Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Оценка токсичности, ассоциированной с Т-клетками химерного антигенного рецептора, с использованием мышиной модели ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64535
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1,2, 1,2, 6, 6, 1,2, 1,2, 6, 1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

ERRATUM NOTICE

Summary

В данной статье мы опишем протокол, в котором модель ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом используется в качестве стратегии для оценки и мониторинга токсичности, ассоциированной с Т-клетками рецептора химерного антигена CD19.

Abstract

Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) стала мощным инструментом для лечения нескольких типов злокачественных опухолей CD19+ , что привело к недавнему одобрению FDA нескольких методов клеточной терапии CD19-таргетной CART (CART19). Тем не менее, клеточная терапия CART связана с уникальным набором токсичных веществ, которые несут в себе свою заболеваемость и смертность. К ним относятся синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейровоспаление (NI). Использование доклинических мышиных моделей имеет решающее значение в исследованиях и разработках технологии CART для оценки как эффективности CART, так и токсичности CART. Доступные доклинические модели для тестирования этой адоптивной клеточной иммунотерапии включают сингенные, ксенотрансплантатные, трансгенные и гуманизированные мышиные модели. Не существует единой модели, которая бы органично отражала иммунную систему человека, и у каждой модели есть сильные и слабые стороны. Целью данной работы по методам является описание модели ксенотрансплантата пациента с использованием лейкозных бластов пациентов с острым лимфобластным лейкозом в качестве стратегии оценки токсичности, ассоциированной с CART19, CRS и NI. Было показано, что эта модель повторяет токсичность, связанную с CART19, а также терапевтическую эффективность, наблюдаемую в клинике.

Introduction

Клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CART) произвела революцию в области иммунотерапии рака. Он доказал свою эффективность в лечении рецидивирующего/рефрактерного острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), крупноклеточной В-клеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы и множественной миеломы 1,2,3,4,5,6,7, что привело к недавним одобрениям FDA. Несмотря на первоначальный успех в клинических испытаниях, лечение клеточной терапией CART приводит к токсичности, которая часто бывает тяжелой, а иногда и летальной. Наиболее распространенные токсичные явления после клеточной терапии CART включают развитие CRS и NI, также называемого синдромом нейротоксичности, ассоциированным с иммунными эффекторными клетками (ICANS)8,9. CRS вызывается гиперактивацией и массивной экспансией клеток CART in vivo, что приводит к последующей секреции нескольких воспалительных цитокинов, включая интерферон-γ, фактор некроза опухоли-α, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-6 (IL-6). Это приводит к гипотонии, высокой температуре, синдрому капиллярной утечки, дыхательной недостаточности, полиорганной недостаточности, а в некоторых случаях и к смерти10,11. СВК развивается в 50-100% случаев после клеточной терапии CART1911,12,13. ICANS является еще одним уникальным нежелательным явлением, связанным с клеточной терапией CART, и характеризуется генерализованным отеком головного мозга, спутанностью сознания, обтукцией, афазией, двигательной слабостью, а иногда и судорогами 9,14. Любая степень ICANS встречается у 70% пациентов, а степени 3-4 отмечаются у 20-30% пациентов 5,10,15,16. В целом, CRS и ICANS являются распространенными и могут привести к летальному исходу.

Ведение ICANS после клеточной терапии CART является сложной задачей. У большинства пациентов с ICANS также наблюдается СВК17, который часто можно лечить антагонистом рецепторов IL-6 тоцилизумабом или стероидами18. Предыдущее сообщение показало, что раннее вмешательство с применением тоцилизумаба снижает частоту тяжелого СВК, но не влияет на частоту или тяжесть ICANS19. В настоящее время не существует эффективного лечения или профилактического средства для ИКАНС, и крайне важно исследовать профилактические стратегии20.

Считается, что миелоидные клетки и связанные с ними цитокины/хемокины являются основными драйверами развития CRS и ICANS21. В то время как CRS напрямую связан с экстремальным повышением цитокинов и экспансией Т-клеток, патофизиология ICANS в значительной степени неизвестна22,23. Таким образом, крайне важно создать мышиную модель, которая повторяет эти токсичности после клеточной терапии CART, чтобы изучить механизмы и разработать профилактические стратегии.

В настоящее время существует множество доклинических моделей на животных, используемых для изучения, оптимизации и проверки эффективности клеток CART, а также для мониторинга связанной с ними токсичности. К ним относятся сингенные, ксенотрансплантатные, иммунокомпетентные трансгенные, гуманизированные трансгенные и полученные от пациентов ксенотрансплантаты мышей, а также модели приматов. Тем не менее, каждая из этих моделей имеет недостатки, и некоторые из них не отражают истинную эффективность или безопасность клеток CART24,25. Поэтому крайне важно тщательно выбирать оптимальную модель для предполагаемых целей исследования.

