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Biology

Investigación de las interacciones entre las enzimas modificadoras de histonas y los factores de transcripción in vivo mediante la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica de imagen para detectar interacciones de proteínas en células vivas. Aquí, se presenta un protocolo FRET para estudiar la asociación de enzimas modificadoras de histonas con factores de transcripción que las reclutan a los promotores objetivo para la regulación epigenética de la expresión génica en tejidos vegetales.

Abstract

La regulación epigenética de la expresión génica se ve comúnmente afectada por enzimas modificadoras de histonas (HME) que generan marcas de histonas heterocromáticas o eucromáticas para la represión o activación transcripcional, respectivamente. Los HME son reclutados a su cromatina diana por factores de transcripción (TF). Por lo tanto, detectar y caracterizar las interacciones directas entre HME y TF es fundamental para comprender mejor su función y especificidad. Estos estudios serían biológicamente más relevantes si se realizaran in vivo dentro de tejidos vivos. Aquí, se describe un protocolo para visualizar las interacciones en las hojas de las plantas entre una histona desubiquitinasa de la planta y un factor de transcripción de la planta utilizando la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), que permite la detección de complejos entre moléculas de proteínas que están dentro de <10 nm entre sí. Se presentan dos variaciones de la técnica FRET: SE-FRET (emisión sensibilizada) y AB-FRET (blanqueamiento aceptor), en el que la energía se transfiere de forma no radiativa del donante al aceptor o emitida radiativamente por el donante tras el fotoblanqueo del aceptor. Tanto los enfoques SE-FRET como AB-FRET se pueden adaptar fácilmente para descubrir otras interacciones entre otras proteínas en planta.

Introduction

Las histonas deubiquitinasas de plantas juegan un papel importante en el control de la expresión génica mediante la modificación postraduccional de histonas, específicamente borrando sus marcas de monoubiquitilación1. Hasta ahora, OTLD1 es una de las pocas histonas deubiquitinasas vegetales caracterizadas a nivel molecular en Arabidopsis 2,3. OTLD1 elimina los grupos monoubiquitina de las moléculas de histonas H2B, promoviendo así la eliminación o adición de acetilación eucromática y modificaciones de metilación de histonas H3 en el gen dianacromatina 4,5. Además, OTLD1 interactúa con otra enzima modificadora de la cromatina, la histona lisina desmetilasa KDM1C, para afectar la supresión transcripcional de los genes diana 6,7.

La mayoría de las enzimas modificadoras de histonas carecen de capacidades de unión al ADN y, por lo tanto, no pueden reconocer directamente sus genes diana. Una posibilidad es que cooperen con las proteínas del factor de transcripción de unión al ADN que se unen a estas enzimas y las dirigen a sus objetivos de cromatina. Específicamente, en las plantas, se sabe que varias enzimas modificadoras de histonas importantes (es decir, histona metiltransferasas8,9, histona acetiltransferasas 10, histona desmetilasas 11 y complejos represivos Polycomb12,13,14) son reclutadas por factores de transcripción. De acuerdo con esta idea, recientemente, se propuso un posible mecanismo para el reclutamiento de OTLD1 a los promotores objetivo que se basa en interacciones proteína-proteína específicas de OTLD1 con un factor de transcripción LSH1015.

LSH10 pertenece a una familia de las proteínas vegetales ALOG (Arabidopsis LSH1 y Oryza G1) que funcionan como reguladores centrales del desarrollo 16,17,18,19,20,21,22. El hecho de que los miembros de la familia de proteínas ALOG contengan motivos de unión al ADN23 y exhiban las capacidades para la regulación transcripcional 22, la localización nuclear19 y la homodimerización24 respalda aún más la idea de que estas proteínas, incluida LSH10, pueden actuar como factores de transcripción específicos durante la regulación epigenética de la transcripción. Una de las principales técnicas experimentales utilizadas para caracterizar la interacción LSH10-OTLD1 in vivo es la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)15.

FRET es una técnica de imagen para detectar directamente interacciones de corto alcance entre proteínas dentro de <10 nm entre sí25 dentro de células vivas. Hay dos variaciones principales del enfoque FRET26: emisión sensibilizada (SE-FRET) (Figura 1A) y blanqueo aceptor (AB-FRET) (Figura 1B). En SE-FRET, las proteínas que interactúan, una de las cuales se marca con un fluorocromo donante (por ejemplo, proteína fluorescente verde, GFP) y la otra con un fluorocromo aceptor (por ejemplo, proteína fluorescente roja monomérica, mRFP27,28), transfieren no radiativamente la energía del estado excitado del donante al aceptor. Debido a que no se emiten fotones durante esta transferencia, se produce una señal fluorescente que tiene un espectro de emisión radiativo similar al del aceptor. En AB-FRET, las interacciones proteicas se detectan y cuantifican en función de la emisión radiativa elevada del donante cuando el aceptor se inactiva permanentemente por fotoblanqueo y, por lo tanto, no puede recibir la energía no radiativa transferida del donante (Figura 1). Es importante destacar que la ubicación subcelular de la fluorescencia FRET es indicativa de la localización de las proteínas que interactúan en la célula.

La capacidad de desplegar FRET en tejidos vivos y determinar la localización subcelular de las proteínas que interactúan simultáneamente con la detección de esta interacción per se, hace de FRET la técnica de elección para estudios y caracterización inicial de interacciones proteína-proteína in vivo. Una metodología comparable de imagen de fluorescencia in vivo, la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC)29,30,31,32, es un buen enfoque alternativo, aunque, a diferencia de FRET, BiFC puede producir falsos positivos debido al ensamblaje espontáneo de los reporteros de BiFC autofluorescentes 33, y la cuantificación de sus datos es menos precisa.

Este artículo comparte la experiencia exitosa en la implementación de técnicas SE-FRET y AB-FRET y presenta un protocolo para su implementación para investigar las interacciones entre OTLD1 y LSH10 en células vegetales.

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Protocol

Para el presente estudio se utilizaron Nicotiana benthamiana, cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens o GV3101.

1. Construcción de vectores FRET

  1. Seleccione etiquetas fluorescentes para el par FRET donante/aceptor.
    1. Utilice EGFP de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (ver Tabla de materiales) para generar el vector donante.
    2. Utilice mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (consulte Tabla de materiales) para generar el vector aceptor.
  2. Genere las construcciones FRET donante/aceptor utilizando una técnica de clonación de recombinación específica del sitio34, como el sistema de clonación de recombinación Gateway35.
    1. Amplificar las secuencias codificantes de las proteínas de interés36 (es decir, Arabidopsis OTLD1 y LSH10)15.
      NOTA: También es una buena idea utilizar un control negativo que represente un homólogo de una de las proteínas que interactúan, pero no se espera que muestre interacción; el estudio de interacción OTLD1-LSH10 emplea un homólogo de LSH10, LSH4, que no reconoce OTLD1. Los ADNc OTLD1, LSH10 y LSH4 se amplifican mediante PCR utilizando cebadores enumerados en la Tabla 1.
    2. Clonar OTLD1, LSH10 y LSH4 en el vector de entrada pDONR207 mediante la técnica de clonación de recombinación específica del sitio34.
    3. Utilice la Gateway LR Clonase II (consulte la Tabla de materiales) para transferir LSH10 y LSH4 de pDONR207 al vector binario de destino pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 para generar las construcciones donantes binarias p35S::LSH10-GFP (construcción probada) y p35S::LSH4-GFP (control negativo).
    4. Utilice la misma enzima disponible comercialmente (paso 1.2.3) para transferir OTLD1 de pDONR207 al vector binario de destino pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 para generar la construcción aceptora binaria p35S:: OTLD1-mRFP (construcción probada).
    5. PCR-amplíe36 mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 usando cebadores enumerados en la Tabla 1, clónelo por la técnica de clonación de recombinación en pDONR207, y luego use LR Clonase II para transferir mRFP a pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 para generar la construcción de fusión binaria p35S::mRFP-GFP (control positivo).
  3. Realizar la transformación de las construcciones donante y aceptora en Agrobacterium.
    1. Añadir 1 μg de cada plásmido de los pasos 1.2.3-1.2.5 a 100 μL del cultivo de células competentes de Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 o GV3101, preparadas utilizando protocolos estándar 37 u obtenidas comercialmente, e incubar a37 °C durante 5 min.
    2. Añadir 1 ml de medio LB (1% triptona, 0,5% de extracto de levadura y 1% de NaCl; ver Tabla de materiales) a la mezcla celular competente y agitar a 200 rpm y 28° C durante 1,5 h. Recoger las células por centrifugación a 3.000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
    3. Resuspender las células en 0,1 ml de medio LB mediante pipeteo y esparcirlas en agar LB suplementado con los antibióticos apropiados (por ejemplo, espectinomicina al 0,01% y rifampicina al 0,005%; ver Tabla de materiales). Cultivar a 28 °C durante 2 días.
    4. Elija colonias individuales e inocule cada una de ellas por separado en 1 ml de caldo LB complementado con los antibióticos apropiados.
    5. Cultivar las células a 28 °C durante 24 h y transferir 0,2 ml del cultivo a un tubo nuevo. Recoger las células por centrifugación a 10.000 × g durante 30 s a temperatura ambiente.
    6. Extraer ADN plásmido mediante un protocolo estándar para aislar plásmidos de células de Agrobacterium 38 y resuspender el ADN extraído en30 μL de agua. Para identificar las colonias que albergan los plásmidos deseados, utilice 2 μL de la preparación de ADN como plantilla para PCR con cebadores específicos de genes enumerados en la Tabla 1. Mezclar 0,7 ml del cultivo identificado con 0,3 ml de glicerol y almacenar a -80 °C.

2. Agroinfiltración

  1. Cultiva plantas de Nicotiana benthamiana .
    NOTA: A lo largo de todo el experimento, todas las plantas deben estar sanas.
    1. Siembre y cultive semillas de N. benthamiana en una maceta que contenga tierra húmeda a una alta densidad.
    2. Mantener las semillas plantadas en una cámara de crecimiento fijada a 23 °C con 16 h de ciclo de luz y 8 h de ciclo oscuro con una intensidad de luz de 150-170 μmol/m2s hasta que el diámetro del euphyll alcance los 0,5 cm.
    3. Transfiera las plántulas a macetas más grandes y permita que crezcan en la misma cámara con los mismos parámetros.
      NOTA: Las plantas están listas para la agroinfiltración cuando sus hojas más grandes tienen 5-7 cm de diámetro, generalmente dentro de 4-5 semanas. En plantas más pequeñas que son demasiado jóvenes, los efectos de la agroinfiltración serán demasiado severos para el análisis FRET.
  2. Preparar células bacterianas para la agroinfiltración.
    1. Cultivar cada colonia de Agrobacterium que contenga las construcciones FRET durante la noche en 5 ml de medio LB suplementado con los antibióticos apropiados (paso 1.3.3) y 150 μM de acetosiringona a 28 °C (ver Tabla de materiales).
    2. Centrifugar las células a 3.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Resuspender las células en tampón de agroinfiltración (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μM acetosyringone) a OD600 = 0.5.
    4. Combinar las células resuspendidas en una relación 1:1 v/v entre las células que albergan los constructos apropiados (paso 2.2.5).
    5. Para las agroinfiltraciones de doble construcción, mezclar las alícuotas de dos cultivos y, para las agroinfiltraciones de construcción simple, mezclar las alícuotas del mismo cultivo:
      1. Proteínas probadas: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bacterias que albergan las construcciones p35S::OTLD1-mRFP y p35S::LSH10-GFP).
      2. Control negativo: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bacterias que albergan las construcciones p35S::OTLD1-mRFP y p35S::LSH4-GFP).
      3. Control negativo: LSH10-GFP + mRFP libre (bacterias que albergan las construcciones p35S::LSH10-GFP y pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Control positivo: mRFP-GFP (bacterias que albergan la construcción p35S::mRFP-GFP).
    6. Incubar las células a 28 °C durante 0,5-1 h.
  3. Realizar agroinfiltración.
    1. Cargue el cultivo bacteriano en una jeringa sin aguja de 1 ml.
    2. Presione suave pero firmemente la boquilla de la jeringa contra el lado abaxial de las hojas de N. benthamiana completamente expandidas mientras sostiene la hoja con un dedo enguantado en el lado adaxial.
    3. Infiltrar hasta cuatro manchas en una hoja, tres hojas por planta, dos o tres plantas para cada cultivo bacteriano. Cambie los guantes entre muestras para evitar la contaminación cruzada.
    4. Mantener las plantas agroinfiltradas en la misma cámara de crecimiento en las mismas condiciones, como se describe en la etapa 2.1.2, durante 24 h a 36 h. No mantenga las plantas agroinfiltradas por más de 36 h, ya que esto reducirá la señal de fluorescencia.

3. Microscopía confocal

  1. Prepare portaobjetos de microscopio para la visualización de fluorescencia.
    1. Después de 24-36 h de la infiltración, use una cuchilla de afeitar para cortar cada hoja agroinfiltrada en trozos pequeños (2 mm x 4 mm) entre las venas.
    2. Coloque las piezas de la hoja en un portaobjetos de vidrio con la superficie de la hoja abaxial hacia arriba. Coloque una gota de agua en los trozos de la hoja y cúbralos con el vidrio de la cubierta. Golpee ligeramente el vidrio de la cubierta para eliminar las burbujas de aire.
    3. Encienda el microscopio y el láser (consulte la Tabla de materiales). Coloque el portaobjetos en el soporte de la etapa del microscopio para obtener imágenes bajo los parámetros FRET específicos (pasos 3.2 y 3.3).
    4. Comience las observaciones usando una lente objetivo 10x para identificar las células que exhiben las señales GFP y mRFP, y luego use una lente objetivo 40x para observaciones detalladas posteriores.
      NOTA: Es importante destacar que SE-FRET y AB-FRET generalmente se realizan en la misma muestra de tejido, lo que permite el uso de la misma configuración de canal (paso 3.2) excepto para el canal FRET, que se activa / desactiva para las observaciones SE-FRET y AB-FRET, respectivamente (pasos 3.2.2.3 y 3.3.1).
  2. Configure los parámetros para SE-FRET (Figura 1A).
    1. Abra la herramienta Adquisición multidimensional (MDA).
    2. Establecer un conjunto de tres canales confocales en el mismo campo de visión (Figura complementaria 1).
      1. Ajuste el canal donante (el canal GFP) para la excitación y emisión del fluorocromo donante con el láser de excitación de 405 nm y el filtro de emisión de 400-597 nm.
      2. Ajuste el canal aceptor (el canal mRFP) para la excitación y emisión del fluorocromo aceptor con el láser de excitación de 561 nm y el filtro de emisión de 400-597 nm.
        NOTA: El filtro de emisión para mRFP se estableció en 400-597 nm para separar la señal mRFP de la señal FRET a 597-617 nm (paso 3.2.2.3) y, por lo tanto, reducir la emisión de mRFP independiente de FRET.
      3. Ajuste el canal FRET para la excitación del donante y la emisión de los fluorocromos aceptores con el láser de excitación de 405 nm y el filtro de emisión de 597-617 nm.
    3. Ajuste la intensidad de excitación del donante a un nivel mínimo para observar FRET evitando el fotoblanqueo, reduciendo la eficiencia SE-FRET.
      NOTA: Esta intensidad de excitación se selecciona experimentalmente antes de realizar el procedimiento FRET para evitar el fotoblanqueo. Varía según el grosor de la hoja, la edad y el tiempo después de la sobreexpresión.
    4. Excite al donante y busque células que contengan la señal de fluorescencia esperada del aceptor.
    5. Seleccione la región que contiene la señal de fluorescencia de interés.
    6. Adquiera una secuencia de imagen SE-FRET pulsando el botón Snap .
      1. Imagen 10-15 células que expresan primero la construcción mRFP-GFP (control positivo); ajustar los parámetros de enfoque, zoom y ganancia inteligente para enfocar el área de interés que se va a capturar (Figura complementaria 2).
      2. Usando la misma configuración, imagen 10-15 celdas, cada una expresando OTLD1-mRFP, mRFP libre, LSH10-GFP o LSH4-GFP por separado.
        NOTA: Estas imágenes son adquiridas por el plug-in "PixFRET" de ImageJ (ver Tabla de materiales), que se utilizó para los análisis de datos FRET (paso 3.4.1) para determinar los valores de sangrado espectral (SBT) para los aceptantes y los donantes; estas imágenes son utilizadas por el software para generar las imágenes SE-FRET para los pares de proteínas OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP y LSH10-GFP + mRFP libre (paso 3.2.6.3).
      3. Además, utilizando la misma configuración, imagen 10-15 células que coexpresan pares de proteínas OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP y LSH10-GFP + mRFP libre.
  3. Configure los parámetros para AB-FRET (Figura 1B).
    1. Utilice los parámetros de canal donante y aceptor establecidos para SE-FRET (paso 3.2.2) pero apague el canal FRET.
    2. Establecer los parámetros para el fotoblanqueo del aceptor (mRFP) (Figura complementaria 3).
      1. Asegúrese de que el blanqueamiento comience después de cinco imágenes. Permita 200 iteraciones para cada blanqueador de área. Mantenga el 100% de intensidad láser a 561 nm.
      2. Mantener una duración de blanqueamiento de 45 s. Garantice una velocidad de escaneo de 512 x 512 píxeles a 400 Hz.
    3. Dibujar la región de la celda a blanquear; Por ejemplo, para las interacciones nucleares, las regiones de interés se dibujan alrededor de toda el área del núcleo celular39.
    4. Active el blanqueo pulsando el botón Iniciar experimento ; activando esta función se realizará el fotoblanqueo y se adquirirá la secuencia de imagen AB-FRET.
  4. Analizar los datos de FRET.
    1. Para analizar los datos SE-FRET, utilice el complemento "PixFRET" para que el software ImageJ genere imágenes corregidas de la eficiencia SE-FRET después de restar SBT40 (paso 3.2.6.2).
    2. Para analizar los datos de AB-FRET, calcule %AB-FRET como el porcentaje de aumento en la emisión de GFP después del fotoblanqueo de mRFP utilizando la siguiente fórmula41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, donde GFPpost es la emisión de GFP después del fotoblanqueo de mRFP, y GFPpre es la emisión de GFP antes del fotoblanqueo de mRFP.
    3. Al revisar las imágenes FRET, preste atención a la localización subcelular de la señal FRET.
      NOTA: En muchos casos, estos compartimentos celulares (por ejemplo, núcleo, cloroplastos, RE, etc.) se pueden identificar fácilmente y, como beneficio adicional de la técnica FRET, proporcionan pistas importantes sobre la función biológica de las proteínas que interactúan.

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Representative Results

La Figura 2 ilustra los resultados típicos de un experimento SE-FRET, en el que los núcleos celulares se registraron simultáneamente en tres canales (es decir, GFP donante, mRFP aceptor y SE-FRET). Estos datos se utilizaron para generar imágenes de eficiencia SE-FRET codificadas en una escala de pseudocolor. En esta escala, la transición de azul a rojo corresponde a un aumento en la eficiencia FRET, una medida de proximidad proteína-proteína de 0% a 100%. En este experimento representativo, la señal SE-FRET se registró en el núcleo celular, y su intensidad después de la coexpresión de LSH10 y OTLD1 fue comparable a la observada después de la expresión del mRFP-GFP (es decir, control positivo). No se observó SE-FRET en controles negativos (es decir, coexpresión de OTLD1-mRFP y LSH4-GFP o mRFP libre y LSH10-GFP).

Las interacciones LSH10-OTLD1 se cuantificaron utilizando AB-FRET. Con este fin, la fluorescencia GFP del donante se registró en el núcleo celular antes y después del fotoblanqueo del aceptor mRFP como series temporales de fotoblanqueo de las mediciones de fluorescencia del donante y aceptor (Figura complementaria 4). Las imágenes de los núcleos celulares registrados se presentaron en pseudocolor para cuantificar el cambio en la fluorescencia de GFP. La Figura 3 muestra que la coexpresión LSH10-GFP/OTLD1-mRFP resultó en un aumento de la fluorescencia del donante de GFP después de que el aceptor mRFP fue fotoblanqueado y perdió su capacidad de fluorescencia. Se observó un aumento similar en la fluorescencia del donante en el control positivo de mRFP-GFP pero no en los controles negativos de la coexpresión LSH4-GFP/OTLD1-mRFP o LSH10-GFP/mRFP, mientras que la fluorescencia aceptora se inactivó en todos los experimentos de fotoblanqueo. La Figura 4 muestra el análisis cuantitativo de los datos AB-FRET, demostrando el aumento estadísticamente significativo en la fluorescencia del donante (%AB-FRET) de aproximadamente el 13% después de coexpresar LSH10 y OTLD1. El control mRFP-GFP positivo produjo %AB-FRET de aproximadamente el 30%, mientras que los controles negativos no produjeron %AB-FRET. Tanto las imágenes SE-FRET como AB-FRET mostraron la señal FRET en el núcleo celular, consistente con la localización subcelular esperada para los complejos enzimáticos modificadores del factor de transcripción-histona, así como para la naturaleza nucleocitoplasmática de las proteínas GFP/mRFP34 (Figura 2 y Figura 3).

En resumen, los datos representativos muestran que este protocolo FRET se puede utilizar para demostrar y cuantificar las interacciones entre las enzimas modificadoras de histonas y los factores de transcripción y determinar su localización subcelular en células vegetales vivas.

Figure 1
Figura 1: Resumen esquemático de las técnicas SE-FRET y AB-FRET . (A) El principio básico de SE-FRET. Una de las proteínas probadas se marca con GFP, que actúa como fluorocromo donante, y la otra con mRFP, que actúa como fluorocromo aceptor. La molécula donante se excita y se registra la emisión del aceptor. Si las proteínas probadas interactúan entre sí de tal manera que se colocan a 10 nm entre sí, la energía del donante excitado se transfiere no radiativamente al aceptor, que luego se excita y emite fluorescencia en el canal de emisión FRET. Si no se produce ninguna interacción, no se transfiere energía del donante al aceptor y no se detecta ninguna emisión FRET por parte del aceptor. B) El principio básico del AB-FRET. Las proteínas probadas se marcan como se describe en (A) para SE-FRET. La molécula donante se excita, y si se produce la interacción entre las proteínas probadas, el donante excita al aceptor de una manera no radiativa, lo que resulta en FRET. Luego, el aceptor se inactiva permanentemente por fotoblanqueo, perdiendo así su capacidad de aceptar energía no radiativa del donante y emitir la fluorescencia FRET en el canal de emisión FRET; La fluorescencia emitida por el donante, por otro lado, aumenta porque el donante pierde menos energía por la transferencia no radiativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Interacción específica de LSH10 con OTLD1 en hojas de N. benthamiana detectadas por SE-FRET. Se muestran imágenes de tres canales de detección (donante, aceptor y SE-FRET) para las combinaciones de proteínas indicadas. Las imágenes de eficiencia SE-FRET se calcularon mediante la sustracción de sangrado espectral (SBT) y se muestran en pseudocolor, con los colores rojo y azul que significan la señal más alta y la más baja, respectivamente. (A) Señal de alta eficiencia SE-FRET producida por el control positivo mRFP-GFP. (B) Señal positiva de eficiencia SE-FRET producida por las proteínas LSH10-GFP y OTLD1-mRFP que interactúan. (C) La coexpresión de la proteína de control negativo LSH4-GFP y OTLD1-mRFP no produjo ninguna señal de eficiencia SE-FRET. (D) La coexpresión de la proteína mRFP libre de control negativo y LSH10-GFP no produjo señal de eficiencia SE-FRET. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Interacción específica de LSH10 con OTLD1 en hojas de N. benthamiana detectadas por AB-FRET. Se muestran imágenes de dos canales de detección (donante y aceptor) antes y después del fotoblanqueo para las combinaciones de proteínas indicadas. El círculo indica la región fotoblanqueada. AB-FRET, visualizado como un aumento en la fluorescencia de GFP después del fotoblanqueo de mRFP, se muestra usando pseudo-color con los colores rojo y azul, lo que significa la señal más alta y más baja, respectivamente. (A) Un aumento en la fluorescencia del donante GFP producido por el control positivo mRFP-GFP. (B) Un aumento en la fluorescencia del donante GFP producida por las proteínas LSH10-GFP y OTLD1-mRFP que interactúan. (C) La coexpresión de la proteína control negativa LSH4-GFP y OTLD1-mRFP produjo cambios insignificantes en la fluorescencia del donante GFP. (D) La coexpresión de la proteína mRFP libre de control negativo y LSH10-GFP produjo cambios insignificantes en la fluorescencia del donante de GFP. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Una cuantificación de AB-FRET. El aumento porcentual en la fluorescencia del donante de GFP después del fotoblanqueo de mRFP (%AB-FRET) se muestra para las combinaciones de proteínas indicadas. Las barras de error representan la media de n = 13 celdas para cada medición. La prueba t de dos colas determinó que las diferencias entre los valores medios son estadísticamente significativas para los valores de p *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001; P≥ 0,05 no son estadísticamente significativos (NS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre de la cartilla Secuencia (5ʹ a 3ʹ) Propósito
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag Amplificar OTLD1 a partir de ADNc
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttccgtggctttgcctttgcgtc Amplificar OTLD1 a partir de ADNc
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgtcctctccaagagaaagagg Amplificar LSH10 a partir de ADNc
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaac Amplificar LSH10 a partir de ADNc
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg Amplificar LSH4 a partir de ADNc
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc Amplificar LSH4 a partir de ADNc
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt Amplificar mRFP desde pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttggagatctgcggccgcgg Amplificar mRFP desde pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc Confirmar secuencias en pDONR207 mediante PCR y secuenciación de ADN
AttL2 gtaacatcagagattttgagacac Confirmar secuencias en pDONR207 mediante PCR y secuenciación de ADN
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct Confirmar secuencias en vectores de destino mediante PCR y secuenciación de ADN
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt Confirmar secuencias en vectores de destino mediante PCR y secuenciación de ADN
35S Promotor Fw ctatccttcgcaagacccttc Confirmar secuencias en vectores de destino por PCR

Tabla 1: Cebadores para clonación y confirmación de las secuencias clonadas en pDONOR207 y vectores de destino. Fw: cebadores delanteros; Rv, cebadores inversos.

Figura complementaria 1: Configuración de parámetros para canales confocales. (A) Captura de pantalla para la configuración de los parámetros de excitación y emisión para el canal donante (GFP). (B) Captura de pantalla para la configuración de parámetros de excitación y emisión para el canal aceptor (mRFP). (C) Captura de pantalla para la configuración de los parámetros de excitación y emisión para el canal FRET. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Ajuste de parámetros para la adquisición de imágenes SE-FRET de la muestra de interés. (A) Captura de pantalla para la configuración del parámetro del área de escaneo (es decir, tamaño de la imagen, velocidad de escaneo, dirección y promedio). (B) Captura de pantalla para la configuración del parámetro del canal GFP (es decir, láser, estenopeico, ganancia maestra y ganancia digital). (C) Captura de pantalla para la configuración del parámetro del canal mRFP (es decir, láser, estenopeico, ganancia maestra y ganancia digital). (D) Captura de pantalla para la configuración del parámetro del canal FRET (es decir, láser, estenopeico, ganancia maestra y ganancia digital). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Configuración de parámetros para el fotoblanqueo aceptor. (A) Captura de pantalla para la configuración del parámetro del área de escaneo (es decir, tamaño de la imagen, velocidad de escaneo, dirección y promedio). (B) Captura de pantalla para la configuración de la serie temporal y el parámetro de blanqueo de tiempo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Series temporales de las mediciones de fluorescencia donante y aceptor durante AP-FRET. Se determinó la cinética de la fluorescencia aceptora (mRFP) y donante (GFP) para las muestras indicadas antes, durante y después del período de fotoblanqueo. (A) Control positivo de mRFP-GFP. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) Control negativo LSH4-GFP + OTLD1-mRFP. (D) LSH10-GFP negativo + Control mRFP libre. Las líneas amarillas indican el período de tiempo de fotoblanqueo. Las curvas blancas trazan las mediciones de la cinética de fluorescencia. En cada panel, las imágenes superior e inferior muestran la cinética de la fluorescencia del aceptor (mRFP) y del donante (GFP), respectivamente. Tenga en cuenta que, naturalmente, la fluorescencia de GFP a menudo disminuye con el tiempo porque el láser fotoblanquea gradualmente la GFP en sí. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este protocolo FRET es simple y fácil de reproducir; También requiere una inversión mínima en suministro y utiliza equipos estándar para muchos laboratorios modernos. Específicamente, cinco características técnicas principales distinguen la versatilidad de este procedimiento. En primer lugar, las construcciones FRET se generan utilizando la recombinación específica del sitio, un enfoque de clonación que es fácil de usar, produce resultados precisos y ahorra tiempo en comparación con la clonación tradicional basada en enzimas de restricción. En segundo lugar, las plantas de N. benthamiana son fáciles de cultivar, producen cantidades relativamente grandes de tejido y están disponibles en la mayoría de los laboratorios. En tercer lugar, la agroinfiltración da como resultado la expresión transitoria de las construcciones entregadas y, por lo tanto, genera datos en un período de tiempo relativamente corto (es decir, 24-36 h) en comparación con los meses necesarios para producir plantas transgénicas. En cuarto lugar, la capacidad de entregar diferentes combinaciones de los constructos de interés por co-agroinfiltración permite probar las interacciones entre cualquier proteína. Por último, tanto SE-FRET como AB-FRET se pueden realizar secuencialmente en la misma muestra de tejido solo activando / apagando uno de los ajustes del canal láser. Cabe señalar, sin embargo, que la entrega de microbombardeo42 puede utilizarse como un enfoque alternativo para la entrega de constructo en los tejidos vegetales en lugar de la agroinfiltración; En este caso, el uso de vectores binarios requeridos para la agroinfiltración es innecesario.

Un paso crítico de este protocolo es seleccionar correctamente el par de fluorocromo donante y aceptor para optimizar la eficiencia de FRET. Deben considerarse los tres factores siguientes: 1) el espectro de emisión del donante debe superponerse al máximo al espectro de absorción del aceptor para maximizar la cantidad de energía transferida; 2) los espectros de emisión del donante y del aceptante deberán ser lo suficientemente diferentes para distinguirse entre sí y reducir al mínimo el SBT de la señal detectada por microscopía; (3) El aceptor debe tener una excitación directa mínima en el máximo de absorbancia del donante para minimizar la excitación del aceptor durante la excitación del donante. Los pares FRET donante/aceptor comunes utilizados son proteínas fluorescentes cian/amarillas y verdes/rojas (es decir, CFP/YFP y GFP/mRFP, respectivamente). Este protocolo utiliza el par GFP/mRFP porque es adecuado para la obtención de imágenes de células vivas y, a diferencia de los pares cian/amarillo FRET, exhibe baja fototoxicidad y bajo fotoblanqueo43. Convenientemente, la fusión traslacional entre el par FRET (es decir, mRFP-GFP) sirve como un control positivo FRET ideal.

