासन के ठीक बाद सीआरएस की शुरुआत की प्रारंभिक निगरानी। साइटोकिन्स और वजन की निगरानी का आकलन सीएआरटी से जुड़े विषाक्त पदार्थों को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और एमआरआई एनआई की शुरुआत को परिभाषित करता है। इस मॉडल के डाउनसाइड्स इस प्रकार हैं: 1) चूंकि पीडीएक्स सभी कोशिकाओं को उच्च ट्यूमर के बोझ तक पहुंचने में अधिक समय लगता है, इसलिए ट्यूमर सेल टीकाकरण से कार्ट 19 सेल उपचार तक लगभग 2-3 महीने की आवश्यकता होती है; 2) एक प्राथमिक पीडीएक्स मॉडल के रूप में, कार्ट सेल थेरेपी के लिए एनग्राफमेंट और प्रतिक्रिया के समय के संबंध में रोगी से रोगी परिवर्तनशीलता महत्वपूर्ण है; 3) ट्यूमर लोड का आकलन बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के साथ नहीं किया जा सकता है और लगातार परिधीय रक्त मूल्यांकन की आवश्यकता होती है; और 4) जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कमी प्रतिरक्षा कोशिकाओं या ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ सीएआरटी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए इस मॉडल की क्षमता को सीमित करती है।

अधिक जटिल माउस मॉडल के भीतर दत्तक कोशिकाओं के परीक्षण में रुचि पिछले दशक में बढ़ी है क्योंकि यह स्पष्ट हो गया है कि सरल इम्यूनोडेफिशिएंसी माउस मॉडल आदर्श प्रीक्लिनिकल मॉडल नहीं हैं। कार्ट सेल से जुड़े विषाक्त पदार्थों का आकलन करने के लिए यहां वर्णित पीडीएक्स माउस मॉडल कार्ट सेल थेरेपी के क्षेत्र में एक आशाजनक प्रीक्लिनिकल मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि यह क्लिनिक में देखे गए कार्ट सेल इन्फ्यूजन के बाद सीआरएस और एनआई की समयरेखा, लक्षण और मार्करों की नकल करता है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित पद्धति सीएआरटी 19 सेल से जुड़े विषाक्तताओं के साथ-साथ प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करती है।

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Disclosures

एस.एस.के. सीएआर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में पेटेंट पर एक आविष्कारक है जो नोवार्टिस (मेयो क्लिनिक, पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय और नोवार्टिस के बीच एक समझौते के माध्यम से) और मेट्टाफोर्ज (मेयो क्लिनिक के माध्यम से) को लाइसेंस प्राप्त है। आर.एल.एस. और एस.एस.के. सीएआर इम्यूनोथेरेपी के क्षेत्र में पेटेंट पर आविष्कारक हैं जो ह्यूमनिजेन को लाइसेंस प्राप्त हैं। एस.एस.के. को काइट, गिलियड, जूनो, सेलजेन, नोवार्टिस, ह्यूमनिजेन, मोर्फोसिस, टोलेरो, सुनेसिस, लीहलैब्स और लेंटिजेन से अनुसंधान वित्त पोषण प्राप्त होता है।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R37CA266344, 1K99CA273304), रक्षा विभाग (CA201127), मेयो क्लिनिक K2R पाइपलाइन (S.S.K.), मेयो क्लिनिक सेंटर फॉर इंडिविजुअलाइज्ड मेडिसिन (S.S.K.), और Predolin Foundation (R.L.S.) के माध्यम से समर्थित किया गया था। इसके अलावा, हम मेयो क्लिनिक एनएमआर कोर सुविधा कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्र 1 BioRender.com में बनाया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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कैंसर अनुसंधान अंक 192 कार्ट सेल कार्ट सेल से जुड़े विषाक्तता रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल कैंसर थेरेपी विवो प्रीक्लिनिकल मॉडल में ।

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

एक तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट माउस मॉडल का उपयोग करके चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी सेल-संबद्ध विषाक्तता का आकलन
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Manriquez Roman, C., Sakemura, R.… More

Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).

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