В данной статье предпринята попытка описать методологию, используемую для оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, CRS и NI, с использованием модели ксенотрансплантата in vivo, полученного от пациента (PDX) in vivo (рис. 1). В частности, в описанных здесь методах используются клетки CART19, полученные в лаборатории авторов, по ранее описанным протоколам. Вкратце, Т-клетки человека выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови здорового донора (PBMC) с помощью метода градиента плотности, стимулируют шариками CD3/CD28 на 0-й день и лентививически трансдуцируют на 1-й день с помощью CAR, состоящего из одноцепочечного вариабельного фрагмента, нацеленного на CD19, слитого с сигнальными доменами 4-1BB и CD3ζ. Затем эти клетки CART расширяют, очищают от шариков на 6-й день и криоконсервируют на 8-й день 26,27,28,29,30. Как указывалось ранее, мышей подвергают лимфодеплетирующему лечению, за которым следует введение лейкозных бластов (ОЛЛ)28. Во-первых, приживление опухоли проверяется с помощью подчелюстного забора крови. После установления соответствующей опухолевой нагрузки мышам вводят клетки CART19. Затем мышей ежедневно взвешивают, чтобы оценить их самочувствие. Магнитно-резонансная томография (МРТ) мелких животных проводится для оценки NI, а также хвостового кровотечения для оценки роста Т-клеток и продукции цитокинов/хемокинов. Методы, описанные ниже, настоятельно рекомендуется использовать в качестве модели для изучения токсичности, ассоциированной с клетками CART, в модели PDX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол соответствует рекомендациям Институционального наблюдательного совета (IRB) клиники Майо, Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC A00001767) и Институционального комитета по биобезопасности (IBC, Bios00000006.04).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, используемые для работы с мышами, должны быть стерильными.

1. Инъекция бусульфана мышам NSG

  1. Получить самцов мышей в возрасте 8-12 недель с ослабленным иммунитетом, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) и взвесить их перед инъекцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для статистической значимости рекомендуется использовать не менее пяти мышей в группе и повторить этот эксперимент по крайней мере еще раз с самками мышей.
  2. Подготовьте бусульфан для внутрибрюшинной (в/в) инъекции. Используя инсулиновый шприц объемом 1 мл, медленно и осторожно наполните шприц ровно 30 мг/кг бусульфана, после чего в/в инъекции мышам и поместите их обратно в клетку.

2. Инъекция ВСЕХ бластов, полученных от пациента (CD19+), мышам NSG

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол соответствует рекомендациям Институционального комитета по биобезопасности клиники Майо (IBC, Bios00000006.04).

  1. Собирают первичные лейкозные бласты из периферической крови пациентов с рецидивирующим и рефрактерным ОЛЛ.
  2. Подготовьте клетки-мишени для внутривенного введения.
    1. Подсчитайте CD19+ клетки-мишени с помощью гемоцитометра и запишите окончательный объем и концентрацию клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения жизнеспособности клеток настоятельно рекомендуется использовать трипановый синий при подсчете клеток.
    2. Гранулируют клетки центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С.
    3. Ресуспендируйте клеточную гранулу в фосфатно-солевом буфере (PBS) до конечной концентрации 50 × 106 клеток/мл в пробирке микроцентрифуги объемом 1,5 мл и поместите на лед.
    4. Вмешайте в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл, содержащую клетки-мишени, до тех пор, пока клетки не будут полностью гомогенизированы.
    5. Используя инсулиновый шприц объемом 1 мл, медленно и осторожно наполните шприц ровно 100 мкл подготовленных клеток-мишеней и щелкните шприцем, чтобы удалить пузырьки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем 100 мкл позволит ввести 5 × 106 клеток каждой мыши.
    6. Поместите мышей на теплый свет на 5-10 минут. Как только хвостовая вена набухнет и станет более заметной невооруженным глазом, поместите мышей в соответствующую камеру.
    7. Протрите хвост мышки спиртовым тампоном. Введите клетки-мишени непосредственно в хвостовую вену (внутривенно) и поместите мышь обратно в клетку. После инокуляции клеток-мишеней наблюдайте за мышами ежедневно или в соответствии с рекомендациями местного комитета по этике животных.

