Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הערכה של רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי T באמצעות מודל עכבר קסנוגרפט שמקורו בלוקמיה לימפובלסטית חריפה

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64535
Automatic Translation
1,2,3,4,5, 1,2, 1,2, 6, 6, 1,2, 1,2, 6, 1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

ERRATUM NOTICE

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול שבו מודל xenograft הנגזר מחולה לוקמיה לימפובלסטית חריפה משמש כאסטרטגיה להערכה וניטור רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי ממוקד CD19 תאי T.

Abstract

טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CART) התגלה ככלי רב עוצמה לטיפול בסוגים רבים של ממאירויות CD19+ , מה שהוביל לאישור ה- FDA לאחרונה למספר טיפולים בתאי CART ממוקדי CD19 (CART19). עם זאת, טיפול בתאי CART קשור לקבוצה ייחודית של רעילות הנושאות תחלואה ותמותה משלהן. זה כולל תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS) ודלקת עצבית (NI). השימוש במודלים פרה-קליניים של עכברים היה חיוני במחקר ובפיתוח של טכנולוגיית CART להערכת יעילות CART ורעילות CART. המודלים הפרה-קליניים הזמינים לבדיקת אימונותרפיה תאית מאמצת זו כוללים מודלים סינגניים, קסנוגרפט, טרנסגניים ואנושיים של עכברים. אין מודל אחד שמשקף בצורה חלקה את מערכת החיסון האנושית, ולכל מודל יש חוזקות וחולשות. מאמר שיטות זה נועד לתאר מודל xenograft נגזר המטופל באמצעות פיצוצים לוקמיים מחולים עם לוקמיה לימפובלסטית חריפה כאסטרטגיה להערכת רעילות הקשורה CART19, CRS ו- NI. מודל זה הוכח כמחזיר רעילות הקשורה ל- CART19, כמו גם יעילות טיפולית כפי שניתן לראות במרפאה.

Introduction

טיפול תאי בקולטן אנטיגן כימרי T (CART) חולל מהפכה בתחום האימונותרפיה לסרטן. הוא הוכח כמוצלח בטיפול בלוקמיה לימפובלסטית חריפה חוזרת / עקשנית (ALL), לימפומה של תאי B גדולים, לימפומה של תאי מעטפת, לימפומה פוליקולרית ומיאלומה נפוצה 1,2,3,4,5,6,7, מה שהוביל לאישורי FDA אחרונים. למרות ההצלחה הראשונית בניסויים קליניים, הטיפול בתאי CART גורם לרעילות שהיא לעתים קרובות חמורה ולעיתים קטלנית. הרעלים הנפוצים ביותר לאחר טיפול בתאי CART כוללים התפתחות של CRS ו- NI, המכונה גם תסמונת נוירוטוקסיות הקשורה לתאי השפעה חיסוניים (ICANS)8,9. CRS נגרמת עקב פעילות יתר והתרחבות מסיבית של תאי CART in vivo, מה שמוביל להפרשה לאחר מכן של ציטוקינים דלקתיים מרובים, כולל אינטרפרון-γ, גורם נמק גידול-α, גרנולוציטים-מקרופאגים גורם מגרה מושבה (GM-CSF), ואינטרלוקין-6 (IL-6). התוצאה היא לחץ דם נמוך, חום גבוה, תסמונת דליפת נימים, כשל נשימתי, כשל רב איברי, ובמקרים מסוימים, מוות10,11. CRS מתפתח ב 50-100% מהמקרים לאחר טיפול תאי CART1911,12,13. ICANS הוא אירוע שלילי ייחודי נוסף הקשור לטיפול בתאי CART ומאופיין בצקת מוחית כללית, בלבול, אובטונדציה, אפזיה, חולשה מוטורית, ולעיתים התקפים 9,14. כל דרגה של ICANS מתרחשת בעד 70% מהחולים, וכיתות 3-4 מדווחות ב 20-30% מהחולים 5,10,15,16. באופן כללי, CRS ו-ICANS נפוצים ועלולים להיות קטלניים.

ניהול ICANS לאחר טיפול בתאי CART הוא מאתגר. רוב החולים עם ICANS חווים גם CRS17, אשר לעתים קרובות ניתן לטפל עם אנטגוניסט קולטן IL-6 tocilizumab או סטרואידים18. דו"ח קודם גילה כי התערבות מוקדמת עם tocilizumab הפחיתה את שיעור CRS חמור אך לא השפיעה על ההיארעות או החומרה של ICANS19. נכון לעכשיו, אין טיפול יעיל או סוכן מניעתי עבור ICANS, וזה חיוני לחקור אסטרטגיות מניעה20.

תאים מיאלואידים וציטוקינים/כימוקינים הקשורים אליהם נחשבים למניעים העיקריים להתפתחות CRS ו-ICANS21. בעוד CRS קשור ישירות לגובה קיצוני של ציטוקינים והתפשטות תאי T, הפתופיזיולוגיה של ICANS אינה ידועה במידה רבה22,23. לכן, זה הכרחי להקים מודל עכבר כי reapitulates אלה רעילות לאחר טיפול בתאי CART כדי ללמוד את המנגנונים ולפתח אסטרטגיות מניעה.