Otro paso crítico es la selección de los controles negativos apropiados. Por ejemplo, en el caso de la interacción LSH10-OTLD1, el análisis FRET siempre debe incluir la expresión de OTLD1 solo, LSH10 solo y coexpresión de OTLD1 y LSH10 con proteínas para las cuales no se espera la interacción (es decir, LSH4 y mRFP libre, respectivamente). En cuanto a la elección de los controles negativos, los experimentos FRET pueden seguir las directrices sobre mejores prácticas para el uso de la técnica BiFC44, otro enfoque basado en imágenes de fluorescencia adaptado para la detección de interacciones proteicas en células vegetales vivas 29,30,31,32.

Finalmente, un factor que afecta la experimentación FRET es común a todos los experimentos en tejidos vegetales vivos, y se deriva de las condiciones fisiológicas variables de la planta, en general, y de las células transformadas agroinfiltradas, en particular, incluso cuando se mantienen bajo condiciones de crecimiento controlado. Esta variabilidad fisiológica puede contribuir a una cierta variabilidad de los datos FRET entre experimentos individuales, plantas e incluso hojas. Por lo tanto, es importante utilizar al menos dos plantas y tres hojas por planta para cada experimento y seleccionar hojas maduras y completamente expandidas para la agroinfiltración, ya que producen mejores imágenes.

Al igual que con todas las metodologías experimentales, FRET tiene sus limitaciones técnicas y basadas en el uso. Uno de estos factores limitantes es la naturaleza de la etiqueta autofluorescente y su ubicación dentro de la proteína de interés (por ejemplo, en el extremo amino o carboxilo), que puede interferir con las propiedades biológicas de esta proteína, como su patrón nativo de localización subcelular o la capacidad de reconocer sus interactores naturales. Antes del marcado, cada proteína de interés debe ser analizada, en la medida de lo posible, por sus características estructurales que pueden verse comprometidas por el marcado. En muchos casos, sin embargo, los parámetros de marcado deben determinarse empíricamente en función de las actividades conocidas de la proteína de interés. Otra limitación importante es la relativa sofisticación técnica de FRET, que requiere el uso de microscopía confocal con el hardware y software apropiados. A diferencia de varios otros métodos de interacción de proteínas, como el sistema híbrido de levadura (Y2H)45,46,47, FRET no es adecuado para identificar interacciones de proteínas mediante bibliotecas de expresión de cribado, especialmente pantallas de alto rendimiento 48. Además, como la mayoría de los ensayos realizados in vivo, FRET no es un sistema bioquímicamente puro y, por lo tanto, no detecta la posible participación de otros factores celulares desconocidos en la interacción.

La importancia de FRET con respecto a otros ensayos de interacciones de proteínas radica en su detección de interacciones a corta distancia, reduciendo las posibilidades de resultados falsos positivos, aplicabilidad para el despliegue in vivo en una variedad de células, tejidos y organismos (incluidas las plantas) y detección de la localización subcelular de las proteínas que interactúan. Muchas de estas características de FRET se encuentran en otros enfoques in vivo, como la luciferasa dividida 49,50 o BiFC29,30,31,32,33, entre los cuales BiFC es quizás el más utilizado. Otro ensayo de interacción ampliamente utilizado es Y2H45,46,47; Sin embargo, fuera de la investigación de la biología de la levadura, este ensayo utiliza un sistema experimental heterólogo, propenso a falsos positivos, y sus hallazgos requieren confirmación por otra técnica. Una variación conceptual de Y2H es un ensayo de ubiquitina dividida que es más adecuado para detectar interacciones entre proteínas de membrana51,52 y que exhibe limitaciones relativas a FRET que es similar a Y2H. Finalmente, las interacciones proteicas pueden ser detectadas por co-inmunoprecipitación (co-IP), que se aplica a la detección en un ambiente complejo de extractos celulares, así como en reacciones in vitro definidas con precisión53,54,55; en nuestra experiencia, co-IP es más útil como un método alternativo e independiente para confirmar los datos obtenidos utilizando los enfoques in vivo basados en fluorescencia.

Mientras que este protocolo FRET específico se desarrolló para estudiar las interacciones entre los factores de transcripción de las plantas y las enzimas modificadoras de histonas, se puede utilizar para descubrir y caracterizar las interacciones entre muchas otras clases de proteínas en planta.

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Disclosures

No se declararon conflictos de intereses.

Acknowledgments

El trabajo en el laboratorio de V.C. es apoyado por subvenciones de NIH (R35GM144059 y R01GM50224), NSF (MCB1913165 e IOS1758046) y BARD (IS-5276-20) a V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

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Biología Número 188 Enzimas modificadoras de histonas (HMEs) factores de transcripción (TFs) interacciones proteína-proteína FRET
Investigación de las interacciones entre las enzimas modificadoras de histonas y los factores de transcripción <em>in vivo</em> mediante la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia
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Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

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