3. Оценка приживления опухоли

  1. Начиная с 6 недель после инъекции клеток-мишеней, оценивают приживление опухоли с помощью проточной цитометрии для измерения экспрессии CD19+ клеток в периферической крови.
  2. Анализ периферической крови для оценки экспансии CD19+
    1. Забор крови у мышей через 6-8 недель после инъекции клеток CART19.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для забора крови можно использовать несколько методов. Для этого протокола подчелюстной забор крови является предпочтительным методом выбора.
    2. Обезболивайте мышь изофлураном в индукционной камере с 5% изофлураном. После достижения анестезии следует поддерживать дозу изофлурана на уровне 1-3%, вдыхаемую через носовой конус.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется применять офтальмологическую мазь для предотвращения сухости глаз.
    3. Выньте мышь из камеры и удерживайте мышь недоминантной рукой, взявшись за обвисшую кожу на шее. Проколите вену ланцетом немного позади нижней челюсти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для входа в вену требуется только кончик иглы (1-2 мм).
    4. По мере того, как кровь капает, соберите не менее 50 мкл в пробирку с гепариновым покрытием и хорошо перемешайте, несколько раз перевернув пробирку вверх и вниз. Перелейте 30 мкл крови в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оставшейся крови прокрутите пробирку при 17 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Перелейте сыворотку (надосадочный слой) в чистую пробирку с микроцентрифугой объемом 1,5 мл с этикеткой и храните ее при температуре −80 °C (для использования в анализе цитокинов).
    5. Добавьте 2 мл лизисного буфера (10-кратный лизирующий буфер на основе хлорида аммония, разбавленный до 1x с использованием воды, не содержащей нуклеазов) в пробирку с круглым дном объемом 5 мл, содержащую кровь. Очень хорошо перемешайте, вкрутив трубку. Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы обеспечить надлежащий лизис эритроцитов.
    6. Добавить 2 мл проточного буфера (PBS, 0,2 г/л хлорида калия, 0,2 г/л одноосновного фосфата калия, 8 г/л натрия хлорида и 1,15 г/л натрия фосфата двухосновного, содержащего 2% фетальной бычьей сыворотки и 1% азида натрия).
    7. Центрифугируют пробирку при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость и добавьте 2 мл проточного буфера. Повторите этот шаг стирки 2 раза.
    8. Осторожно сцедите содержимое тюбика. Наблюдайте за небольшим количеством жидкости с помощью гранулы, оставшейся в пробирке. Добавьте 100 мкл проточного буфера и очень хорошо ресуспендируйте.
    9. Перелейте всю оставшуюся жидкость из проточной пробирки объемом 5 мл в 96-луночную пластину. Убедитесь, что каждый образец имеет надлежащую маркировку. Добавьте 100 мкл проточного буфера в соответствующие лунки и центрифугируйте 96-луночный планшет при 650 × г в течение 3 мин при 4 °C.
  3. Оценивают экспансию клеток-мишеней CD19+ с помощью проточной цитометрии (рис. 2).
    1. Приготовьте мастер-смесь, содержащую 0,3 мкл живого/мертвого пятна, 0,13 мкг (2,5 мкл) антител к CD19, 0,06 мкг (2,5 мкл) антител к CD45 человека, 5 мкг (2,5 мкл) антимышиного CD45 и 42,2 мкл проточного буфера, всего 50 мкл на образец. Выдерживают в темноте при комнатной температуре 15 мин.
    2. Промывают проточным буфером объемом 150 мкл с последующим центрифугированием при 650 × г в течение 3 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 195 мкл проточного буфера и 5 мкл счетных шариков.
    3. Проводят на проточном цитометре для определения уровня экспрессии CD19+ клеток. Для целей стробирования и анализа сначала затворяют интересующую популяцию (CD19+) на основе характеристик прямого и бокового рассеяния, затем одну популяцию стробирования, а затем живые клетки. После того, как живые клетки будут подключены, оцените популяцию CD45 человека в сравнении с популяцией CD45 мыши, а в человеческой популяции — целевую популяцию CD19+ .
  4. Количественно определите количество, присутствующее в 70 мкл, а затем выразите в клетках/мкл с помощью уравнения (1):
    Абсолютное количество CD19+ клеток = ([CD19+ клеток/счетных шариков] × количество счетных шариков в пределах 5 мкл)/70
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте анализ периферической крови каждые 5 дней, чтобы оценить экспансию клеток CD19+ . Собирайте не более 200 мкл крови кумулятивно каждые 2 недели в соответствии с рекомендациями местного комитета по этике животных. После того, как мыши достигнут бремени заболевания ≥10 клеток/мкл, их рандомизируют в клетки CART19 или контрольные группы (раздел 4).