ישנם מודלים פרה-קליניים רבים של בעלי חיים המשמשים כיום למחקר, אופטימיזציה ואימות היעילות של תאי CART, כמו גם לניטור הרעילות הקשורה אליהם. אלה כוללים עכברים סינגניים, קסנוגרפט, טרנסגניים בעלי יכולת חיסון, עכברים טרנסגניים אנושיים ועכברי קסנוגרפט שמקורם במטופל, בנוסף למודלים של פרימטים. עם זאת, לכל אחד מהמודלים הללו יש חסרונות, וחלקם אינם משקפים את היעילות האמיתית או חששות הבטיחות של תאי CART24,25. לכן, חובה לבחור בקפידה את המודל הטוב ביותר למטרות המיועדות של המחקר.

מאמר זה מבקש לתאר את המתודולוגיה המשמשת להערכת רעילות הקשורה לתאי CART, CRS ו-NI, באמצעות מודל של קסנוגרפט (PDX) in vivo (PDX) שמקורו במטופל (איור 1). באופן ספציפי, בשיטות המתוארות כאן, תאי CART19 שנוצרו במעבדה של המחברים משמשים בעקבות פרוטוקולים שתוארו לעיל. בקצרה, תאי T אנושיים מבודדים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים בריאים של תורמים (PBMCs) באמצעות טכניקת שיפוע צפיפות, מגורים עם חרוזי CD3 / CD28 ביום 0, ומומרים באופן לנטיוויראלי ביום הראשון עם CARs המורכבים ממקטע משתנה שרשרת יחיד ממוקד CD19 המאוחה לתחומי איתות 4-1BB ו- CD3ζ. תאי CART אלה מורחבים לאחר מכן, מנוטרלים מחרוזים ביום 6, ונשמרים בהקפאה ביום 8 26,27,28,29,30. כפי שתואר קודם לכן, עכברים נתונים לטיפול בלימפודל, ואחריו מתן פיצוצים לוקמיים שמקורם במטופל (ALL)28. ראשית, השתלת הגידול מאומתת באמצעות איסוף דם submandibular. לאחר קביעת נטל גידול מתאים, תאי CART19 ניתנים לעכברים. לאחר מכן, העכברים נשקלים מדי יום כדי להעריך את רווחתם. הדמיית תהודה מגנטית של בעלי חיים קטנים (MRI) מבוצעת כדי להעריך NI, יחד עם דימום זנב כדי להעריך את התרחבות תאי T וייצור ציטוקינים/כימוקינים. מומלץ מאוד להשתמש בטכניקות המתוארות להלן כמודל לחקר רעילות הקשורה לתאי CART במודל PDX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של מועצת הביקורת המוסדית של מאיו קליניק (IRB), הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC A00001767) והוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBC, Bios00000006.04).

הערה: כל החומרים המשמשים לעבודה עם עכברים חייבים להיות סטריליים.

1. הזרקת busulfan לעכברי NSG

  1. יש להשיג עכברים זכרים, בני 8-12 שבועות, מדוכאי חיסון, NOD-SCID IL2rγnull (NSG), ולשקול אותם לפני ההזרקה.
    הערה: לצורך מובהקות סטטיסטית, מומלץ להשתמש לפחות בחמישה עכברים בכל קבוצה ולחזור על ניסוי זה לפחות פעם נוספת עם נקבות עכברים.
  2. הכינו busulfan להזרקה intraperitoneal (i.p.). באמצעות מזרק אינסולין של 1 מ"ל, ממלאים את המזרק לאט ובזהירות בדיוק 30 מ"ג/ק"ג בוסולפן, ולאחר מכן הזרקת i.p לעכברים, ומחזירים אותם לכלוב.

2. הזרקת כל הפיצוצים שמקורם במטופל (CD19+) לעכברי NSG

הערה: פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות ועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של מאיו קליניק (IBC, Bios00000006.04).

  1. לאסוף פיצוצים לוקמיים ראשוניים מהדם ההיקפי של חולים עם ALL חוזר ועקשן.
  2. הכינו תאי מטרה להזרקה תוך ורידית (i.v.).
    1. ספירת תאי מטרה CD19+ באמצעות המוציטומטר, ורישום הנפח הסופי והריכוז של התאים.
      הערה: כדי לקבוע את כדאיות התא, מומלץ מאוד להשתמש בכחול טריפאן בעת ספירת התאים.
    2. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
    3. יש להשהות מחדש את כדורית התא במי מלח חוצצי פוספט (PBS) לריכוז סופי של 50 × 106 תאים/מ"ל בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ולהניח על קרח.
    4. מערבולת אצבע, צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל את תאי המטרה עד שהתאים הומוגניים לחלוטין.
    5. באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל, לאט ובזהירות למלא את המזרק עם בדיוק 100 μL של תאי המטרה מוכן, ו להעיף את המזרק כדי להסיר בועות.
      הערה: נפח של 100 μL ינהל 5 × 106 תאים לכל עכבר.
    6. הניחו את העכברים תחת אור חם למשך 5-10 דקות. ברגע שווריד הזנב הופך להיות מעורב וגלוי יותר לעין בלתי, הניחו את העכברים בתא כליאה/ריסון מתאים.
    7. נגב את זנב העכבר עם ספוגית אלכוהול. הזריקו את תאי המטרה ישירות לווריד הזנב (i.v.), והחזירו את העכבר לכלוב. לאחר חיסון תאי המטרה, יש לעקוב אחר העכברים מדי יום או לפי המלצת ועדת האתיקה המקומית לבעלי חיים.

3. הערכת השתלת הגידול

  1. החל מ -6 שבועות לאחר הזרקת תאי המטרה, להעריך את קליטת הגידול באמצעות ציטומטריית זרימה כדי למדוד את הביטוי של תאי CD19+ בדם ההיקפי.
  2. בדיקת דם היקפית להערכת התרחבות CD19+
    1. להוציא דם מהעכברים 6-8 שבועות לאחר הזרקת תאי CART19.
      הערה: ניתן להשתמש במספר שיטות כדי למשוך דם. עבור פרוטוקול זה, איסוף דם submandibular היא השיטה המועדפת של בחירה.
    2. להרדים את העכבר עם isoflurane בתא אינדוקציה עם 5% isoflurane. לאחר השגת הרדמה, לשמור על 1-3% isoflurane בשאיפה דרך חרוט האף.
      הערה: מומלץ מאוד למרוח משחה אופתלמית למניעת יובש בעיניים.
    3. הסר את העכבר מהחדר, והחזק את העכבר ביד הלא דומיננטית על ידי אחיזת העור הרפוי מעל הצוואר. לנקב את הווריד עם שרוך מעט מאחורי הלסת התחתונה.
      הערה: רק קצה המחט (1-2 מ"מ) נדרש כדי להיכנס לווריד.
    4. כאשר הדם מטפטף, לאסוף לפחות 50 μL בצינור מצופה הפרין, ולערבב היטב על ידי היפוך הצינור למעלה ולמטה מספר פעמים. מעבירים 30 מיקרוליטר דם לתוך צינור פוליסטירן תחתון עגול של 5 מ"ל.
      הערה: עבור הדם הנותר, סובב את הצינור ב 17,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים את הסרום (שכבת סופרנטנט) לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי ומסומן בנפח 1.5 מ"ל, ומאחסנים אותו בטמפרטורה של -80°C (לשימוש בבדיקת הציטוקינים).
    5. הוסף 2 מ"ל של חיץ ליזיס (10x חיץ ליסינג מבוסס אמוניום כלוריד מדולל ל 1x באמצעות מים נטולי נוקלאז) לתוך צינור תחתון עגול 5 מ"ל המכיל את הדם. מערבבים היטב על ידי מערבול הצינור. לדגור על הצינור בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות כדי להבטיח ליזה תקינה של תאי הדם האדומים.
    6. הוסף 2 מ"ל של חיץ זרימה (PBS, 0.2 גרם / ליטר של אשלגן כלורי, 0.2 גרם / ליטר של אשלגן פוספט monobasic, 8 גרם / ליטר של נתרן כלורי, ו 1.15 גרם / ליטר של נתרן פוספט dibasic המכיל 2% סרום בקר עוברי ו 1% נתרן azide).
    7. צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. דקרו את הסופרנטנט, והוסיפו 2 מ"ל של חיץ זרימה. חזור על שלב כביסה זה 2x.
    8. בזהירות decant את התוכן של הצינור. שימו לב לכמות הקטנה של נוזל עם גלולה שנותרה בצינור. הוסף 100 μL של חיץ זרימה, והשהה מחדש היטב.
    9. מעבירים את כל הנוזל הנותר בצינור הזרימה של 5 מ"ל לצלחת של 96 בארות. ודא שכל דגימה מסומנת כראוי. הוסף 100 μL של חיץ זרימה לבארות המתאימות וצנטריפוגה את צלחת 96 בארות ב 650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  3. הערך את ההתרחבות של תאי המטרה CD19+ על-ידי ציטומטריית זרימה (איור 2).
    1. הכינו תערובת אב המכילה 0.3 מיקרוליטר של כתם חי/מת, 0.13 מיקרוגרם (2.5 מיקרוליטר) של נוגדן CD19 אנטי-אנושי, 0.06 מיקרוגרם (2.5 מיקרוליטר) של נוגדן CD45 אנטי-אנושי, 5 מיקרוגרם (2.5 מיקרוליטר) של CD45 נגד עכברים, ו-42.2 מיקרוליטר של חיץ זרימה בסך הכל 50 מיקרוליטר לדגימה. דוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. יש לשטוף עם 150 μL של חיץ זרימה ואחריו צנטריפוגה ב 650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. דקרו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-195 מיקרוליטר של חיץ זרימה ו-5 מיקרוליטר של ספירת חרוזים.
    3. רכישה על ציטומטר זרימה כדי לקבוע את רמת ביטוי התא CD19+ . למטרות gating וניתוח, תחילה שער אוכלוסיית העניין (CD19+) בהתבסס על מאפייני פיזור קדימה לעומת צד, לאחר מכן אוכלוסיית gating יחידה, ולאחר מכן תאים חיים. לאחר שהתאים החיים מגולים, העריכו את אוכלוסיית CD45 האנושית לעומת אוכלוסיית CD45 בעכבר, ומהאוכלוסייה האנושית, שער אוכלוסיית היעד CD19+ .
  4. כמת כדי לקבוע את הכמות הקיימת ב- 70 μL, ולאחר מכן בטא בתאים/μL באמצעות משוואה (1):
    ספירת תאים מוחלטת CD19+ = ([תאי CD19+/ספירת חרוזים] × מספר חרוזי ספירה בטווח של 5 מיקרוליטר)/70
    הערה: חזור על בדיקת הדם ההיקפית כל 5 ימים כדי להעריך את התרחבות תאי CD19+ . יש לאסוף לא יותר מ-200 מיקרוליטר דם במצטבר כל שבועיים, בהתאם להנחיות ועדת האתיקה המקומית של בעלי חיים. לאחר שהעכברים הגיעו לנטל מחלה של ≥10 תאים/μL, יש לבצע אקראיזציה לתאי CART19 או לקבוצות ביקורת (סעיף 4).

4. ניהול תאי CART19 in vivo

  1. הכנת תאי CART19 (~ יום 80):
    הערה: הדור של תאי CART19 פורסם בעבר 27,30,31. הליך זה חייב להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית רמה 2+ באמצעות טכניקה אספטית וציוד מגן אישי.
    1. הפשירו את תאי CART19 במיכל אמבט מים (37°C). לאחר מכן, שטפו את התאים בתווך תאי T חמים (TCM) כדי להסיר את הדימתיל סולפוקסיד.
      הערה: TCM עשוי מ-10% סרום AB אנושי (v/v), 1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (v/v), ותא המטופויטי ללא סרום בינוני27,30.
    2. צנטריפוגה את תאי CART19 ב 300 × גרם במשך 8 דקות ב 4 ° C, ו resuspend ב TCM חם לריכוז סופי של 2 × 106 תאים / מ"ל. אפשרו לתאי ה-CART לנוח באינקובטור (37°C, 5% CO2) למשך הלילה, אך למשך 16 שעות לכל היותר.
  2. מתן תאי CART19 באמצעות הזרקת i.v. (יום ~ 80)
    1. ספרו את תאי CART19 וסובבו מטה ב-300 × גרם במשך 8 דקות ב-4°C.
    2. השהה מחדש את תאי CART19 עם 10 מ"ל של PBS, וסחרור כלפי מטה ב- 300 × גרם למשך 8 דקות ב- 4 ° C.
    3. השהה מחדש את תאי CART19 לריכוז סופי של 40 × 106 תאים/מ"ל עם PBS, העבר את התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל, והנח אותם על קרח.
    4. בצע הזרקות וריד זנב תא CART19 (כמפורט לעיל) על ידי הזרקת 100 μL של תאים מרחפים i.v.
      הערה: נפח של 100 μL ינהל 4 × 106 תאים לכל עכבר. כלול קבוצה של עכברים לא מטופלים כביקורת שלילית.

5. הערכה של רעילות הקשורה לתאי CART19

  1. לאחר מתן תאי CART19, עקוב אחר העכברים פעמיים ביום כדי להעריך כל שינוי ברווחתם, כגון חולשה מוטורית, גוף כפוף ואובדן משקל גוף.
    הערה: כל השינויים הפיזיים האלה מתואמים עם תסמיני CRS במודלזה 28.
  2. ברגע שהעכברים מתחילים לפתח חולשה מוטורית וירידה במשקל (ירידה של 10-20% מקו הבסיס), אספו דם היקפי כדי לנתח את נטל הגידול ולבצע בידוד בסרום עבור ציטוקינים בהתאם למתודולוגיה המתוארת בסעיף 3 (איור 3).
  3. אחסנו את צינורות המיקרוצנטריפוגות בסרום בטמפרטורה של -80°C, והשתמשו בסרה כדי לנתח את הכימוקינים והציטוקינים באמצעות בדיקת מולטיפלקס (איור 4).
    הערה: אם העכברים מראים סימנים של שיתוק בגפיים האחוריות, נראים מתים או רדומים, והירידה במשקל היא > 20% ממשקל גופם עד לנקודה המגבילה את יכולתם להגיע למזון ו / או מים, אז הם יהיו נתונים להמתת חסד.

6. הדמיית MRI

הערה: סורק MRI פרה-קליני (לבעלי חיים קטנים) עם מגנט נשא אנכי שימש לתהודה מגנטית in vivo ורכישת תמונה32,33.

  1. מערבבים 120 μL של גדוליניום + 880 μL של תמיסת מלח, וטוענים לתוך מזרק אינסולין 1 מ"ל. הזריקו 100 μL לכל עכבר (כלומר).
    הערה: יש להזריק גדוליניום 15-20 דקות לפני תחילת הניסוי.
  2. מרדימים את העכבר באמצעות איזופלורן (2-3%) בתא אינדוקציה למשך 10-15 דקות.
    הערה: מומלץ מאוד למרוח משחה אופתלמית למניעת יובש בעיניים.
  3. הניחו את עמוד השדרה של העכבר על גשושית העריסה התואמת למכרסמים. לאחר מכן, המשך למקם את העכבר על ידי חיבור שיניו על מוט הנשיכה.
  4. משוך את ראש העכבר לתוך סליל נפח 25 מ"מ, ולהתאים את חרוט האף קשור למערכת הרדמה isoflurane. הדקו את הידית של מוט הנשיכה כדי לשמור על המיקום למשך הסריקה.
    הערה: בעת ביצוע סריקת MRI משופרת ניגודיות, ודא כי גדוליניום (במקרה זה) או חומר הניגוד מוזרק לפחות 10 דקות לפני הכנסת המכשיר לתוך מגנט משעמם. במהלך ההדמיה, העכברים יהיו מורדמים על ידי שאיפת 2-3% איזופלורן באוויר דרך חרוט האף, וקצב הנשימה שלהם ינוטר בו זמנית.
  5. להערכת נשימה, יש להשתמש במכשיר ניטור נשימה/נשימה.
    הערה: חשוב להעריך גם את טמפרטורת הגוף על מנת למנוע היפותרמיה אפשרית עקב חשיפה ממושכת להרדמה. מומלץ להשתמש כריות חום כדי לשלוט על טמפרטורת הגוף.
    1. חבר את בדיקת מוניטור הנשימה קרוב לסרעפת, וחבר אותה באמצעות סרט כירורגי. שמור על קצב הנשימה בין 20-60 נשימות לדקה, כך שמצבו של העכבר יציב.
      הערה: קצב זה מספק תמונות MRI יציבות יותר ומונע תנועה של לכלוכים בתמונה שנרכשה. אם קצב הנשימה גבוה מטווח 20-60 נשימות לדקה, יש להגדיל את ריכוז האיזופלורן. אם קצב הנשימה הוא פחות מ -20 נשימות לדקה, ההרדמה עמוקה מדי; לכן, צריך להקטין את הריכוז.
  6. הכנס את הבדיקה של בעל החיים לתוך הבור הקטן בתוך מערכת MRI של בעלי חיים קטנים אנכיים. כוונן את ראש החיה במרכז הסליל. אבטחו את המכשיר באמצעות המנעול כך שיוכל לעמוד זקוף, וחברו את המכשיר למחשב.
  7. פתח את התוכנה (לדוגמה, Paravision) והשתמש בה כדי להגדיר את מיקומי הסריקה וסוגי הסריקות. לקבוע את המיקומים הצירית והקשת האופטימליים תוך שמירה על עקביות עבור כל קבוצות הניסוי.
    הערה: מומלץ להשתמש ברכישת סריקת ניסיון כהפניה לפני סריקות MRI באורך מלא בפועל.
  8. המשך באיסוף נתוני MRI (כמתואר לעיל32,34,35,36). קבל הן תמונות MRI משוקללות T1 והן תמונות MRI משוקללות T2 באמצעות ההגדרה המוצעת המוזכרת להלן.
    1. לתמונות MRI משוקללות T1, השתמש ברצף Multislice multiecho משוקלל T1 (MSME) עם זמן חזרה (TR) של 300 אלפיות השנייה, זמן הד (TE) של 9.5 אלפיות השנייה, שדה ראייה (FOV) של 4 ס"מ x 2 ס"מ x 2 ס"מ ומטריצה של 192 x 96 x 96.
    2. לתמונות MRI משוקללות T2, השתמש ברצף Multislice Multiecho (MSME) עם TR של 300 אלפיות השנייה, TE של 9.5 אלפיות השנייה, FOV של 4 ס"מ x 2 ס"מ x 2 ס"מ ומטריצה של 192 x 96 x 96.
  9. לאחר השלמת הסריקות, הסר את הבדיקה מהשעמום. חלץ בעדינות את העכבר על ידי הסרת השיניים ממוט העקיצה. יש להשגיח על בעל החיים בכלוב נפרד עד שהוא בהכרה מלאה וחוזר לתפקוד מוטורי הולם.
  10. לאחר חילוץ הנתונים מהתוכנה, השתמשו בתוכנת ניתוח לכימות ועיבוד נפח תלת-ממדי (איור 4) של אזורי ההיפר-אינטנסיביות.
    הערה: במידת האפשר, מומלץ מאוד שיהיו שני משקיפים עיוורים נפרדים לניתוח הנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך רעילות הקשורה לתאי CART באמצעות מודל עכברי PDX מתאי גידול של חולים עם ALL (איור 1). ראשית, עכברי NSG קיבלו זריקות i.p. של busulfan (30 מ"ג / ק"ג) במטרה לדכא אותם חיסונית ולהקל על קליטת תאי CART28. למחרת, הם קיבלו ~ 5 × 106 PBMCs (i.v.) שמקורם בכל החולים. העכברים היו במעקב לקליטה במשך ~13 שבועות באמצעות בדיקת דימום הזנב. תאי דם אדומים נאספו ועברו ליזה, ולאחר מכן הכנת ציטומטריית זרימה כדי להעריך את הביטוי של תאי גידול CD19+ (איור 2).

ברגע שהעכברים הגיעו ל-≥10 תאי גידול/μL, הם חולקו באופן אקראי והיו מוכנים לקבל 4 × 106 תאי CART19 (i.v). כדי להעריך רעילות הקשורה ל-CART19, העכברים נשקלו פעם ביום (איור 3A). ירידה במשקל נבחרה כסימפטום של הופעת CRS, כפי שהתגלה בעבר להיות קשור רעילות הקשורים לתאי CART28,37. בדיקות דם היקפיות (באמצעות איסוף דם submandibular) בוצעו כדי להעריך את נטל הגידול ואת הרחבת תאי CART על ידי ניתוח ציטומטריה זרימה של תאי גידול אנושיים CD19+ ותאי T CD3+ אנושיים. בנוסף, נאסף סרום, ובוצעה הערכה של ציטוקינים דלקתיים. הבדיקות נעשו יום אחד לפני עירוי תאי CART19 וכן 5 ו -10 ימים לאחר עירוי תאי CART19, מכיוון שנקודות זמן אלה רלוונטיות במיוחד להופעת CRS ולהתפתחות תסמינים.

כאן, במיוחד, בוצעה בדיקת מולטיפלקס לפני ואחרי מתן תאי CART19, כאשר הציטוקינים והכימוקינים המייצגים ביותר היו GM-CSF, IL-18, MIP-1α ו-IP-10 (איור 3B). עם זאת, בדיקות אחרות ניתן לעשות כדי להעריך את הריכוזים של חלבונים אלה בסרום. לחלופין, עכברים עברו סריקת MRI כדי להעריך את חדירות כלי הדם במערכת העצבים המרכזית (CNS). עכברים הוזרקו עם מגיב ניגוד גדוליניום (i.p.) כדי למדוד דלקת במוח ושיבוש מחסום דם-מוח38. לאחר מכן, הם הורדמו באמצעות איזופלורן, וצולמו תמונות משוקללות T1 ו-T2 משופרות בניגודיות (איור 4). בתמונות T2 (איור 4, משמאל), החלק הבהיר יותר (לבן) מצביע על נוכחות של בצקת או נוזל, אשר נראים בעיקר בגידולים במוח ובדלקת. בתמונות T1 (איור 4, באמצע), האזורים הבהירים יותר מצביעים על אזורים שבהם יש דליפת דם או הפרעה במחסום הדם-מוח. לבסוף, בעזרת תוכנה, תמונות השחזור התלת-ממדיות (איור 4, מימין) הורכבו באמצעות תמונות T1 משופרות גדוליניום המבוססות על אותות בעוצמה גבוהה המתאימים לחדירות כלי הדם, מה שהופך את נפח דליפת גדוליניום במוחל-34.

Figure 1
איור 1: סכמה ניסיונית של מודל xenograft שמקורו במטופל המשמש להערכת רעילות הקשורה לתאי CART, תסמונת שחרור ציטוקינים ודלקת עצבית. עכברי NSG היו מותנים עם 30 מ"ג / ק"ג busulfan (i.p.) וקיבלו 3 × 10 6-5 × 106 פיצוצים (i.v.) שמקורם בדם ההיקפי של חולים עם ALL. לאחר מכן, העכברים היו במעקב אחר קליטת הגידול באמצעות איסוף דם submandibular, ואחריו ציטומטריית זרימה כדי להעריך פיצוצים CD19+. כאשר תאי הדם ההיקפיים CD19+ היו ≥10 תאים / μL, העכברים קיבלו 2 × 10 6-5 × 106 תאי CART19. העכברים נשקלו מדי יום כמדד לרווחתם. לאחר 10 ימים לאחר עירוי תאי CART19, MRI מוח עכבר בוצעו כדי לזהות דלקת עצבית. דימום זנב להערכת ייצור ציטוקין/כימוקין והרחבת תאי T בוצע מדי שבוע לאחר הזרקת תאי CART19. קיצורים: CART = תא T קולטן אנטיגן כימרי; CART19 = עגלה ממוקדת CD19; ALL = לוקמיה לימפובלסטית חריפה; i.v. = תוך ורידי; i.p. = intraperitoneal; PB = דם היקפי; NSG = NOD-SCID IL2rγnull. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח של תאי גידול CD19+ כאינדיקטור לעומס הגידול במודל ALL PDX כדי להעריך רעילות הקשורה לתאי CART. (A) ניתוח ציטומטרי של זרימה מייצגת, המראה את אסטרטגיית ה-gating לניתוח אוכלוסיית תאי CD19+ שנלקחה מדגימת דם היקפית של עכבר שהוזרקו לו כל הפיצוצים שמקורם במטופל. (B) כימות והשוואה של אוכלוסיות תאי CD19+ בין עכברים שטופלו ב-CART19 לעומת עכברים לא מטופלים בהתבסס על נתונים גולמיים שהתקבלו מניתוח ציטומטריית זרימה. (ANOVA חד-כיוונית; n = 3 עכברים לקבוצה; קווי שגיאה, SEM). קיצורים: ns = לא משמעותי; ALL = לוקמיה לימפובלסטית חריפה; PDX = xenograft נגזר המטופל; CART = תא T קולטן אנטיגן כימרי; CART19 = עגלה ממוקדת CD19; SSC-H = גובה שיא פיזור בצד; FSC-H = גובה פיזור שיא קדימה; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הערכה של רעילות הקשורה ל-CART19 באמצעות מודל ALL PDX. (A) גרף מייצג של אחוז הירידה במשקל בעכברים שטופלו בתאי CART19 או בקרה של תאי T לא מותמרים במשך 6 הימים הראשונים לאחר CART (ANOVA דו-כיווני, ***p < 0.001, ****p < 0.00001; קווי שגיאה, SEM). (B) ביטוי של ציטוקינים וכימוקינים בסרום עכברי NSG לפני ואחרי מתן תאי CART19. עכברי NSG היו נתונים לדימום תת-לסתני לפני ואחרי מתן תאי CART19 (i.v.) כדי לאסוף את הסרום שלהם ולהעריך את הביטוי של הציטוקינים והכימוקינים הבאים: GM-CSF, IL-18, MIP-1α, IP-10, IL-1β ו- IL-6 (ANOVA דו-כיווני, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; n = 3 עכברים; תשעה עותקים טכניים; קווי שגיאה, SEM). קיצורים: ns = לא משמעותי; ALL = לוקמיה לימפובלסטית חריפה; PDX = xenograft נגזר המטופל; CART = תא T קולטן אנטיגן כימרי; CART19 = עגלה ממוקדת CD19; NSG = NOD-SCID IL2rγnull; GM-CSF = גרנולוציטים-מקרופאגים-גורם מגרה מושבה; IL-18 = אינטרלוקין-18; MIP-1α = חלבון דלקתי מקרופאגים-1 אלפא; IP-10 = חלבון המושרה על ידי אינטרפרון גמא 10; IL-1β = אינטרלוקין-1β; IL-6 = אינטרלוקין-6. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: דימות תהודה מגנטית המשמש להערכת דלקת עצבית במהלך טיפול בתאי CART19 במודל PDX. עכברי NSG שהושתלו בהם תאי גידול שמקורם בכל החולים הוחדרו לתאי CART19, והמוחות צולמו באמצעות MRI משופר גדוליניום לאחר שהעכברים הציגו תסמינים נוירולוגיים תוך 10 ימים לאחר עירוי CART. (משמאל) תמונה משוקללת T2 החושפת עדות לבצקת וחדירה דלקתית אפשרית במהלך NI בעכברים שטופלו ב-CART19 (חץ אדום). (באמצע) חתך אקסיאלי מייצג של MRI משוקלל T1 מראה שיפור ניגודיות בתוך פרנכימה במוח, המצביע על חדירות כלי דם מוגברת בעכברים שטופלו ב- CART19 (חץ אדום). (ימין) שחזורים תלת-ממדיים של מוח המכרסם עם אזורי T1-hyperintensity (אדום) נוצרו באמצעות תוכנת Analyze 12.0. קיצורים: MRI = הדמיית תהודה מגנטית; ALL = לוקמיה לימפובלסטית חריפה; PDX = xenograft נגזר המטופל; CART = תא T קולטן אנטיגן כימרי; CART19 = עגלה ממוקדת CD19. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אנוש עכבר
ציטוקין/כימוקין ציטוקינים מיאלואידים אנושיים (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1) ציטוקינים מיאלואידים אנושיים (IL-6, GM-CSF, IL-1, MCP-1)
זמן ל-CRS (יום) 2-5 4-6
זמן ל- NI (יום) 5-7 6-8
מצב BBB הפרעה ל-BBB הפרעה ל-BBB
מקרופאגים תושבי רקמות הפעלת מיקרוגליה הפעלת מיקרוגליה
תא CART במערכת העצבים המרכזית הסננה מוחית הסננה מוחית

טבלה 1: סיכום של הרעלים הקשורים לתאי CART שנצפו קלינית על-ידי מודל ALL PDX. קיצורים: GM-CSF = גרנולוציטים-מקרופאגים מושבה גורם מגרה; IL = אינטרלוקין; CRS = תסמונת שחרור ציטוקינים; NI = דלקת עצבית; BBB = מחסום דם-מוח; CNS = מערכת העצבים המרכזית; MCP-1 = חלבון כימואטרקנט מונוציטים 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בדו"ח זה תוארה מתודולוגיה להערכת רעילות הקשורה לתאי CART באמצעות מודל ALL PDX. באופן ספציפי יותר, מודל זה מבקש לחקות שתי רעילויות מסכנות חיים, CRS ו- NI, שחולים חווים לעתים קרובות לאחר עירוי של תאי CART. הוא משחזר סימני היכר רבים של רעילות CART שנצפו במרפאה: ירידה במשקל, תפקוד מוטורי לקוי, דלקת עצבית, ייצור ציטוקינים דלקתיים וכימוקינים, וחדירה של תאי השפעה שונים למערכת העצבים המרכזית 8,20,28. בעבר, מודל PDX זה שימש כדי לחקות את הפיתוח הראשוני של CRS ו- NI (טבלה 1) ולהעריך אסטרטגיות שונות למניעת רעילות וטיפול. מחקר אחד במודל PDX זה השתמש בתאי CART19 שהתרוקנו מ-GM-CSF. באופן ספציפי יותר, תוצאות אלה הראו כי דלדול GM-CSF הביא להפרשה מופחתת של ציטוקינים וכימוקינים הקשורים ל-CRS, אשר הודגמה בבירור באמצעות עכבר ALL PDX מודל29. מודל PDX זה שימש בהצלחה גם להערכת התפשטות תאי CART in vivo בקורלציה עם התפתחות CRS לאחר עירוי תאי CART19 באמצעות סימפורטר נתרן יודיד (NIS) כפלטפורמת הדמיה26. לכן, מודל מוצע זה מייצג כלי שימושי שניתן להשתמש בו כדי להעריך את הרעלים הפוטנציאליים הנובעים מתאי CART.

חשוב להזכיר כי מודלים רבים אחרים שימשו לחקר תאי CART in vivo. אלה כוללים מודלים סינגניים, טרנסגניים ואנושיים של עכברים, בנוסף למודלים קסנוגניים24. מודל העכבר הסינגני, המכונה גם מודל עכבר allograft immunocompetent, משתמש בתאי CART, גידולים ואנטיגני מטרה שמקורם במורין. זה יתרון מכיוון שהוא מאפשר מחקר של תאי CART במערכת חיסון מתפקדת במלואה ויכול גם לחשוף רעילות ממוקדת, מחוץ לגידול. החיסרון של מודל זה הוא שהביולוגיה והחסינות של עכברים שונות מאלה של בני אדם, ולכן הוא אינו מודל רלוונטי למחקרים תרגומיים שבהם המטרה היא להמשיך לניסויים קליניים24,39.

מודלים של עכברים טרנסגניים בעלי יכולת חיסונית מבטאים טרנסגן הקשור לגידול אנושי (TAA) הן על רקמות בריאות והן על גידולים בדפוסים המחקים את אלה הנמצאים ברקמות אנושיות. עכברים אלה שימשו גם במחקרי CART כדי להעריך טוב יותר את הבטיחות של תאי CART על ידי חשיפת השפעות מחוץ לגידול המטרה40,41. עכברים אנושיים שהושתלו עם תאי גזע המטופויטיים אנושיים CD34+ יכולים להיות מודל יתרון לחקר יעילות CART ורעילות על המערכת ההמטופויטית האנושית, מכיוון שמערכת החיסון המשוחזרת יכולה לחקות עיכוב CART ולגרום לסערת ציטוקינים המשחזרת CRS שנראה במרפאה42,43,44. למרות שמודלים אלה מאפשרים מחקר של תאי חיסון ספציפיים ביחס ליעילות CART, המערכת האנושית עדיין פרימיטיבית וזקוקה לאופטימיזציה נוספת. בנוסף, השימוש בהם בחקר השפעות מחוץ למטרה מוגבל מכיוון שרוב האנטיגנים המאכסן על רקמות בריאות מקורם במורין. יתר על כן, מודל העכבר האנושי CD34+ מאתגר מבחינה טכנית לפתח45. עם זאת, מודלים אנושיים של xenograft בעכברים מדוכאי חיסון משמשים בדרך כלל להערכת יעילות תאי CART אנושיים לפני התרגום לניסויים קליניים, וכפי שהודגם במאמר זה, ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הרעילות הקשורה לפעילות תאי CART. עם זאת, היעדר מערכת החיסון ותאי מערכת החיסון כגון תאי T ותאי NK מגביל את היישום שלהם להערכת רעילות מחוץ לגידול על המטרה, אינטראקציות של תאי CART עם תאי חיסון מולדים, ועיכוב תאי CART על ידי מיקרו-סביבה של הגידול.

היתרון של הפרוטוקול המתואר כאן הוא שהוא דורש הליכים פשוטים באמצעות עכברי NSG כדי לצפות ולהעריך רעילות הקשורה לתאי CART. ראשית, קל לשחזר אותו, והוא עבר אופטימיזציה להערכת אסטרטגיות למניעת רעילות CART באמצעות נטרול GM-CSF ולהמחשת התרחבות תאי CART בקורלציה עם הופעת CRS. בעת שימוש במודל PDX חדשני זה, חשוב לבצע נכון את השלבים הקריטיים, כגון אישור קליטה נכונה של כל הפיצוצים וניטור מוקדם של הופעת CRS מיד לאחר מתן CART. הערכת הציטוקינים וניטור המשקל חיוניים לקביעת רעילות הקשורה ל- CART, ו- MRI מגדיר את הופעת NI. החסרונות של מודל זה הם כדלקמן: 1) כמו PDX כל התאים לוקח זמן רב יותר להשתיל ולהגיע לנטל גידול גבוה, זה לוקח בערך 2-3 חודשים מחיסון תאי הגידול לטיפול בתאי CART19; 2) כמודל PDX ראשוני, קיימת שונות משמעותית בין מטופל למטופל ביחס לזמן הקליטה והתגובה לטיפול בתאי CART; 3) עומס הגידול אינו ניתן להערכה באמצעות הדמיה ביולומינסנציה ודורש הערכת דם היקפית תכופה; ו-4) המחסור בתאי חיסון מולדים מגביל את יכולתו של מודל זה לחקור אינטראקציות CART עם תאי מערכת החיסון או עם המיקרו-סביבה של הגידול.

העניין בבדיקת תאים מאומצים בתוך מודלים מורכבים יותר של עכברים גדל בעשור האחרון, כאשר התברר כי מודלים פשוטים של עכברים מדוכאי חיסון אינם מודלים פרה-קליניים אידיאליים. מודל עכבר PDX המתואר כאן כדי להעריך רעילות הקשורה לתאי CART מייצג מודל פרה-קליני מבטיח בתחום הטיפול בתאי CART מכיוון שהוא מחקה את ציר הזמן, הסימפטומים והסמנים של CRS ו- NI לאחר עירוי תאי CART כפי שניתן לראות במרפאה. בסך הכל, המתודולוגיה המתוארת כאן מספקת פלטפורמה חזקה להערכת רעילות הקשורה לתאי CART19, כמו גם יעילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אס.אס.קיי היא ממציאה של פטנטים בתחום האימונותרפיה לרכב המורשים לנוברטיס (באמצעות הסכם בין מאיו קליניק, אוניברסיטת פנסילבניה ונוברטיס) ולמטאפורג' (באמצעות מאיו קליניק). ר.ל.ס וס.ס.ק. הן ממציאות פטנטים בתחום האימונותרפיה לרכב המורשות להומניגן. אס.אס.קיי מקבלת מימון מחקרי מקייט, גלעד, ג'ונו, סלג'ין, נוברטיס, הומניגן, מורפוסיס, טולרו, סאנסיס, ליאהלאבס ולנטיגן.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה חלקית באמצעות המכונים הלאומיים לבריאות (R37CA266344, 1K99CA273304), משרד ההגנה (CA201127), צינור K2R של מאיו קליניק (S.S.K.), מרכז מאיו קליניק לרפואה אינדיבידואלית (S.S.K.), וקרן פרדולין (R.L.S). בנוסף, ברצוננו להודות לצוות מתקן הליבה NMR של מאיו קליניק. איור 1 נוצר בשנת BioRender.com

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin's lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. Cancer Research. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

חקר הסרטן גיליון 192 תא CART רעילות הקשורה לתאי CART מודל xenograft (PDX) הנגזר מהמטופל טיפול בסרטן מודל פרה-קליני in vivo

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

to:

Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

הערכה של רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי T באמצעות מודל עכבר קסנוגרפט שמקורו בלוקמיה לימפובלסטית חריפה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manriquez Roman, C., Sakemura, R.… More

Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter