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Biology

蛍光共鳴エネルギー移動による 生体内 におけるヒストン修飾酵素と転写因子の相互作用の解明

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、生細胞におけるタンパク質相互作用を検出するためのイメージング技術です。ここでは、ヒストン修飾酵素と、植物組織における遺伝子発現のエピジェネティックな調節のためにそれらを標的プロモーターに動員する転写因子との関連を研究するためのFRETプロトコルが提示されています。

Abstract

遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、転写抑制または活性化のためにそれぞれヘテロクロマティックまたはユークロマティックヒストンマークを生成するヒストン修飾酵素(HME)によって一般的に影響を受けます。HMEは、転写因子(TF)によって標的クロマチンにリクルートされます。したがって、HMEとTFの間の直接的な相互作用を検出して特徴付けることは、それらの機能と特異性をよりよく理解するために重要です。これらの研究は、生体組織内で in vivo で実施された場合、生物学的により関連性があります。ここでは、植物ヒストンデユビキチナーゼと植物転写因子との間の植物葉における相互作用を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて可視化するためのプロトコルを記述し、互いに<10nm以内にあるタンパク質分子間の複合体の検出を可能にする。FRET技術の2つのバリエーションが提示される:SE-FRETおよびAB-FRET(アクセプター漂白)は、エネルギーがドナーからアクセプターに非放射的に伝達されるか、アクセプターの光退色時にドナーによって放射的に放出される。SE-FRETとAB-FRETの両方のアプローチは、 プランタ内の他のタンパク質間の他の相互作用を発見するために容易に適応させることができます。

Introduction

植物ヒストンデユビキチナーゼは、ヒストンの翻訳後修飾、特にモノユビキチル化マークを消去することにより、遺伝子発現を制御する上で重要な役割を果たします1。これまでのところ、OTLD1はシロイヌナズナ2,3において分子レベルで特徴付けられる数少ない植物ヒストンデユビキチナーゼの1つである。OTLD1は、H2Bヒストン分子からモノユビキチン基を除去し、それによって標的遺伝子クロマチン4,5におけるH3ヒストンのユークロマティックアセチル化およびメチル化修飾の除去または付加を促進する。さらに、OTLD1は、別のクロマチン修飾酵素であるヒストンリジン脱メチル化酵素KDM1Cと相互作用して、標的遺伝子の転写抑制に影響を及ぼす6,7。

ほとんどのヒストン修飾酵素はDNA結合能力を欠いているため、標的遺伝子を直接認識することはできません。1つの可能性は、これらの酵素に結合し、それらをクロマチン標的に導くDNA結合転写因子タンパク質と協力することです。具体的には、植物では、いくつかの主要なヒストン修飾酵素(すなわち、ヒストンメチルトランスフェラーゼ8,9、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ10、ヒストンデメチラーゼ11、およびポリコーム抑制複合体12,13,14)が転写因子によってリクルートされることが知られている。この考えと一致して、最近、OTLD1と転写因子LSH1015との特異的なタンパク質間相互作用に基づく、標的プロモーターへのOTLD1リクルートメントの1つの可能なメカニズムが提案された。

LSH10は、中枢発生調節因子として機能する植物ALLOG(シロイヌナズナLSH1およびOryza G1)タンパク質のファミリーに属する16、17、18、19、20、21、22。ALOGタンパク質ファミリーのメンバーにDNA結合モチーフ23が含まれ、転写調節22、核局在19、およびホモ二量体化24の能力を示すという事実は、LSH10を含むこれらのタンパク質が転写のエピジェネティック調節中に特異的転写因子として作用する可能性があるという考えをさらに裏付けるものです。in vivoでのLSH10-OTLD1相互作用の特性評価に使用される主な実験技術の1つは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)15です。

FRETは、生細胞内のタンパク質同士25<10nm以内の近距離相互作用を直接検出するイメージング技術です。FRETアプローチ26には、増感発光(SE-FRET)(図1A)とアクセプター漂白(AB-FRET)(図1B)の2つの主要なバリエーションがあります。SE-FRETでは、相互作用するタンパク質(一方はドナー蛍光色素(例えば、緑色蛍光タンパク質、GFP)でタグ付けされ、もう一方はアクセプター蛍光色素(例えば、単量体赤色蛍光タンパク質、mRFP27,28)でタグ付けされ、励起状態エネルギーをドナーからアクセプターに非放射的に伝達する。この転送中に光子が放出されないため、アクセプターと同様の放射発光スペクトルを持つ蛍光シグナルが生成されます。AB-FRETでは、アクセプターが光退色によって永久に不活性化され、ドナーから伝達された非放射エネルギーを受け取ることができない場合、ドナーの放射放出の上昇に基づいてタンパク質相互作用が検出され、定量化されます(図1)。重要なことに、FRET蛍光の細胞内位置は、細胞内の相互作用タンパク質の局在を示すものである。

FRETを生体組織に展開し、相互作用タンパク質の細胞内局在を決定すると同時にこの相互作用自体を検出することができるため、FRETはin vivoでのタンパク質間相互作用の研究および初期特性評価に最適な技術となっています。同等のインビボ蛍光イメージング方法論である二分子蛍光相補(BiFC)29,30,31,32は、良好な代替アプローチであるが、FRETとは異なり、BiFCは自己蛍光BiFCレポーター33の自発的な集合により偽陽性を生じる可能性があり、そのデータの定量化はそれほど正確ではない。

本稿では、SE-FRETとAB-FRETの両方の技術の実装における成功事例を共有し、植物細胞におけるOTLD1とLSH10の相互作用を調査するための展開のプロトコルを紹介します。

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Protocol

ニコチアナベンサミアナ、 アグロバクテリウムツメファシエンス 株EHA105、またはGV3101を本研究に使用しました。

1. FRETベクトル構築

  1. ドナー/アクセプターFRETペアの蛍光タグを選択します。
    1. pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28(材料表参照)からのEGFPを使用して、ドナーベクターを生成します。
    2. pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1( 材料表参照)からのmRFPを使用して、アクセプターベクターを生成します。
  2. Gateway組換えクローニングシステム35などの部位特異的組換えクローニング技術34を使用して、ドナー/アクセプターFRET構築物を生成する。
    1. 目的のタンパク質36 (すなわち、シロイヌナズナ OTLD1 および LSH10)のコード配列を増幅する15。
      注:相互作用するタンパク質の1つのホモログを表すが、相互作用を示すとは予想されないネガティブコントロールを利用することもお勧めします。OTLD1-LSH10相互作用研究では、OTLD1を認識しないLSH10、LSH4のホモログを使用しています。OTLD1、LSH10、およびLSH4 cDNAは、 表1にリストされているプライマーを用いたPCRによって増幅されます。
    2. 部位特異的組換えクローニング技術34によってOTLD1、LSH10、およびLSH4をエントリーベクターpDONR207にクローニングする。
    3. ゲートウェイLRクローナーゼII(材料表を参照)を使用して、LSH10およびLSH4をpDONR207からバイナリ宛先ベクターpPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1に転送し、バイナリドナーコンストラクトp35S::LSH10-GFP(テスト済みコンストラクト)およびp35S::LSH4-GFP(ネガティブコントロール)を生成します。
    4. 同じ市販の酵素(ステップ1.2.3)を使用して、 OTLD1 をpDONR207からバイナリ宛先ベクターpPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1に転写し、バイナリアクセプターコンストラクトp35S::OTLD1-mRFP(テスト済みコンストラクト)を生成します。
    5. 表1に記載のプライマーを用いてpPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1から36 mRFPをPCR増幅し、組換えクローニング技術によりpDONR207にクローニングし、次いでLRクロナーゼIIを用いてmRFPをpPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1に転写し、バイナリ融合コンストラクトp35S::mRFP-GFP(ポジティブコントロール)を生成します。
  3. ドナーおよびアクセプター構築物のアグロバクテリウムへの形質転換を行う。
    1. 標準プロトコル37を使用して調製した、または市販品を入手した アグロバクテリウム・ツメファシエンス 株EHA105またはGV3101のコンピテントセルの培養液100 μLに、ステップ1.2.3-1.2.5の各プラスミド1 μgを追加し、37 °Cで5分間インキュベートします。
    2. 1 mLのLB培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、および1%NaCl; 材料表を参照)をコンピテントセル混合物に加え、200rpmおよび28°Cで1.5時間攪拌します。室温で1分間、3,000 × g で遠心分離して細胞を回収します。
    3. ピペッティングにより細胞を0.1 mLのLB培地に再懸濁し、適切な抗生物質(0.01%スペクチノマイシンおよび0.005%リファンピシンなど)を添加したLB寒天上に広げ ます。28°Cで2日間生育させる。
    4. 個々のコロニーを選び、適切な抗生物質を添加した1 mLのLBブロスにそれぞれ別々に接種します。
    5. 細胞を28°Cで24時間増殖させ、培養液0.2 mLを新しいチューブに移します。室温で30秒間、10,000 × g で遠心分離して細胞を回収します。
    6. アグロバクテリウム菌細胞38 からプラスミドを単離するための標準プロトコルによってプラスミドDNAを抽出し、抽出したDNAを30 μLの水に再懸濁します。目的のプラスミドを保持するコロニーを特定するには、 表1にリストされている遺伝子特異的プライマーを使用したPCRの鋳型として2 μLのDNA調製物を使用します。同定した培養液0.7 mLをグリセロール0.3 mLと混合し、-80°Cで保存します。

2.アグロインフィルトレーション

  1. ニコチアナベンサミアナ植物を育てます。
    注:実験全体を通して、すべての植物は健康でなければなりません。
    1. 湿った土を高密度で含む鉢に N.ベンサミアナ の種をまき、育てます。
    2. 植え付けた種子を、真正植物の直径が0.5 cmに達するまで、150〜170 μmol / m2秒の光強度で16時間の光と8時間の暗サイクルで23°Cに設定された成長チャンバーに保管します。
    3. 苗をより大きな鉢に移し、それらが同じパラメータで同じ部屋で成長することを可能にする。
      注:植物は、最大の葉の直径が5〜7 cmの場合、通常は4〜5週間以内に、農業浸透の準備ができています。若すぎる小さな植物では、アグロインフィルトの影響はFRET分析には深刻すぎます。
  2. アグロ浸潤のために細菌細胞を準備します。
    1. FRETコンストラクトを含む各アグロバクテリウムコロニーを、適切な抗生物質(ステップ1.3.3)と150 μMアセトシリンゴンを添加した5 mLのLB培地で28°Cで一晩増殖させます( 材料の表を参照)。
    2. 細胞を3,000 × g で室温で5分間遠心分離します。
    3. 細胞をアグロイン浸潤バッファー(10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μMアセトシリンゴン)にOD600 = 0.5まで再懸濁します。
    4. 適切なコンストラクトを保持するセル間で、再懸濁されたセルを1:1 v / v比で結合します(ステップ2.2.5)。
    5. 二重構築物の農業浸透の場合は、2つの培養物のアリコートを混合し、単一構築物の農業浸透の場合は、同じ培養物のアリコートを混合します。
      1. 試験タンパク質:OTLD1-mRFP + LSH10-GFP(p35S::OTLD1-mRFPおよびp35S::LSH10-GFPコンストラクトを有する細菌)。
      2. 陰性対照:OTLD1-mRFP + LSH4-GFP(p35S::OTLD1-mRFPおよびp35S::LSH4-GFPコンストラクトを保持する細菌)。
      3. ネガティブコントロール:LSH10-GFP + 遊離mRFP(p35S::LSH10-GFPおよびpPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1コンストラクトを保持する細菌)。
      4. ポジティブコントロール:mRFP-GFP(p35S::mRFP-GFPコンストラクトを有する細菌)。
    6. 細胞を28°Cで0.5〜1時間インキュベートします。
  3. アグロ浸潤を行います。
    1. 細菌培養物を1 mLのニードルレスシリンジに入れます。
    2. シリンジのノズルを、完全に拡張した N. benthamiana の葉の腹軸側にそっとしっかりと押し付け、手袋をはめた指で葉をアダキシャル側に保持します。
    3. 葉の上に最大4つのスポット、植物ごとに3つの葉、細菌培養ごとに2つまたは3つの植物を浸透させます。クロスコンタミネーションを防ぐために、サンプル間で手袋を交換してください。
    4. アグロ浸潤植物を、ステップ2.1.2で説明したのと同じ条件下で、同じ成長チャンバー内で24時間から36時間維持します。農業浸潤植物を36時間以上保持すると蛍光シグナルが低下するため、保管しないでください。

3. 共焦点顕微鏡

  1. 蛍光可視化用の顕微鏡スライドを準備します。
    1. 浸潤の24〜36時間後、かみそりの刃を使用して、各農業浸潤葉を静脈間の小片(2 mm x 4 mm)に切ります。
    2. 葉片をスライドガラスの上に置き、葉の表面を上に向けて置きます。葉の部分に水滴を置き、カバーガラスで覆います。カバーガラスを軽くたたいて気泡を取り除きます。
    3. 顕微鏡とレーザーの電源を入れます( 材料表を参照)。スライドを顕微鏡ステージホルダーに配置して、特定のFRETパラメータでイメージングします(手順3.2および3.3)。
    4. 10倍の対物レンズを使用して観察を開始し、GFPとmRFPの両方のシグナルを示す細胞を特定し、その後の詳細な観察に40倍の対物レンズを使用します。
      注:重要なことに、SE-FRETとAB-FRETは通常同じ組織サンプルに対して実行され、SE-FRETおよびAB-FRET観察でそれぞれオン/オフを切り替えるFRETチャネルを除いて、同じチャネル設定(ステップ3.2)を使用できます(ステップ3.2.2.3および3.3.1)。
  2. SE-FRETのパラメータを設定します(図1A)。
    1. 多次元取得 (MDA) ツールを開きます。
    2. 同じ視野内に3つの共焦点チャネルのセットを確立します(補足図1)。
      1. 405 nm励起レーザーと400-597 nm発光フィルターを使用して、ドナー蛍光色素の励起と発光のためのドナーチャネル(GFPチャネル)を設定します。
      2. 561 nm励起レーザーと400-597 nm発光フィルターを使用して、アクセプター蛍光色素の励起と発光のアクセプターチャネル(mRFPチャネル)を設定します。
        注:mRFPの発光フィルタは、mRFP信号を597〜617nmのFRET信号から分離し(ステップ3.2.2.3)、FRETに依存しないmRFP放射を低減するために400〜597nmに設定されました。
      3. 405 nm励起レーザーと597-617 nmの発光フィルターを使用して、ドナーの励起とアクセプター蛍光色素の発光用のFRETチャネルを設定します。
    3. ドナー励起強度を最小レベルに設定して、光退色を回避しながらFRETを観察し、SE-FRET効率を低下させます。
      注意: この励起強度は、光退色を避けるためにFRET手順を実行する前に実験的に選択されます。葉の厚さ、年齢、過剰発現後の時間によって異なります。
    4. ドナーを励起し、アクセプターの予想される蛍光シグナルを含む細胞をスキャンします。
    5. 目的の蛍光シグナルを含む領域を選択します。
    6. スナップボタンを押してSE-FRET画像シーケンスを取得します。
      1. 画像 mRFP-GFP構築物を発現する細胞(ポジティブコントロール)を最初に10-15細胞;フォーカス、ズーム、およびスマートゲインのパラメータを調整して、キャプチャする対象領域に焦点を合わせます(補足図2)。
      2. 同じ設定を用いて、それぞれがOTLD1−mRFP、遊離mRFP、LSH10−GFP、またはLSH4−GFPを別々に発現する10〜15個の細胞を画像化する。
        注:これらの画像は、アクセプターとドナーのスペクトルブリードスルー(SBT)値を決定するためにFRETデータ分析(ステップ3.4.1)に使用されたImageJの「PixFRET」プラグイン( 材料表を参照)によって取得されます。これらの画像は、OTLD1-mRFP + LSH10-GFP、OTLD1-mRFP + LSH4-GFP、およびLSH10-GFP + 遊離mRFPタンパク質ペアのSE-FRET画像を生成するためにソフトウェアによって使用されます(ステップ3.2.6.3)。
      3. また、同じ設定を用いて、OTLD1-mRFP + LSH10-GFP、OTLD1-mRFP + LSH4-GFP、およびLSH10-GFP + 遊離mRFPタンパク質ペアを共発現する10-15細胞を画像化した。
  3. AB-FRETのパラメータを設定します(図1B)。
    1. SE-FRETに設定されたドナーおよびアクセプターチャネルパラメータを使用しますが(ステップ3.2.2)、FRETチャネルをオフにします。
    2. アクセプターの光退色(mRFP)のパラメータを設定します(補足図3)。
      1. 漂白が5枚の画像の後に開始されることを確認してください。各領域ブリーチに対して200回の反復を許可します。561nmで100%のレーザー強度を維持します。
      2. 45秒の漂白時間を維持します。400 Hzで512 x 512ピクセルのスキャン速度を確保してください。
    3. 漂白する細胞の領域を描画します。例えば、核相互作用の場合、関心領域は細胞核39の全領域の周りに描かれる。
    4. [実験の開始]ボタンを押して漂白をアクティブにします。この機能を有効にすると、光退色が実行され、AB-FRET画像シーケンスが取得されます。
  4. FRET データを分析します。
    1. SE-FRETデータを解析するには、ImageJソフトウェア用の「PixFRET」プラグインを使用して、SBT40 を差し引いた後のSE-FRET効率の補正画像を生成します(ステップ3.2.6.2)。
    2. AB-FRETデータを解析するために、下記式41を用いて、mRFP光退色後のGFP放出の増加率として%AB-FRETを計算する:%AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre)/GFPpre] x 100(ここで、GFPポストはmRFP光退色後のGFP放出、GFPpreはmRFP光退色前のGFP放出である)。
    3. FRET画像を確認するときは、FRETシグナルの細胞内局在に注意してください。
      注:多くの場合、これらの細胞コンパートメント(核、葉緑体、ERなど)は簡単に識別でき、FRET技術の追加の利点として、相互作用するタンパク質の生物学的機能への重要な手がかりを提供します。

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Representative Results

図2 は、細胞核を3つのチャネル(すなわち、ドナーGFP、アクセプターmRFP、およびSE-FRET)に同時に記録したSE-FRET実験の典型的な結果を示しています。これらのデータは、擬似カラースケールでコード化されたSE-FRET効率の画像を生成するために使用されました。このスケールでは、青から赤への移行は、0%から100%へのタンパク質間近接性の尺度であるFRET効率の増加に対応します。この代表的な実験では、SE-FRETシグナルを細胞核で記録し、LSH10とOTLD1の共発現後の強度は、mRFP-GFPの発現後に観察されたものと同等でした(すなわち、ポジティブコントロール)。陰性対照(すなわち、OTLD1-mRFPとLSH4-GFPの共発現または遊離mRFPとLSH10-GFPの共発現)ではSE-FRETは観察されなかった。

LSH10-OTLD1相互作用は、AB-FRETを用いて定量化した。この目的のために、ドナーGFP蛍光を、ドナーおよびアクセプター蛍光測定値のフォトブリーチング時系列としてアクセプターmRFPのフォトブリーチング前後の細胞核に記録した(補足図4)。記録された細胞核の画像を擬似カラーで提示し、GFP蛍光の変化を定量化しました。 図3 は、mRFP受容体が光退色され、蛍光能力を失った後、LSH10-GFP/OTLD1-mRFP共発現がGFPドナー蛍光の増加をもたらしたことを示しています。ドナー蛍光の同様の増加は、mRFP-GFPポジティブコントロールで観察されましたが、LSH4-GFP/OTLD1-mRFPまたはLSH10-GFP/mRFP共発現のネガティブコントロールでは観察されませんでしたが、アクセプター蛍光はすべてのフォトブリーチング実験で不活性化されました。 図4 は、AB-FRETデータの定量分析を示しており、LSH10とOTLD1を共発現した後、ドナー蛍光(%AB-FRET)が約13%統計的に有意に増加したことを示しています。陽性のmRFP-GFPコントロールは約30%の%AB-FRETを生成しましたが、陰性コントロールは%AB-FRETを生成しませんでした。SE-FRETとAB-FRETの両方の画像は、転写因子-ヒストン修飾酵素複合体およびGFP/mRFPタンパク質の核細胞質の性質について予想される細胞内局在と一致して、細胞核内のFRETシグナルを示しました34 (図2 および 図3)。

要約すると、代表的なデータは、このFRETプロトコルを使用して、ヒストン修飾酵素と転写因子との間の相互作用を実証および定量化し、生きた植物細胞におけるそれらの細胞内局在を決定できることを示しています。

Figure 1
図1:SE-FRETおよびAB-FRET技術の概略図 。 (A)SE-FRETの基本原理。試験したタンパク質の1つは、ドナー蛍光色素として作用するGFPでタグ付けされ、もう1つはアクセプター蛍光色素として作用するmRFPでタグ付けされています。ドナー分子が励起され、アクセプター発光が記録されます。試験したタンパク質が互いに10 nm以内に位置するように相互作用すると、励起されたドナーからのエネルギーが非放射的にアクセプターに伝達され、アクセプターが励起されてFRET発光チャネルで蛍光を発します。相互作用が起こらない場合、エネルギーはドナーからアクセプターに伝達されず、アクセプターによるFRET放出は検出されません。(B)ABフレットの基本原理。試験されたタンパク質は、SE-FRETについて(A)に記載されているようにタグ付けされています。ドナー分子は励起され、試験されたタンパク質間の相互作用が起こると、ドナーはアクセプターを非放射様式で励起し、FRETをもたらす。次いで、アクセプターは光退色によって永久に不活性化され、それによってドナーからの非放射エネルギーを受け入れ、FRET放出チャネルにおいてFRET蛍光を放出する能力を失う。一方、ドナーが発する蛍光は、ドナーが非放射伝達によって失うエネルギーが少ないため、増加します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:SE-FRETによって検出された ベンサミアナ 菌の葉におけるLSH10とOTLD1の特異的相互作用。 示されたタンパク質の組み合わせについて、3つの検出チャネル(ドナー、アクセプター、およびSE-FRET)からの画像が示されています。SE-FRET効率画像は、スペクトルブリードスルー(SBT)の減算によって計算され、擬似カラーで表示され、赤と青はそれぞれ最高信号と最低信号を示します。(A)mRFP-GFPポジティブコントロールによって生成される高いSE-FRET効率の信号。(B)相互作用するLSH10-GFPおよびOTLD1-mRFPタンパク質によって生成される正のSE-FRET効率シグナル。(C)ネガティブコントロールタンパク質LSH4-GFPとOTLD1-mRFPの共発現は、SE-FRET効率シグナルを生じなかった。(D)ネガティブコントロールフリーmRFPタンパク質とLSH10-GFPの共発現は、SE-FRET効率シグナルを生じなかった。スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:AB-FRETによって検出された ベンサミアナ 菌葉におけるLSH10とOTLD1の特異的相互作用。 示されたタンパク質の組み合わせについて、光退色前後の2つの検出チャネル(ドナーとアクセプター)からの画像が示されています。円は光退色領域を示す。mRFP光退色後のGFP蛍光の増加として視覚化されたAB-FRETは、それぞれ最高信号と最低信号を示す赤と青の色の擬似カラーを使用して表示されます。(A)mRFP-GFPポジティブコントロールによって生成されたGFPドナー蛍光の増加。(B)相互作用するLSH10-GFPおよびOTLD1-mRFPタンパク質によって生成されるGFPドナー蛍光の増加。(C)ネガティブコントロールタンパク質LSH4-GFPとOTLD1-mRFPの共発現は、GFPドナー蛍光にごくわずかな変化をもたらした。(D)ネガティブコントロールフリーmRFPタンパク質とLSH10-GFPの共発現は、GFPドナー蛍光にごくわずかな変化をもたらした。スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:AB-FRETの定量。 mRFPフォトブリーチング後のGFPドナー蛍光の増加率(%AB-FRET)は、示されたタンパク質の組み合わせについて示されています。エラーバーは、各測定値のn = 13セルの平均を表します。両側t検定では、平均値間の差はp値*p <0.05、**p <0.01、および***p <0.001に対して統計的に有意であると判断されました。 p≥ 0.05は統計的に有意ではありません(NS)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プライマー名 シーケンス (5'� から 3'�) 目的
OTLD1 Fw ggggacaagtaagcaagctcaatgactcggattttggttcaaag cDNAから OTLD1 を増幅する
OTLD1 Rv ggggaccacttttcaagaaagctgggtgtgttccgtctttgccttttgcgtc cDNAから OTLD1 を増幅する
LSH10 Fw グッガガア cDNAから LSH10 を増幅する
LSH10 Rv ggggaccacttttagcaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaac cDNAから LSH10 を増幅する
LSH4 Fw ggggacaagtaagcaggctcaatggcatatcatcggctttatg cDNAからLSH4を増幅する
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc cDNAから LSH4 を増幅する
mRFP Fw グッガ pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 から mRFP を増幅する
mRFP Rv ggggaccactttcaagaaagctgtgttggatctgcggccggcgg pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 から mRFP を増幅する
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc PCRおよびDNAシーケンシングによるpDONR207の配列の確認
AttL2 GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC PCRおよびDNAシーケンシングによるpDONR207の配列の確認
AttB1 Fw ggggacaaagtac aaaaaagcaggct PCRおよびDNAシーケンシングによる宛先ベクターの配列の確認
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt PCRおよびDNAシーケンシングによる宛先ベクターの配列の確認
35Sプロモーター Fw CTATCCTTCGCAAGACCCTTC PCRによる宛先ベクターの配列確認

表1:pDONOR207および宛先ベクターにおけるクローニングおよびクローニングされた配列を確認するためのプライマー。 Fw、フォワードプライマー;Rv、リバースプライマー。

補足図1:共焦点チャンネルのパラメータの設定。 (A)ドナーチャネル(GFP)の励起および放出パラメータ設定のスクリーンショット。(B)アクセプターチャネル(mRFP)の励起および放出パラメータ設定のスクリーンショット。(C) FRETチャンネルの励起および放出パラメータ設定のスクリーンショット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:目的のサンプルのSE-FRET画像を取得するための調整パラメータ。 (A)スキャンエリアパラメータ設定(画像サイズ、スキャン速度、方向、平均化など)のスクリーンショット。(B)GFPチャンネルパラメータ設定のスクリーンショット(つまり、レーザー、ピンホール、マスターゲイン、およびデジタルゲイン)。(C) mRFPチャンネルパラメータ設定のスクリーンショット(レーザー、ピンホール、マスターゲイン、デジタルゲインなど)。(D)FRETチャンネルパラメータ設定のスクリーンショット(つまり、レーザー、ピンホール、マスターゲイン、およびデジタルゲイン)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:アクセプター光退色のためのパラメータの設定。 (A)スキャンエリアパラメータ設定(画像サイズ、スキャン速度、方向、平均化など)のスクリーンショット。(B)時系列と時間ブリーチングパラメータ設定のスクリーンショット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:AP-FRET中のドナーおよびアクセプター蛍光測定の時系列。 アクセプター(mRFP)およびドナー(GFP)蛍光の動態は、示されたサンプルについて、光退色期間の前、最中、および後に決定されました。(A)ポジティブmRFP-GFPコントロール。(B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP.(C) LSH4-GFP + OTLD1-mRFPコントロールが陰性である。(D) ネガティブLSH10-GFP + フリーmRFPコントロール。黄色の線は光退色期間を示す。白い曲線は、蛍光速度論の測定値をプロットする。各パネルにおいて、上側および下側の画像は、それぞれアクセプター(mRFP)およびドナー(GFP)蛍光の速度論を示す。当然のことながら、レーザーがGFP自体を徐々に光退色するため、GFP蛍光は時間の経過とともに減少することが多いことに注意してください。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

このFRETプロトコルはシンプルで再現が簡単です。また、最小限の供給投資を必要とし、多くの近代的な研究所で標準装置を利用しています。具体的には、5つの主要な技術的特徴がこの手順の多様性を区別します。まず、FRETコンストラクトは、従来の制限酵素ベースのクローニングと比較して使いやすく、正確な結果を生成し、時間を節約するクローニングアプローチである部位特異的組換えを使用して生成されます。第二に、 N. benthamiana 植物は成長が簡単で、比較的大量の組織を生産し、ほとんどの実験室で利用可能です。第三に、アグロインフィルトは、送達された構築物の一時的な発現をもたらし、したがって、トランスジェニック植物の生産に必要な数ヶ月と比較して、比較的短い期間(すなわち、24〜36時間)以内にデータを生成する。第四に、共アグロインフィルトレーションによって目的のコンストラクトの異なる組み合わせを送達する能力は、任意のタンパク質間の相互作用の試験を可能にする。最後に、SE-FRETとAB-FRETの両方は、レーザーチャネル設定の1つをオン/オフするだけで、同じ組織サンプルに対して順番に実行できます。しかしながら、マイクロボンバードメント送達42 は、アグロ浸潤の代わりに植物組織への構築物送達のための代替アプローチとして使用することができることに留意すべきである。この場合、アグロイン浸潤に必要なバイナリベクターの使用は不要である。

このプロトコルの重要なステップの1つは、FRET効率を最適化するためにドナーとアクセプターの蛍光色素ペアを適切に選択することです。次の3つの要因を考慮する必要があります:(1)ドナー発光スペクトルは、伝達されるエネルギーの量を最大化するためにアクセプター吸収スペクトルと最大限に重なる必要があります。(2)ドナーとアクセプターの発光スペクトルは、互いに区別され、顕微鏡によって検出されるシグナルのSBTを最小限に抑えるために十分に異なっていなければならない。(3)アクセプターは、ドナーの励起中のアクセクターの励起を最小限に抑えるために、ドナーの吸光度の最大値で最小の直接励起を有しなければならない。使用される一般的なドナー/アクセプターFRETペアは、シアン/イエローおよびグリーン/レッド蛍光タンパク質(すなわち、それぞれCFP/YFPおよびGFP/mRFP)です。このプロトコルは、生細胞イメージングに適しており、シアン/黄色のFRETペアとは異なり、光毒性が低く、光退色が少ないため、GFP/mRFPペアを利用します43。好都合なことに、FRETペア間の並進融合(すなわち、mRFP-GFP)は、理想的なFRETポジティブコントロールとして機能する。

別の重要なステップは、適切なネガティブコントロールの選択です。例えば、LSH10-OTLD1相互作用の場合、FRET分析には、OTLD1単独、LSH10単独の発現、および相互作用が予想されないタンパク質(すなわち、それぞれLSH4およびfree mRFP)とのOTLD1およびLSH10の共発現が常に含まれていなければならない。ネガティブコントロールの選択に関して、FRET実験は、生きた植物細胞におけるタンパク質相互作用の検出に適合した別の蛍光イメージングベースのアプローチであるBiFC技術44の使用に関するベストプラクティスに関するガイドラインに従うことができる29,30,31,32。

最後に、FRET実験に影響を与える因子は、生きている植物組織におけるすべての実験に共通であり、それは、植物の様々な生理学的条件、一般に、および特に制御された成長条件下で維持された場合でも、アグロ浸潤形質転換細胞に由来する。この生理学的変動性は、個々の実験、植物、さらには葉の間のFRETデータの特定の変動に寄与する可能性があります。したがって、各実験に少なくとも2つの植物と植物ごとに3つの葉を使用し、より良い画像が得られるため、農業浸透のために成熟した完全に拡張された葉を選択することが重要です。

すべての実験方法と同様に、FRETには技術的および使用法ベースの制限があります。そのような制限因子の1つは、自己蛍光タグの性質および目的のタンパク質内(例えば、アミノ末端またはカルボキシル末端)におけるその位置であり、これは、細胞内局在のその天然パターンまたはその天然の相互作用因子を認識する能力など、このタンパク質の生物学的特性を妨害する可能性がある。タグ付けの前に、関心のある各タンパク質を、タグ付けによって損なわれる可能性のある構造的特徴について、可能な限り分析する必要があります。しかしながら、多くの場合、タグ付けパラメータは、目的のタンパク質の既知の活性に基づいて経験的に決定されなければならない。もう一つの大きな制限は、FRETの相対的な技術的洗練度であり、適切なハードウェアとソフトウェアで共焦点顕微鏡を使用する必要があります。酵母ツーハイブリッドシステム(Y2H)45、46、47などのいくつかの他のタンパク質相互作用方法とは異なり、FRETは、発現ライブラリー、特にハイスループットスクリーニング48をスクリーニングすることによってタンパク質相互作用を同定するのには適していない。さらに、インビボで行われるほとんどのアッセイのように、FRETは生化学的に純粋な系ではないため、相互作用における他の未知の細胞因子の潜在的な関与を検出しません。

タンパク質相互作用の他のアッセイに関するFRETの重要性は、短距離相互作用の検出、偽陽性結果の可能性の低減、さまざまな細胞、組織、および生物(植物を含む)におけるin vivoでの展開の適用性、および相互作用タンパク質の細胞内局在の検出にあります。FRETのこれらの特徴の多くは、スプリットルシフェラーゼ49,50またはBiFC 29,30,31,32,33などの他のin vivoアプローチで見られ、その中でBiFCがおそらく最も一般的に使用されています。別の広く使用されている相互作用アッセイはY2H45,46,47です。ただし、酵母生物学の研究以外では、このアッセイは偽陽性になりやすい異種実験システムを利用しており、その発見には別の技術による確認が必要です。Y2Hの概念的なバリエーションは、膜タンパク質51,52間の相互作用を検出するのにより適しており、Y2Hと同様のFRETに対して制限を示すスプリットユビキチンアッセイです。最後に、タンパク質相互作用は共免疫沈降(co-IP)によって検出することができ、これは細胞抽出物の複雑な環境での検出、ならびに正確に定義されたin vitro反応での検出に適用される53,54,55;私たちの経験では、co-IPは、蛍光ベースのin vivoアプローチを使用して得られたデータを確認するための代替的かつ独立した方法として最も有用です。

この特定のFRETプロトコルは、植物の転写因子とヒストン修飾酵素の間の相互作用を研究するために開発されましたが、他の多くの クラスのタンパク質間の相互作用を発見し、特徴付けるために使用できます。

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Disclosures

利益相反は宣言されていません。

Acknowledgments

VCの研究室での作業は、NIH(R35GM144059およびR01GM50224)、NSF(MCB1913165およびIOS1758046)、およびBARD(IS-5276-20)からVCへの助成金によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

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生物学、第188号、ヒストン修飾酵素(HME)、転写因子(TF)、タンパク質間相互作用、FRET
蛍光共鳴エネルギー移動による <em>生体内</em> におけるヒストン修飾酵素と転写因子の相互作用の解明
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Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

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