4. Введение клеток CART19 in vivo

  1. Подготовка клеток CART19 (~День 80):
    ПРИМЕЧАНИЕ: Генерация клеток CART19 была ранее опубликована 27,30,31. Эта процедура должна проводиться в кабинете биобезопасности уровня 2+ с использованием асептической техники и средств индивидуальной защиты.
    1. Разморозьте ячейки CART19 в емкости на водяной бане (37 °C). Затем промойте клетки в теплой Т-клеточной среде (ТКМ), чтобы удалить диметилсульфоксид.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ТКМ состоит из 10% человеческой АБ-сыворотки (v/v), 1% пенициллина-стрептомицина-глутамина (v/v) и бессывороточной гемопоэтической клеточной среды27,30.
    2. Центрифугируют клетки CART19 при 300 × г в течение 8 мин при 4 °C и ресуспендируют в теплой ТКМ до конечной концентрации 2 × 106 клеток/мл. Дайте клеткам CART отдохнуть в инкубаторе (37 °C, 5% CO2) в течение ночи, но не более 16 ч.
  2. Введение клеток CART19 через внутривенную инъекцию (день ~80)
    1. Подсчитайте количество клеток CART19 и отжим при 300 × г в течение 8 мин при 4 °C.
    2. Ресуспендируйте ячейки CART19 с 10 мл PBS и отжим при 300 × g в течение 8 мин при 4 °C.
    3. Ресуспендируйте клетки CART19 до конечной концентрации 40 × 106 клеток/мл с PBS, перенесите клетки в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и поместите их на лед.
    4. Выполните инъекции клеток CART19 в хвостовую вену (как описано выше), введя 100 мкл ресуспендированных клеток внутривенно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем 100 мкл позволит ввести 4 × 106 клеток каждой мыши. Включите группу необработанных мышей в качестве отрицательного контроля.

5. Оценка клеточно-ассоциированной токсичности CART19

  1. После введения клеток CART19 наблюдайте за мышами 2 раза в день, чтобы оценить любые изменения в их самочувствии, такие как двигательная слабость, сгорбленное тело и потеря массы тела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти физические изменения коррелируют с симптомами CRS в этой модели28.
  2. Как только у мышей начинает развиваться двигательная слабость и снижение массы тела (снижение на 10-20% от исходного уровня), проводят забор периферической крови для анализа опухолевой нагрузки и выделения сыворотки крови на цитокины в соответствии с методикой, описанной в разделе 3 (рис. 3).
  3. Хранят пробирки с микроцентрифугами сыворотки при температуре −80 °C и используют сыворотки для анализа хемокинов и цитокинов с помощью мультиплексного анализа (рис. 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если мыши проявляют признаки паралича задних конечностей, выглядят умирающими или вялыми, а потеря веса составляет > 20% от их массы тела до точки, которая ограничивает их способность дотягиваться до пищи и/или воды, то они будут подвергнуты эвтаназии.

6. Магнитно-резонансная томография

ПРИМЕЧАНИЕ: Для магнитного резонанса in vivo и получения изображений использовался доклинический (для мелких животных) МРТ-сканер с магнитом с вертикальным отверстием32,33.

  1. Смешать 120 мкл гадолиния + 880 мкл физиологического раствора и загрузить в инсулиновый шприц объемом 1 мл. Введите 100 мкл в каждую мышь (внутримышь).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гадолиний следует вводить за 15-20 мин до начала эксперимента.
  2. Обезболивайте мышь изофлураном (2-3%) в индукционной камере в течение 10-15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется применять офтальмологическую мазь для предотвращения сухости глаз.
  3. Поместите позвоночник мыши на щуп подставки, совместимый с грызунами. Затем расположите мышь, зацепив ее зубами за прикусную планку.
  4. Втяните головку мыши в катушку объемом 25 мм и отрегулируйте носовой конус, привязанный к системе анестезии изофлураном. Затяните ручку прикусной планки, чтобы сохранить положение на протяжении всего сканирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении МРТ с контрастным усилением убедитесь, что гадолиний (в данном случае) или контрастное вещество введены не менее чем за 10 минут до помещения аппарата в магнит. На протяжении всего времени визуализации мышей будут обезболивать, вдыхая 2-3% изофлурана в воздух через носовой конус, и одновременно контролировать частоту дыхания.
  5. Для оценки дыхания используйте устройство для мониторинга дыхания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно также оценить температуру тела, чтобы предотвратить возможное переохлаждение из-за длительного воздействия анестезии. Рекомендуется использовать грелки для контроля температуры тела.
    1. Прикрепите зонд дыхательного монитора близко к диафрагме и закрепите его хирургической лентой. Поддерживайте частоту дыхания в пределах 20-60 вдохов в минуту, чтобы состояние мыши было стабильным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта частота обеспечивает более стабильные МРТ-изображения и предотвращает артефакты движения на полученном изображении. Если частота дыхания превышает диапазон 20-60 вдохов в минуту, увеличьте концентрацию изофлурана. Если частота дыхания меньше 20 вдохов в минуту, анестезия слишком глубокая; Поэтому концентрацию нужно уменьшить.
  6. Вставьте зонд животного в маленькое отверстие в системе МРТ для мелких животных с вертикальным отверстием. Отрегулируйте голову животного в центре катушки. Закрепите устройство фиксатором, чтобы оно могло стоять вертикально, и подключите прибор к компьютеру.
  7. Откройте и используйте программное обеспечение (например, Paravision) для настройки позиций сканирования и типов сканирования. Определить оптимальные осевые и сагиттальные положения, сохраняя их одинаковыми для всех экспериментальных групп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пробное сканирование в качестве эталона перед фактическим полноразмерным МРТ-сканированием.
  8. Приступайте к сбору данных МРТ (как описано ранее 32,34,35,36). Получите Т1-взвешенные и Т2-взвешенные МРТ-изображения, используя предложенную ниже настройку.
    1. Для Т1-взвешенных МРТ-изображений используйте Т1-взвешенную мультиспиральную мультиэхо-последовательность (MSME) с временем повторения (TR) 300 мс, временем эхо-сигнала (TE) 9,5 мс, полем зрения (FOV) 4 см x 2 см x 2 см и матрицей 192 x 96 x 96.
    2. Для Т2-взвешенных МРТ-изображений использовали последовательность Multislice Multiecho (MSME) с TR 300 мс, TE 9,5 мс, FOV 4 см x 2 см x 2 см и матрицей 192 x 96 x 96.
  9. После завершения сканирования извлеките зонд из отверстия. Аккуратно извлеките мышь, сняв зубцы с прикусной планки. Наблюдайте за животным в отдельной клетке до тех пор, пока оно не придет в сознание и не восстановит адекватную двигательную функцию.
  10. После извлечения данных из программного обеспечения используйте аналитическое программное обеспечение для количественной оценки и объемного 3D-рендеринга (рис. 4) областей гиперинтенсивности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если это возможно, настоятельно рекомендуется иметь двух отдельных слепых наблюдателей для анализа данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Целью данного протокола является оценка токсичности, ассоциированной с клетками CART, с использованием модели мышей PDX из опухолевых клеток пациентов с ОЛЛ (рис. 1). Во-первых, мышам NSG вводили внутривенно бусульфан (30 мг/кг) с целью иммуносупрессии и облегчения приживления клеток CART28. На следующий день они получили ~5 × 106 PBMC (в/в), полученных от ВСЕХ пациентов. За приживлением мышей наблюдали в течение ~13 недель с помощью анализа на хвостовое кровотечение. Эритроциты собирали и лизировали с последующей подготовкой к проточной цитометрии для оценки экспрессии CD19+ опухолевых клеток (рис. 2).

После того, как мыши достигли ≥10 опухолевых клеток/мкл, их рандомизировали и подготовили к получению 4 × 106 клеток CART19 (внутривенно). Для оценки токсичности, связанной с CART19, мышей взвешивали один раз в день (рис. 3A). В качестве симптома появления СВК была выбрана потеря веса, так как ранее было выявлено, что она связана с CART-ассоциированной токсичностью28,37. Анализы периферической крови (путем забора подчелюстной крови) проводили для оценки опухолевой нагрузки и экспансии клеток CART путем анализа проточной цитометрии CD19+ опухолевых клеток человека и CD3+ Т-клеток человека. Кроме того, был собран сывороточный анализ, проведена оценка воспалительных цитокинов. Анализы проводили за день до инфузии клеток CART19, а также через 5 и 10 дней после инфузии клеток CART19, поскольку эти временные точки особенно важны для начала СВК и развития симптомов.

Здесь, в частности, до и после введения клеток CART19 был проведен мультиплексный анализ, где наиболее репрезентативными цитокинами и хемокинами были GM-CSF, IL-18, MIP-1α и IP-10 (рис. 3B). Однако для оценки концентрации этих белков в сыворотке крови могут быть проведены и другие анализы. В качестве альтернативы мышей подвергали МРТ-сканированию для оценки проницаемости сосудов в центральной нервной системе (ЦНС). Мышам вводили контрастный реагент гадолиний (в/в) для измерения воспаления мозга и нарушения гематоэнцефалического барьера38. Затем они были обезболены изофлураном, и были сделаны контрастные Т1-взвешенные и Т2-взвешенные изображения (рис. 4). На изображениях Т2 (рис. 4, слева) более светлый участок (белый) указывает на наличие отека или жидкости, которые в основном наблюдаются при опухолях головного мозга и воспалении. На изображениях Т1 (рис. 4, посередине) более яркие участки указывают на области, где наблюдается утечка крови или нарушение гематоэнцефалического барьера. Наконец, с помощью программного обеспечения были собраны изображения 3D-реконструкции (рис. 4, справа) с использованием улучшенных гадолинием изображений Т1 на основе гиперинтенсивных сигналов, соответствующих проницаемости сосудов, которые отображают объем утечки гадолиния в мозге34.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальная схема модели ксенотрансплантата, полученной от пациента, используемая для оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, синдрома высвобождения цитокинов и нейровоспаления. Мышей NSG кондиционировали бусульфаном в дозе 30 мг/кг (в/в) и получали 3 × 10 6-5 × 106 бластов (в/в), полученных из периферической крови пациентов с ОЛЛ. Затем мышей наблюдали за приживлением опухоли путем забора подчелюстной крови с последующей проточной цитометрией для оценки бластов CD19+. Когда CD19+ клетки периферической крови составляли ≥10 клеток/мкл, мыши получали 2 × 10 6-5 × 106 клеток CART19. Мышей ежедневно взвешивали в качестве меры их самочувствия. Через 10 дней после инфузии клеток CART19 была проведена МРТ головного мозга мышей для выявления нейровоспаления. Хвостовое кровотечение для оценки продукции цитокинов/хемокинов и экспансии Т-клеток проводили еженедельно после инъекции клеток CART19. Сокращения: CART = химерный антигенный рецептор Т-клетка; CART19 = CD19-таргетированная CART; ОЛЛ = острый лимфобластный лейкоз; в/в = внутривенно; и.. = внутрибрюшинный; PB = периферическая кровь; NSG = NOD-SCID IL2rγnull. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ CD19+ опухолевых клеток в качестве индикатора опухолевой нагрузки в модели ALL PDX для оценки токсичности, ассоциированной с CART-клетками. (A) Репрезентативный проточный цитометрический анализ, демонстрирующий стратегию стробирования для анализа популяции клеток CD19+ , взятой из образца периферической крови мыши, которой вводили ОЛЛ-бласты, полученные от пациента. (B) Количественная оценка и сравнение популяций клеток CD19+ между мышами, получавшими CART19, и необработанными мышами на основе необработанных данных, полученных в результате анализа проточной цитометрии. (односторонняя ANOVA; n = 3 мыши в группе; полосы погрешности, SEM). Сокращения: ns = не значимый; ОЛЛ = острый лимфобластный лейкоз; PDX = ксенотрансплантат, полученный от пациента; CART = химерный антигенный рецептор Т-клетка; CART19 = CD19-таргетированная CART; SSC-H = высота пика бокового рассеяния; FSC-H = высота пика прямого рассеяния; SSC-A = площадь бокового пика рассеяния; FSC-A = область прямого рассеяния пика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Оценка токсичности, ассоциированной с CART19, с использованием модели ALL PDX. (A) Репрезентативный график процентного снижения массы тела у мышей, получавших клетки CART19 или контрольные нетрансдуцированные Т-клетки в течение первых 6 дней после CART (двусторонний ANOVA, ***p < 0,001, ****p < 0,00001; полосы ошибок, SEM). (B) Экспрессия цитокинов и хемокинов в сыворотке крови мышей NSG до и после введения клеток CART19. Мышей NSG подвергали подчелюстному кровотечению до и после введения клеток CART19 (внутривенно) для сбора сыворотки и оценки экспрессии следующих цитокинов и хемокинов: GM-CSF, IL-18, MIP-1α, IP-10, IL-1β и IL-6 (двусторонняя ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001; n = 3 мыши; девять технических репликатов; полосы ошибок, СЭМ). Сокращения: ns = не значимый; ОЛЛ = острый лимфобластный лейкоз; PDX = ксенотрансплантат, полученный от пациента; CART = химерный антигенный рецептор Т-клетка; CART19 = CD19-таргетированная CART; NSG = NOD-SCID IL2rγnull; GM-CSF = гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; IL-18 = интерлейкин-18; MIP-1α = макрофагальный воспалительный белок-1 альфа; IP-10 = интерферон-гамма-индуцированный белок 10; ИЛ-1β = интерлейкин-1β; IL-6 = интерлейкин-6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Магнитно-резонансная томография, используемая для оценки нейровоспаления во время лечения клетками CART19 в модели PDX. Мышам NSG, имплантированным опухолевыми клетками, полученными от пациентов с ALL, вводили клетки CART19, а мозг визуализировали с помощью МРТ с усилением гадолинием после того, как у мышей проявились неврологические симптомы в течение 10 дней после инфузии CART. (Слева) Т2-взвешенное изображение, демонстрирующее признаки отека и возможного воспалительного инфильтрата во время NI у мышей, получавших CART19 (красная стрелка). (Средний) Репрезентативный аксиальный срез Т1-взвешенной МРТ, показывающий контрастное усиление в паренхиме головного мозга, что указывает на повышенную проницаемость сосудов у мышей, получавших CART19 (красная стрелка). (Справа) Трехмерные реконструкции мозга грызунов с областями Т1-гиперинтенсивности (красный цвет) были сгенерированы с помощью программного обеспечения Analyze 12.0. Сокращения: МРТ = магнитно-резонансная томография; ОЛЛ = острый лимфобластный лейкоз; PDX = ксенотрансплантат, полученный от пациента; CART = химерный антигенный рецептор Т-клетка; CART19 = CD19-таргетированная CART. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Человеческий Мышь
Цитокин/Хемокин Миелоидные цитокины человека (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1) Миелоидные цитокины человека (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1)
Время до CRS (день) 2-5 4-6
Время до NI (день) 5-7 6-8
Статус BBB Срыв BBB Срыв BBB
Тканевые резидентные макрофаги Активация микроглии Активация микроглии
Ячейка CART в ЦНС Инфильтрация головного мозга Инфильтрация головного мозга

Таблица 1: Рекапитуляция клинически наблюдаемой токсичности, связанной с клетками CART, с помощью модели ALL PDX. Сокращения: GM-CSF = гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; ИЛ = интерлейкин; CRS = синдром высвобождения цитокинов; NI = нейровоспаление; ГЭБ = гематоэнцефалический барьер; ЦНС = центральная нервная система; MCP-1 = моноцитарный хемоаттрактантный белок 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В настоящем отчете описана методология оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, с использованием модели ALL PDX. В частности, эта модель стремится имитировать две опасные для жизни токсичности, CRS и NI, которые пациенты часто испытывают после инфузии клеток CART. Он повторяет многие признаки токсичности CART, наблюдаемые в клинике: потеря веса, двигательная дисфункция, нейровоспаление, воспалительная продукция цитокинов и хемокинов, а также инфильтрация различных эффекторных клеток в центральную нервную систему 8,20,28. Ранее эта модель PDX использовалась для имитации первоначального развития CRS и NI (табл. 1) и оценки различных стратегий профилактики и лечения токсичности. В одном исследовании этой модели PDX использовались клетки CART19, обедненные GM-CSF. В частности, эти результаты продемонстрировали, что истощение GM-CSF приводит к снижению секреции CRS-сцепленных цитокинов и хемокинов, что было ясно продемонстрировано на этой мышиной модели ALL PDX29. Эта модель PDX также была успешно использована для оценки экспансии клеток CART in vivo, коррелирующих с развитием CRS после инфузии клеток CART19 с использованием симпортера йодида натрия (NIS) в качестве платформы визуализации26. Таким образом, предлагаемая модель представляет собой полезный инструмент, который может быть использован для оценки потенциальной токсичности, возникающей от клеток CART.

Важно отметить, что для изучения клеток CART in vivo было использовано множество других моделей. К ним относятся синггенные, трансгенные и гуманизированные модели мышей, а также ксеногенные модели24. Сингенная мышиная модель, также называемая иммунокомпетентной моделью аллотрансплантата мыши, использует клетки CART, опухолевые и целевые антигены, которые имеют мышиное происхождение. Это выгодно, так как позволяет исследовать клетки CART в полностью функциональной иммунной системе, а также может выявить целевую, внеопухолевую токсичность. Недостатком этой модели является то, что биология и иммунитет мышей отличаются от таковых у человека, и, следовательно, она не является подходящей моделью для трансляционных исследований, целью которых является переход к клиническим испытаниям24,39.

Иммунокомпетентные трансгенные мышиные модели экспрессируют трансген человеческого опухоль-ассоциированного антигена (TAA) как на здоровых тканях, так и на опухолях в паттернах, имитирующих те, которые обнаруживаются в тканях человека. Эти мыши также использовались в исследованиях CART для лучшей оценки безопасности клеток CART путем выявления целевых внеопухолевых эффектов40,41. Гуманизированные мыши, имплантированные CD34+ гемопоэтические стволовые клетки человека, могут быть полезной моделью для изучения эффективности и токсичности CART в кроветворной системе человека, поскольку восстановленная иммунная система может имитировать ингибирование CART и индуцировать цитокиновый шторм, который повторяет CRS, наблюдаемый в клинике42,43,44. Несмотря на то, что эти модели позволяют изучать специфические иммунные клетки в связи с эффективностью CART, гуманизированная система все еще примитивна и нуждается в дальнейшей оптимизации. Кроме того, их использование при изучении нецелевых эффектов ограничено, поскольку большинство антигенов хозяина на здоровых тканях имеют мышиное происхождение. Кроме того, гуманизированная модель CD34+ мышей технически сложнав разработке 45. Тем не менее, модели ксенотрансплантатов человека у мышей с ослабленным иммунитетом обычно используются для оценки эффективности клеток CART человека перед переводом в клинические испытания, и, как показано в этой статье, они могут быть использованы для оценки токсичности, связанной с активностью клеток CART. Однако отсутствие иммунной системы и иммунных клеток, таких как Т-клетки и NK-клетки, ограничивает их применение для оценки внеопухолевой токсичности на мишени, взаимодействия клеток CART с клетками врожденного иммунитета и ингибирования клеток CART микроокружением опухоли.

Преимущество описанного здесь протокола заключается в том, что он требует простых процедур с использованием мышей NSG для наблюдения и оценки токсичности, связанной с клетками CART. Во-первых, его легко воспроизвести, и он был оптимизирован для оценки стратегий предотвращения токсичности CART путем нейтрализации GM-CSF и визуализации экспансии клеток CART в корреляции с началом CRS. При использовании этой новой модели PDX важно правильно выполнить критические шаги, такие как подтверждение правильного приживления ОЛЛ бластов и ранний мониторинг начала CRS сразу после введения CART. Оценка цитокинов и мониторинг веса имеют решающее значение для определения токсичности, связанной с CART, а МРТ определяет начало NI. Недостатки этой модели заключаются в следующем: 1) поскольку клеткам PDX ALL требуется больше времени для приживления и достижения высокой опухолевой нагрузки, требуется примерно 2-3 месяца от инокуляции опухолевых клеток до лечения клетками CART19; 2) в качестве первичной модели PDX наблюдается значительная вариабельность от пациента к пациенту в отношении времени приживления и ответа на клеточную терапию CART; 3) опухолевую нагрузку невозможно оценить с помощью биолюминесцентной визуализации и требуется частое исследование периферической крови; и 4) отсутствие врожденных иммунных клеток ограничивает возможности этой модели по изучению взаимодействий CART с иммунными клетками или микроокружением опухоли.

Интерес к тестированию адоптивных клеток на более сложных мышиных моделях вырос за последнее десятилетие, поскольку стало очевидно, что простые модели мышей с иммунодефицитом не являются идеальными доклиническими моделями. Описанная здесь мышиная модель PDX для оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART, представляет собой многообещающую доклиническую модель в области клеточной терапии CART, поскольку она имитирует временную шкалу, симптомы и маркеры CRS и NI после инфузии клеток CART, как это видно в клинике. В целом, описанная здесь методология обеспечивает надежную платформу для оценки токсичности, ассоциированной с клетками CART19, а также эффективности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

S.S.K. является изобретателем патентов в области CAR-иммунотерапии, которые лицензированы компаниями Novartis (по соглашению между клиникой Майо, Университетом Пенсильвании и Novartis) и Mettaforge (через клинику Майо). R.L.S. и S.S.K. являются изобретателями патентов в области CAR-иммунотерапии, которые лицензированы компанией Humanigen. S.S.K. получает финансирование на исследования от Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs и Lentigen.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (R37CA266344, 1K99CA273304), Министерством обороны (CA201127), Клиникой Мэйо K2R (S.S.K.), Центром индивидуализированной медицины клиники Майо (S.S.K.) и Фондом Преддолин (R.L.S.). Кроме того, мы хотели бы поблагодарить персонал основного центра ЯМР клиники Майо. Рисунок 1 был создан в BioRender.com

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Cancer Research. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

Исследование рака выпуск 192 CART-клетка CART-ассоциированная токсичность модель ксенотрансплантата пациента (PDX) терапия рака доклиническая модель in vivo

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

Оценка токсичности, ассоциированной с Т-клетками химерного антигенного рецептора, с использованием мышиной модели ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manriquez Roman, C., Sakemura, R.… More

Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter