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Cancer Research

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64535
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1,2, 1,2, 6, 6, 1,2, 1,2, 6, 1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

ERRATUM NOTICE

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, in dem ein von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie abgeleitetes Xenograft-Modell als Strategie zur Bewertung und Überwachung von CD19-gerichteten chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizitäten verwendet wird.

Abstract

Die chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie (CART) hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Behandlung mehrerer Arten von CD19+ -Malignomen entwickelt, was kürzlich zur FDA-Zulassung mehrerer CD19-gerichteter CART-Zelltherapien (CART19) geführt hat. Die CART-Zelltherapie ist jedoch mit einer einzigartigen Reihe von Toxizitäten verbunden, die ihre eigene Morbidität und Mortalität mit sich bringen. Dazu gehören das Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) und die Neuroinflammation (NI). Die Verwendung präklinischer Mausmodelle war für die Forschung und Entwicklung der CART-Technologie von entscheidender Bedeutung, um sowohl die Wirksamkeit von CARTs als auch die Toxizität von CARTs zu bewerten. Zu den verfügbaren präklinischen Modellen zur Erprobung dieser adoptiven zellulären Immuntherapie gehören syngene, xenotransplantierte, transgene und humanisierte Mausmodelle. Es gibt kein einzelnes Modell, das das menschliche Immunsystem nahtlos widerspiegelt, und jedes Modell hat Stärken und Schwächen. Diese Methodenarbeit zielt darauf ab, ein von Patienten abgeleitetes Xenotransplantatmodell zu beschreiben, das leukämische Blasten von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie als Strategie zur Bewertung von CART19-assoziierten Toxizitäten, CRS und NI verwendet. Es hat sich gezeigt, dass dieses Modell sowohl die CART19-assoziierten Toxizitäten als auch die therapeutische Wirksamkeit in der Klinik rekapituliert.

Introduction

Die chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie (CART) hat die Krebsimmuntherapie revolutioniert. Es hat sich als erfolgreich bei der Behandlung von rezidivierter/refraktärer akuter lymphatischer Leukämie (ALL), großzelligem B-Zell-Lymphom, Mantelzell-Lymphom, follikulärem Lymphom und multiplem Myelom 1,2,3,4,5,6,7 erwiesen, was zu den jüngsten FDA-Zulassungen geführt hat. Trotz der anfänglichen Erfolge in klinischen Studien führt die Behandlung mit der CART-Zelltherapie zu Toxizitäten, die oft schwerwiegend und gelegentlich tödlich sind. Zu den häufigsten Toxizitäten nach CART-Zelltherapie gehört die Entwicklung von CRS und NI, die auch als Immuneffektorzell-assoziiertes Neurotoxizitätssyndrom (ICANS) bezeichnet werden8,9. CRS wird durch die Überaktivierung und massive Expansion von CART-Zellen in vivo verursacht, was zur anschließenden Sekretion mehrerer inflammatorischer Zytokine führt, darunter Interferon-γ, Tumornekrosefaktor-α, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin-6 (IL-6). Dies führt zu Hypotonie, hohem Fieber, Kapillarlecksyndrom, Atemversagen, Multiorganversagen und in einigen Fällen zum Tod10,11. CRS entwickelt sich in 50-100% der Fälle nach CART19-Zelltherapie11,12,13. ICANS ist ein weiteres einzigartiges unerwünschtes Ereignis im Zusammenhang mit der CART-Zelltherapie und ist gekennzeichnet durch generalisierte Hirnödeme, Verwirrtheit, Benommenheit, Aphasie, motorische Schwäche und gelegentlich Krampfanfälle 9,14. Jeder Grad von ICANS tritt bei bis zu 70 % der Patienten auf, und die Grade 3-4 werden bei 20-30 % der Patienten berichtet 5,10,15,16. Insgesamt sind CRS und ICANS weit verbreitet und können tödlich sein.

Die Behandlung von ICANS nach einer CART-Zelltherapie ist eine Herausforderung. Bei den meisten Patienten mit ICANS kommt es auch zu CRS17, das häufig mit dem IL-6-Rezeptorantagonisten Tocilizumab oder Steroiden18 behandelt werden kann. Ein früherer Bericht zeigte, dass eine frühzeitige Intervention mit Tocilizumab die Rate des schweren CRS verringerte, aber keinen Einfluss auf die Inzidenz oder den Schweregrad von ICANShatte 19. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung oder Prophylaxe für ICANS, und es ist von entscheidender Bedeutung, Präventionsstrategien zu untersuchen20.

Es wird angenommen, dass myeloische Zellen und assoziierte Zytokine/Chemokine die Haupttreiber für die Entwicklung von CRS und ICANSsind 21. Während CRS in direktem Zusammenhang mit der extremen Erhöhung der Zytokine und der T-Zell-Expansion steht, ist die Pathophysiologie von ICANS weitgehend unbekannt22,23. Daher ist es zwingend erforderlich, ein Mausmodell zu etablieren, das diese Toxizitäten nach der CART-Zelltherapie rekapituliert, um die Mechanismen zu untersuchen und Präventionsstrategien zu entwickeln.

Derzeit gibt es mehrere präklinische Tiermodelle, die zur Untersuchung, Optimierung und Validierung der Wirksamkeit von CART-Zellen sowie zur Überwachung der damit verbundenen Toxizitäten verwendet werden. Dazu gehören syngene, xenotransplantierte, immunkompetente transgene, humanisierte transgene und patientenabgeleitete Xenotransplantat-Mäuse sowie Primatenmodelle. Jedes dieser Modelle hat jedoch Nachteile, und einige spiegeln nicht die tatsächliche Wirksamkeit oder Sicherheitsbedenken von CART-Zellen wider24,25. Daher ist es unerlässlich, das beste Modell für die beabsichtigten Ziele der Studie sorgfältig auszuwählen.

In diesem Artikel wird versucht, die Methodik zu beschreiben, die zur Bewertung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten, CRS und NI, unter Verwendung eines ALL-patientenabgeleiteten Xenotransplantats (PDX) in vivo verwendet wird (Abbildung 1). Konkret werden bei den hier beschriebenen Methoden CART19-Zellen verwendet, die im Labor der Autoren nach zuvor beschriebenen Protokollen erzeugt wurden. Kurz gesagt, menschliche T-Zellen werden mit Hilfe einer Dichtegradiententechnik aus gesunden mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) des Spenders isoliert, an Tag 0 mit CD3/CD28-Kügelchen stimuliert und an Tag 1 mit CARs lentiviral transduziert, die aus einem CD19-gerichteten einkettigen variablen Fragment bestehen, das mit 4-1BB- und CD3ζ-Signaldomänen fusioniert ist. Diese CART-Zellen werden dann expandiert, am Tag 6 entkläutet und am Tag 8 kryokonserviert 26,27,28,29,30. Wie bereits erwähnt, werden die Mäuse einer lymphodepletierenden Behandlung unterzogen, gefolgt von der Verabreichung von patienteneigenen leukämischen Blasten (ALL)28. Zunächst wird die Tumortransplantation durch submandibuläre Blutentnahme überprüft. Nach Etablierung einer entsprechenden Tumorlast werden den Mäusen CART19-Zellen verabreicht. Dann werden die Mäuse täglich gewogen, um das Wohlbefinden zu beurteilen. Die Kleintier-Magnetresonanztomographie (MRT) wird durchgeführt, um die NI zu beurteilen, zusammen mit Schwanzblutungen, um die T-Zell-Expansion und die Zytokin-/Chemokinproduktion zu beurteilen. Die unten beschriebenen Techniken werden dringend empfohlen, um als Modell zur Untersuchung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten in einem PDX-Modell verwendet zu werden.

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Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB), des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) und des Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) der Mayo Clinic.

HINWEIS: Alle Materialien, die für die Arbeit mit Mäusen verwendet werden, müssen steril sein.

1. Injektion von Busulfan an NSG-Mäuse

  1. Besorgen Sie sich männliche, 8-12 Wochen alte, immungeschwächte NOD-SCID IL2rγnull (NSG) Mäuse und wiegen Sie sie vor der Injektion.
    HINWEIS: Für statistische Signifikanz wird empfohlen, mindestens fünf Mäuse pro Gruppe zu verwenden und dieses Experiment mindestens einmal mit weiblichen Mäusen zu wiederholen.
  2. Bereiten Sie Busulfan für die intraperitoneale (i.p.) Injektion vor. Füllen Sie die Spritze mit einer 1-ml-Insulinspritze langsam und vorsichtig mit genau 30 mg/kg Busulfan, gefolgt von einer i.p.-Injektion an die Mäuse, und setzen Sie sie zurück in den Käfig.

2. Injektion von ALLEN patienteneigenen Blasten (CD19+) in die NSG-Mäuse

HINWEIS: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) der Mayo Clinic.

  1. Entnahme von primären leukämischen Blasten aus dem peripheren Blut von Patienten mit rezidivierter und refraktärer ALL.
  2. Bereiten Sie die Zielzellen für die intravenöse (i.v.) Injektion vor.
    1. Zählen Sie CD19+ -Zielzellen mit einem Hämozytometer und zeichnen Sie das endgültige Volumen und die Konzentration der Zellen auf.
      HINWEIS: Um die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen, wird dringend empfohlen, Trypanblau beim Zählen der Zellen zu verwenden.
    2. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 °C pelletiert.
    3. Das Zellpellet wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 50 × 106 Zellen/ml in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen resuspendiert und auf Eis gelegt.
    4. Das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit den Zielzellen mit dem Finger vortexen, bis die Zellen vollständig homogenisiert sind.
    5. Füllen Sie die Spritze mit einer 1-ml-Insulinspritze langsam und vorsichtig mit genau 100 μl der vorbereiteten Zielzellen und schnippen Sie die Spritze, um Blasen zu entfernen.
      HINWEIS: Das Volumen von 100 μl reicht für die Verabreichung von 5 × 106 Zellen an jede Maus.
    6. Legen Sie die Mäuse für 5-10 Minuten unter warmes Licht. Sobald die Schwanzvene angeschwollen und mit bloßem Auge besser sichtbar ist, setzen Sie die Mäuse in eine geeignete Einsperr-/Fixierungskammer.
    7. Wischen Sie den Schwanz der Maus mit einem Alkoholtupfer ab. Injizieren Sie die Zielzellen direkt in die Schwanzvene (i.v.) und setzen Sie die Maus zurück in den Käfig. Nach der Inokulation der Zielzellen sind die Mäuse täglich oder wie von der örtlichen Tierethikkommission empfohlen zu überwachen.

3. Beurteilung des Tumortransplantats

  1. Beurteilen Sie ab 6 Wochen nach der Injektion der Zielzelle das Tumortransplantat, indem Sie die Expression von CD19+ -Zellen im peripheren Blut mittels Durchflusszytometrie messen.
  2. Peripherer Bluttest zur Beurteilung der CD19+ -Expansion
    1. Entnehmen Sie den Mäusen 6-8 Wochen nach der Injektion der CART19-Zellen Blut.
      HINWEIS: Es gibt verschiedene Methoden, um Blut zu entnehmen. Für dieses Protokoll ist die submandibuläre Blutentnahme die bevorzugte Methode der Wahl.
    2. Die Maus wird mit Isofluran in einer Induktionskammer mit 5% Isofluran anästhesiert. Sobald die Anästhesie erreicht ist, wird das durch einen Nasenkegel eingeatmete Isofluran bei 1-3% gehalten.
      HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, Augensalbe aufzutragen, um Augentrockenheit zu verhindern.
    3. Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und halten Sie die Maus mit der nicht-dominanten Hand fest, indem Sie die lose Haut über dem Hals greifen. Punktieren Sie die Vene mit einer Lanzette etwas hinter dem Unterkiefer.
      HINWEIS: Nur die Spitze der Nadel (1-2 mm) ist erforderlich, um in die Vene einzudringen.
    4. Wenn das Blut tropft, sammeln Sie mindestens 50 μl in einem mit Heparin beschichteten Röhrchen und mischen Sie es gut, indem Sie das Röhrchen mehrmals auf und ab drehen. 30 μl Blut in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden überführen.
      HINWEIS: Für das verbleibende Blut das Röhrchen bei 17.000 × g 10 Minuten bei 4 °C nach unten schleudern. Das Serum (überstehende Schicht) wird in ein sauberes und beschriftetes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei −80 °C gelagert (zur Verwendung im Zytokin-Assay).
    5. 2 ml Lysepuffer (10-facher Lysepuffer auf Ammoniumchlorid-Basis, mit nukleasefreiem Wasser auf 1x verdünnt) in das 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden geben, das das Blut enthält. Sehr gut mischen, indem man das Röhrchen verwirbelt. Inkubieren Sie das Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine ordnungsgemäße Lyse der roten Blutkörperchen zu gewährleisten.
    6. 2 ml Flusspuffer (PBS, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 0,2 g/l einbasisches Kaliumphosphat, 8 g/l Natriumchlorid und 1,15 g/l dibasisches Natriumphosphat mit 2 % fötalem Rinderserum und 1 % Natriumazid) hinzufügen.
    7. Das Röhrchen wird bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Dekantieren Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml Durchflusspuffer hinzu. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 2x.
    8. Den Inhalt der Tube vorsichtig umfüllen. Beobachten Sie die geringe Menge an Flüssigkeit mit einem Pellet, das im Röhrchen verbleibt. Fügen Sie 100 μl Flusspuffer hinzu und resuspendieren Sie ihn sehr gut.
    9. Die gesamte verbleibende Flüssigkeit im 5-ml-Durchflussrohr wird in eine 96-Well-Platte überführt. Stellen Sie sicher, dass jede Probe ordnungsgemäß beschriftet ist. Geben Sie 100 μl Durchflusspuffer in die entsprechenden Vertiefungen und zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 650 × g für 3 Minuten bei 4 °C.
  3. Beurteilung der Expansion der CD19+ -Zielzellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2).
    1. Bereiten Sie eine Mastermischung vor, die 0,3 μl Lebend-/Totfärbung, 0,13 μg (2,5 μl) Anti-Human-CD19-Antikörper, 0,06 μg (2,5 μl) Anti-Human-CD45-Antikörper, 5 μg (2,5 μl) Anti-Maus-CD45 und 42,2 μl Flusspuffer für insgesamt 50 μl pro Probe enthält. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
    2. Mit 150 μl Fließpuffer waschen und anschließend bei 650 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 195 μl Flusspuffer und 5 μl Zählperlen.
    3. Erfassen Sie auf einem Durchflusszytometer, um das Niveau der CD19+ -Zellexpression zu bestimmen. Zu Gating- und Analysezwecken wird zuerst die interessierende Population (CD19+) basierend auf den Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften gegatet, gefolgt von einer einzelnen Gating-Population und dann lebenden Zellen. Sobald die lebenden Zellen mit Gates versehen sind, beurteilen Sie die CD45-Population des Menschen im Vergleich zur CD45-Population der Maus und gleiten Sie aus der menschlichen Population die CD19+ -Zielpopulation aus.
  4. Quantifizieren, um die in 70 μl vorhandene Menge zu bestimmen, und dann in Zellen/μl unter Verwendung von Gleichung (1) ausdrücken:
    Absolute CD19+-Zellzahl = ([CD19+-Zellen/Zählkügelchen] × Anzahl der Zählkügelchen innerhalb von 5 μl)/70
    HINWEIS: Wiederholen Sie den peripheren Bluttest alle 5 Tage, um die CD19+ -Zellexpansion zu beurteilen. Sammeln Sie nicht mehr als 200 μl Blut kumulativ alle 2 Wochen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der örtlichen Tierethikkommission. Sobald die Mäuse eine Krankheitslast von ≥10 Zellen/μl erreicht haben, randomisieren sie sie in CART19-Zell- oder Kontrollgruppen (Abschnitt 4).

4. Verabreichung von CART19-Zellen in vivo

  1. Präparation der CART19-Zellen (~Tag 80):
    HINWEIS: Die Generierung von CART19-Zellen wurde zuvor veröffentlicht 27,30,31. Dieses Verfahren muss in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe 2+ mit aseptischer Technik und persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
    1. Die CART19-Zellen in einem Wasserbadbehälter (37 °C) auftauen. Waschen Sie dann die Zellen in warmem T-Zell-Medium (TCM), um das Dimethylsulfoxid zu entfernen.
      HINWEIS: TCM besteht aus 10% humanem AB-Serum (v/v), 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin (v/v) und serumfreiem hämatopoetischem Zellmedium27,30.
    2. Die CART19-Zellen werden bei 300 × g 8 min bei 4 °C zentrifugiert und in warmer TCM auf eine Endkonzentration von 2 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Lassen Sie die CART-Zellen über Nacht, jedoch nicht länger als 16 Stunden, in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2) ruhen.
  2. Verabreichung von CART19-Zellen per i.v. Injektion (Tag ~80)
    1. Zählen Sie die CART19-Zellen und schleudern Sie sie bei 300 × g für 8 Minuten bei 4 °C.
    2. Die CART19-Zellen werden mit 10 ml PBS resuspendiert und bei 300 × g für 8 Minuten bei 4 °C heruntergeschleudert.
    3. Resuspendieren Sie die CART19-Zellen mit PBS auf eine Endkonzentration von 40 × 106 Zellen/ml, überführen Sie die Zellen in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie auf Eis.
    4. Führen Sie CART19-Zellschwanzveneninjektionen (wie oben beschrieben) durch, indem Sie 100 μl resuspendierte Zellen i.v. injizieren.
      HINWEIS: Ein Volumen von 100 μl reicht für die Verabreichung von 4 × 106 Zellen an jede Maus. Schließen Sie eine Gruppe unbehandelter Mäuse als Negativkontrolle ein.

5. Bewertung der zellassoziierten Toxizität von CART19

  1. Überwachen Sie die Mäuse nach der Verabreichung von CART19-Zellen 2x täglich, um Veränderungen ihres Wohlbefindens zu beurteilen, wie z. B. motorische Schwäche, gekrümmter Körper und Gewichtsverlust.
    HINWEIS: Alle diese körperlichen Veränderungen korrelieren mit CRS-Symptomen in diesem Modell28.
  2. Sobald die Mäuse beginnen, eine motorische Schwäche und eine Gewichtsreduktion zu entwickeln (10-20 % Reduktion gegenüber dem Ausgangswert), wird peripheres Blut entnommen, um die Tumorlast zu analysieren, und eine Serumisolierung auf Zytokine gemäß der in Abschnitt 3 beschriebenen Methodik durchgeführt (Abbildung 3).
  3. Lagern Sie die Serum-Mikrozentrifugenröhrchen bei −80 °C und verwenden Sie die Seren, um die Chemokine und Zytokine mit einem Multiplex-Assay zu analysieren (Abbildung 4).
    HINWEIS: Wenn die Mäuse Anzeichen einer Lähmung der Hintergliedmaßen zeigen, moribund oder lethargisch erscheinen und der Gewichtsverlust > 20% ihres Körpergewichts beträgt, bis zu dem Punkt, der ihre Fähigkeit einschränkt, Nahrung und/oder Wasser zu erreichen, dann werden sie der Euthanasie unterzogen.

6. MRT-Bildgebung

ANMERKUNG: Ein präklinischer (für Kleintiere) MRT-Scanner mit einem Magneten mit vertikaler Bohrung wurde für die in vivo Magnetresonanz und Bildaufnahme verwendet32,33.

  1. Mischen Sie 120 μl Gadolinium + 880 μl Kochsalzlösung und geben Sie sie in eine 1-ml-Insulinspritze. Injizieren Sie 100 μl in jede Maus (i.p.).
    HINWEIS: Gadolinium sollte 15-20 Minuten vor Beginn des Experiments injiziert werden.
  2. Die Maus wird mit Isofluran (2-3%) in einer Induktionskammer für 10-15 Minuten anästhesiert.
    HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, Augensalbe aufzutragen, um Augentrockenheit zu verhindern.
  3. Legen Sie die Mauswirbelsäule auf die Nagetier-kompatible Cradle-Sonde. Positionieren Sie dann die Maus, indem Sie ihre Zähne in die Beißleiste einhaken.
  4. Ziehen Sie den Kopf der Maus in die 25-mm-Volumenspule und stellen Sie den Nasenkonus ein, der mit dem Isofluran-Anästhesiesystem verbunden ist. Ziehen Sie den Knopf der Beißleiste fest, um die Position für die Dauer des Scans beizubehalten.
    HINWEIS: Wenn Sie eine kontrastmittelverstärkte MRT-Untersuchung durchführen, stellen Sie sicher, dass das Gadolinium (in diesem Fall) oder das Kontrastmittel mindestens 10 Minuten vor dem Einsetzen des Geräts in den Bohrungsmagneten injiziert wird. Während der gesamten Zeit der Bildgebung werden die Mäuse durch die Inhalation von 2-3% Isofluran in der Luft über den Nasenkonus betäubt und gleichzeitig ihre Atemfrequenz überwacht.
  5. Verwenden Sie zur Beurteilung der Atmung ein Atem-/Atemüberwachungsgerät.
    HINWEIS: Es ist wichtig, auch die Körpertemperatur zu bestimmen, um eine mögliche Unterkühlung aufgrund einer längeren Anästhesieexposition zu verhindern. Es wird empfohlen, Wärmekissen zu verwenden, um die Körpertemperatur zu kontrollieren.
    1. Befestigen Sie die Atemmonitorsonde in der Nähe des Zwerchfells und befestigen Sie sie mit chirurgischem Klebeband. Halten Sie die Atemfrequenz zwischen 20 und 60 Atemzügen pro Minute, damit der Zustand der Maus stabil ist.
      HINWEIS: Diese Rate sorgt für stabilere MRT-Bilder und verhindert Bewegungsartefakte im aufgenommenen Bild. Wenn die Atemfrequenz höher als der Bereich von 20-60 Atemzügen pro Minute ist, erhöhen Sie die Konzentration von Isofluran. Wenn die Atemfrequenz weniger als 20 Atemzüge pro Minute beträgt, ist die Anästhesie zu tief; Daher muss die Konzentration verringert werden.
  6. Führen Sie die Tiersonde in die kleine Bohrung innerhalb des Kleintier-MRT-Systems mit vertikaler Bohrung ein. Stellen Sie den Kopf des Tieres in der Mitte der Spule ein. Sichern Sie das Gerät mit dem Schloss, damit es aufrecht stehen kann, und schließen Sie das Gerät an den Computer an.
  7. Öffnen und verwenden Sie die Software (z. B. Paravision), um die Scanpositionen und Scantypen einzurichten. Bestimmen Sie die optimalen axialen und sagittalen Positionen, während Sie sie für alle Versuchsgruppen konsistent halten.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Aufnahme eines Probescans als Referenz vor den eigentlichen MRT-Scans in voller Länge zu verwenden.
  8. Fahren Sie mit der MRT-Datenerfassung fort (wie zuvor beschrieben32,34,35,36). Erhalten Sie sowohl T1-gewichtete als auch T2-gewichtete MRT-Bilder mit dem unten empfohlenen Aufbau.
    1. Verwenden Sie für T1-gewichtete MRT-Bilder die T1-gewichtete Multislice-Multiecho-Sequenz (MSME) mit einer Wiederholungszeit (TR) von 300 ms, einer Echozeit (TE) von 9,5 ms, einem Sichtfeld (FOV) von 4 cm x 2 cm x 2 cm und einer Matrix von 192 x 96 x 96.
    2. Für T2-gewichtete MRT-Bilder wurde eine Multislice-Multiecho-Sequenz (MSME) mit einer TR von 300 ms, einer TE von 9,5 ms, einem FOV von 4 cm x 2 cm x 2 cm und einer Matrix von 192 x 96 x 96 verwendet.
  9. Sobald die Scans abgeschlossen sind, entfernen Sie die Sonde aus der Bohrung. Entferne die Maus vorsichtig, indem du die Zähne von der Beißstange entfernst. Überwachen Sie das Tier in einem separaten Käfig, bis es wieder bei vollem Bewusstsein ist und eine ausreichende motorische Funktion wiedererlangt hat.
  10. Verwenden Sie nach der Extraktion der Daten aus der Software eine Analysesoftware für die Quantifizierung und das 3D-Volumen-Rendering (Abbildung 4) der Hyperintensitätsregionen.
    HINWEIS: Wenn möglich, wird dringend empfohlen, zwei separate verblindete Beobachter für die Datenanalyse zu haben.

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Representative Results

Das Ziel dieses Protokolls ist es, CART-Zell-assoziierte Toxizitäten anhand eines PDX-Mausmodells aus Tumorzellen von Patienten mit ALL zu bewerten (Abbildung 1). Zunächst erhielten NSG-Mäuse i.p. Injektionen von Busulfan (30 mg/kg) mit dem Ziel, sie immunsupprimieren und die Transplantation von CART-Zellen zu erleichtern28. Am nächsten Tag erhielten sie ~5 × 106 PBMCs (i.v.), die von ALLEN Patienten stammten. Die Mäuse wurden ~13 Wochen lang mit dem Schwanzblutungstest auf die Transplantation überwacht. Rote Blutkörperchen wurden entnommen und lysiert, gefolgt von einer durchflusszytometrischen Vorbereitung, um die Expression von CD19+ -Tumorzellen zu beurteilen (Abbildung 2).

Sobald die Mäuse ≥10 Tumorzellen/μl erreicht hatten, wurden sie randomisiert und darauf vorbereitet, 4 ×10 6 CART19-Zellen (i.v.) zu erhalten. Um die CART19-assoziierten Toxizitäten zu beurteilen, wurden die Mäuse einmal täglich gewogen (Abbildung 3A). Der Gewichtsverlust wurde als Symptom des CRS-Auftretens gewählt, da zuvor festgestellt wurde, dass er mit CART-Zell-assoziierten Toxizitäten zusammenhängt28,37. Periphere Blutuntersuchungen (über submandibuläre Blutentnahme) wurden durchgeführt, um die Tumorlast und die CART-Zellexpansion durch Durchflusszytometrie-Analyse von humanen CD19+-Tumorzellen und humanen CD3+-T-Zellen zu beurteilen. Darüber hinaus wurde Serum entnommen und eine Bewertung der inflammatorischen Zytokine durchgeführt. Die Assays wurden einen Tag vor der CART19-Zellinfusion sowie 5 und 10 Tage nach der CART19-Zellinfusion durchgeführt, da diese Zeitpunkte besonders relevant für das Auftreten von CRS und die Entwicklung von Symptomen sind.

Insbesondere hier wurde vor und nach der Verabreichung von CART19-Zellen ein Multiplex-Assay durchgeführt, wobei die repräsentativsten Zytokine und Chemokine GM-CSF, IL-18, MIP-1α und IP-10 waren (Abbildung 3B). Es können jedoch auch andere Assays durchgeführt werden, um die Konzentrationen dieser Proteine im Serum zu bestimmen. Alternativ wurden die Mäuse einer MRT-Untersuchung unterzogen, um die vaskuläre Permeabilität im zentralen Nervensystem (ZNS) zu beurteilen. Mäusen wurde das Kontrastmittel Gadolinium (i.p.) injiziert, um die Entzündung des Gehirns und die Störung der Blut-Hirn-Schranke zu messen38. Dann wurden sie mit Isofluran anästhesiert und kontrastverstärkte T1- und T2-gewichtete Bilder aufgenommen (Abbildung 4). Bei T2-Bildern (Abbildung 4, links) zeigt der hellere Bereich (weiß) das Vorhandensein von Ödemen oder Flüssigkeiten an, die vor allem bei Hirntumoren und Entzündungen zu sehen sind. Bei T1-Bildern (Abbildung 4, Mitte) zeigen die helleren Bereiche Bereiche an, in denen Blut austritt oder die Blut-Hirn-Schranke gestört ist. Schließlich wurden die 3D-Rekonstruktionsbilder (Abbildung 4, rechts) mit Hilfe von Software unter Verwendung von Gadolinium-verstärkten T1-Bildern auf der Grundlage von Hyperintensitätssignalen zusammengesetzt, die der vaskulären Permeabilität entsprechen, die das Volumen des Gadolinium-Austritts im Gehirn wiedergibt34.

Figure 1
Abbildung 1: Experimentelles Schema eines patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodells zur Beurteilung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten, Zytokinfreisetzungssyndrom und Neuroinflammation. NSG-Mäuse wurden mit 30 mg/kg Busulfan (i.p.) konditioniert und erhielten 3 × 10 6-5 × 106 Blasten (i.v.), die aus dem peripheren Blut von Patienten mit ALL gewonnen wurden. Als nächstes wurden die Mäuse auf Tumortransplantation mittels submandibulärer Blutentnahme überwacht, gefolgt von einer Durchflusszytometrie zur Bestimmung der CD19+-Blasten. Wenn die CD19+-Zellen im peripheren Blut ≥10 Zellen/μl betrugen, erhielten die Mäuse 2 × 10 6-5 × 106 CART19-Zellen. Die Mäuse wurden täglich gewogen, um ihr Wohlbefinden zu messen. 10 Tage nach der CART19-Zellinfusion wurden MRTs des Mäusegehirns durchgeführt, um eine Neuroinflammation zu erkennen. Schwanzblutungen zur Beurteilung der Zytokin-/Chemokinproduktion und der T-Zell-Expansion wurden wöchentlich nach der CART19-Zellinjektion durchgeführt. Abkürzungen: CART = chimäre Antigenrezeptor-T-Zelle; CART19 = CD19-gerichteter CART; ALL = akute lymphatische Leukämie; i.v. = intravenös; i.p. = intraperitoneal; PB = peripheres Blut; NSG = NOD-SCID IL2rγnull. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Analyse von CD19+ Tumorzellen als Indikator für die Tumorlast in einem ALL PDX-Modell zur Beurteilung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten. (A) Repräsentative durchflusszytometrische Analyse, die die Gating-Strategie zur Analyse der CD19+ -Zellpopulation zeigt, die aus einer peripheren Blutprobe einer Maus entnommen wurde, der patienteneigene ALL-Blasten injiziert wurden. (B) Die Quantifizierung und der Vergleich der CD19+ -Zellpopulationen zwischen Mäusen, die mit CART19 behandelt wurden, und unbehandelten Mäusen auf der Grundlage von Rohdaten, die aus der Durchflusszytometrie gewonnen wurden. (unidirektionale ANOVA; n = 3 Mäuse pro Gruppe; Fehlerbalken, REM). Abkürzungen: ns = nicht signifikant; ALL = akute lymphatische Leukämie; PDX = patientenabgeleitetes Xenotransplantat; CART = chimäre Antigenrezeptor-T-Zelle; CART19 = CD19-gerichteter CART; SSC-H = seitliche Streupeakhöhe; FSC-H = Streuspitzenhöhe nach vorne; SSC-A = seitliche Streupeakfläche; FSC-A = Streuspitzenfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Bewertung von CART19-assoziierten Toxizitäten unter Verwendung eines ALL-PDX-Modells. (A) Repräsentatives Diagramm der prozentualen Gewichtsreduktion bei Mäusen, die mit CART19-Zellen oder Kontroll-T-Zellen behandelt wurden, für die ersten 6 Tage nach CART (Zwei-Wege-ANOVA, ***p < 0,001, ****p < 0,00001; Fehlerbalken, SEM). (B) Expression von Zytokinen und Chemokinen im Serum von NSG-Mäusen vor und nach der Verabreichung von CART19-Zellen. NSG-Mäuse wurden vor und nach der Verabreichung von CART19-Zellen (i.v.) submandibulären Blutungen unterzogen, um ihr Serum zu gewinnen und die Expression der folgenden Zytokine und Chemokine zu beurteilen: GM-CSF, IL-18, MIP-1α, IP-10, IL-1β und IL-6 (Zwei-Wege-ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; n =3 Mäuse; neun technische Replikate; Fehlerbalken, SEM). Abkürzungen: ns = nicht signifikant; ALL = akute lymphatische Leukämie; PDX = patientenabgeleitetes Xenotransplantat; CART = chimäre Antigenrezeptor-T-Zelle; CART19 = CD19-gerichteter CART; NSG = NOD-SCID IL2rγnull; GM-CSF = Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; IL-18 = Interleukin-18; MIP-1α = Makrophagen-Entzündungsprotein-1 alpha; IP-10 = Interferon-gamma-induziertes Protein 10; IL-1β = Interleukin-1β; IL-6 = Interleukin-6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Magnetresonanztomographie zur Beurteilung der Neuroinflammation während der Behandlung mit CART19-Zellen in einem PDX-Modell. NSG-Mäusen, denen Tumorzellen von ALL-Patienten transplantiert wurden, wurden mit CART19-Zellen infundiert, und die Gehirne wurden mit Gadolinium-verstärkter MRT abgebildet, nachdem die Mäuse innerhalb von 10 Tagen nach der CART-Infusion neurologische Symptome gezeigt hatten. (Links) T2-gewichtetes Bild, das Hinweise auf Ödeme und mögliches entzündliches Infiltrat während der NI bei CART19-behandelten Mäusen zeigt (roter Pfeil). (Mitte) Repräsentativer axialer Schnitt der T1-gewichteten MRT mit Kontrastmittelverstärkung im Hirnparenchym, was auf eine erhöhte Gefäßpermeabilität bei CART19-behandelten Mäusen hindeutet (roter Pfeil). (Rechts) Dreidimensionale Rekonstruktionen des Nagetiergehirns mit T1-Hyperintensitätsregionen (rot) wurden mit der Software Analyze 12.0 erstellt. Abkürzungen: MRT = Magnetresonanztomographie; ALL = akute lymphatische Leukämie; PDX = patientenabgeleitetes Xenotransplantat; CART = chimäre Antigenrezeptor-T-Zelle; CART19 = CD19-zielgerichteter CART. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Mensch Maus
Zytokin/Chemokin Humane myeloische Zytokine (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1) Humane myeloische Zytokine (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1)
Zeit bis CRS (Tag) 2-5 4-6
Zeit bis NI (Tag) 5-7 6-8
BBB-Status BBB-Störung BBB-Störung
Geweberesidente Makrophagen Aktivierung der Mikroglia Aktivierung der Mikroglia
CART-Zelle im ZNS Infiltration des Gehirns Infiltration des Gehirns

Tabelle 1: Rekapitulation der klinisch beobachteten CART-Zell-assoziierten Toxizitäten mit dem ALL-PDX-Modell. Abkürzungen: GM-CSF = Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor; IL = Interleukin; CRS = Zytokin-Freisetzungs-Syndrom; NI = Neuroinflammation; BHS = Blut-Hirn-Schranke; ZNS = Zentrales Nervensystem; MCP-1 = Monozyten-Chemolockstoff-Protein 1.

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Discussion

In diesem Bericht wurde eine Methodik zur Bewertung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten unter Verwendung eines ALL-PDX-Modells beschrieben. Genauer gesagt versucht dieses Modell, zwei lebensbedrohliche Toxizitäten, CRS und NI, nachzuahmen, die Patienten häufig nach der Infusion von CART-Zellen erleben. Es rekapituliert viele Kennzeichen von CART-Toxizitäten, die in der Klinik beobachtet wurden: Gewichtsverlust, motorische Dysfunktion, Neuroinflammation, entzündliche Zytokin- und Chemokinproduktion und die Infiltration verschiedener Effektorzellen in das zentrale Nervensystem 8,20,28. Bisher wurde dieses PDX-Modell verwendet, um die anfängliche Entwicklung von CRS und NI nachzuahmen (Tabelle 1) und verschiedene Strategien zur Toxizitätsprävention und -behandlung zu bewerten. In einer Studie in diesem PDX-Modell wurden CART19-Zellen verwendet, die von GM-CSF abgereichert waren. Genauer gesagt zeigten diese Ergebnisse, dass die GM-CSF-Depletion zu einer reduzierten Sekretion von CRS-gebundenen Zytokinen und Chemokinen führte, was mit diesem ALL PDX-Mausmodell eindeutig nachgewiesen wurde29. Dieses PDX-Modell wurde auch erfolgreich verwendet, um die In-vivo-Expansion von CART-Zellen zu bewerten, die mit der CRS-Entwicklung nach CART19-Zellinfusion korreliert, wobei ein Natriumiodid-Symporter (NIS) als Bildgebungsplattform verwendet wurde26. Daher stellt dieses vorgeschlagene Modell ein nützliches Werkzeug dar, das verwendet werden kann, um die potenziellen Toxizitäten von CART-Zellen zu bewerten.

Es ist wichtig zu erwähnen, dass viele andere Modelle verwendet wurden, um CART-Zellen in vivo zu untersuchen. Dazu gehören syngene, transgene und humanisierte Mausmodelle sowie xenogene Modelle24. Das syngene Mausmodell, auch immunkompetentes Allotransplantat-Mausmodell genannt, verwendet CART-Zellen, Tumor- und Zielantigene, die murinen Ursprungs sind. Dies ist von Vorteil, da es die Untersuchung von CART-Zellen in einem voll funktionsfähigen Immunsystem ermöglicht und auch On-Target- und Off-Tumor-Toxizitäten aufdecken kann. Der Nachteil dieses Modells besteht darin, dass sich die Biologie und Immunität von Mäusen von denen des Menschen unterscheidet, und daher ist es kein relevantes Modell für translationale Studien, bei denen das Ziel darin besteht, klinische Studien durchzuführen24,39.

Immunkompetente transgene Mausmodelle exprimieren ein humanes Tumor-assoziiertes Antigen (TAA)-Transgen sowohl auf gesundem Gewebe als auch auf Tumoren in Mustern, die denen in menschlichem Gewebe ähneln. Diese Mäuse wurden auch in CART-Studien verwendet, um die Sicherheit von CART-Zellen besser zu bewerten, indem sie On-Target-Effekte außerhalb des Tumors aufdeckten40,41. Humanisierte Mäuse, denen CD34+ humane hämatopoetische Stammzellen implantiert wurden, können ein vorteilhaftes Modell sein, um die Wirksamkeit und Toxizität von CART auf das menschliche hämatopoetische System zu untersuchen, da das rekonstituierte Immunsystem die CART-Hemmung nachahmen und einen Zytokinsturm auslösen kann, der das in der Klinik beobachtete CRS rekapituliert42,43,44. Obwohl diese Modelle die Untersuchung spezifischer Immunzellen in Bezug auf die Wirksamkeit von CART ermöglichen, ist das humanisierte System immer noch primitiv und muss weiter optimiert werden. Darüber hinaus ist ihre Verwendung bei der Untersuchung von Off-Target-Effekten begrenzt, da die meisten Wirtsantigene auf gesundem Gewebe murinen Ursprungs sind. Darüber hinaus ist die Entwicklung des CD34+ humanisierten Mausmodells eine technische Herausforderung45. Humane Xenograft-Modelle bei immungeschwächten Mäusen werden jedoch häufig verwendet, um die Wirksamkeit menschlicher CART-Zellen vor der Umsetzung in klinische Studien zu bewerten, und wie in dieser Arbeit gezeigt wird, können sie verwendet werden, um die Toxizitäten im Zusammenhang mit der CART-Zellaktivität zu bewerten. Das Fehlen von Immunsystem- und Immunzellen wie T-Zellen und NK-Zellen schränkt jedoch ihre Anwendung für die Bewertung der On-Target-Toxizität außerhalb des Tumors, der Wechselwirkungen von CART-Zellen mit Zellen des angeborenen Immunsystems und der Hemmung von CART-Zellen durch die Tumormikroumgebung ein.

Der Vorteil des hier beschriebenen Protokolls besteht darin, dass es einfache Verfahren mit NSG-Mäusen erfordert, um CART-Zell-assoziierte Toxizitäten zu beobachten und zu bewerten. Erstens ist es leicht zu reproduzieren und wurde optimiert, um Strategien zur Vermeidung von CART-Toxizitäten durch GM-CSF-Neutralisation zu bewerten und die Expansion von CART-Zellen in Korrelation mit dem Ausbruch von CRS zu visualisieren. Bei der Verwendung dieses neuartigen PDX-Modells ist es wichtig, die kritischen Schritte korrekt durchzuführen, wie z. B. die Bestätigung der korrekten Einpflanzung der ALL-Blasten und die frühzeitige Überwachung des CRS-Beginns direkt nach der CART-Verabreichung. Die Beurteilung von Zytokinen und die Gewichtsüberwachung sind entscheidend für die Bestimmung von CART-assoziierten Toxizitäten, und die MRT definiert den Beginn der NI. Die Nachteile dieses Modells sind wie folgt: 1) Da PDX ALL-Zellen länger brauchen, um sich einzupflanzen und eine hohe Tumorlast zu erreichen, dauert es etwa 2-3 Monate von der Tumorzellinokulation bis zur CART19-Zellbehandlung; 2) Als primäres PDX-Modell gibt es eine signifikante Variabilität von Patient zu Patient in Bezug auf die Zeit bis zur Transplantation und das Ansprechen auf die CART-Zelltherapie; 3) Die Tumorlast kann nicht mit Biolumineszenz-Bildgebung beurteilt werden und erfordert eine häufige Untersuchung des peripheren Blutes; und 4) das Fehlen von angeborenen Immunzellen schränkt die Fähigkeit dieses Modells ein, CART-Interaktionen mit Immunzellen oder der Tumormikroumgebung zu untersuchen.

Das Interesse an der Erprobung von Adoptivzellen in komplexeren Mausmodellen ist in den letzten zehn Jahren gewachsen, da sich gezeigt hat, dass einfache immundefiziente Mausmodelle keine idealen präklinischen Modelle sind. Das hier beschriebene PDX-Mausmodell zur Bewertung der CART-Zell-assoziierten Toxizität stellt ein vielversprechendes präklinisches Modell auf dem Gebiet der CART-Zelltherapie dar, da es den Zeitplan, die Symptome und die Marker von CRS und NI nach CART-Zellinfusion nachahmt, wie sie in der Klinik zu sehen sind. Insgesamt bietet die hier beschriebene Methodik eine robuste Plattform für die Bewertung der CART19-Zell-assoziierten Toxizität sowie der Wirksamkeit.

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Disclosures

S.S.K. ist Erfinder von Patenten auf dem Gebiet der CAR-Immuntherapie, die an Novartis (durch eine Vereinbarung zwischen der Mayo Clinic, der University of Pennsylvania und Novartis) und an Mettaforge (über die Mayo Clinic) lizenziert sind. R.L.S. und S.S.K. sind Erfinder von Patenten auf dem Gebiet der CAR-Immuntherapie, die an Humanigen lizenziert sind. S.S.K. erhält Forschungsgelder von Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs und Lentigen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), das Verteidigungsministerium (CA201127), die K2R-Pipeline der Mayo Clinic (S.S.K.), das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (S.S.K.) und die Predolin Foundation (R.L.S.) unterstützt. Darüber hinaus möchten wir uns bei den Mitarbeitern der Mayo Clinic NMR Core Facility bedanken. Abbildung 1 wurde im Jahr BioRender.com

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

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References

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Tags

Cancer Research Ausgabe 192 CART-Zellen CART-Zell-assoziierte Toxizitäten patientenabgeleitetes Xenotransplantat-Modell (PDX) Krebstherapie präklinisches In-vivo-Modell

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie
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Manriquez Roman, C., Sakemura, R.… More

Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).

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