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Biology

Étude des interactions entre les enzymes modifiant l’histone et les facteurs de transcription in vivo par transfert d’énergie par résonance de fluorescence

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) est une technique d’imagerie permettant de détecter les interactions protéiques dans les cellules vivantes. Ici, un protocole FRET est présenté pour étudier l’association des enzymes modifiant les histones avec des facteurs de transcription qui les recrutent vers les promoteurs cibles de la régulation épigénétique de l’expression génique dans les tissus végétaux.

Abstract

La régulation épigénétique de l’expression génique est généralement affectée par les enzymes modifiant les histones (HME) qui génèrent des marques d’histones hétérochromatiques ou euchromatiques pour la répression transcriptionnelle ou l’activation, respectivement. Les HME sont recrutés pour leur chromatine cible par des facteurs de transcription (TF). Ainsi, la détection et la caractérisation des interactions directes entre les HME et les TF sont essentielles pour mieux comprendre leur fonction et leur spécificité. Ces études seraient plus pertinentes sur le plan biologique si elles étaient réalisées in vivo dans des tissus vivants. Ici, un protocole est décrit pour visualiser les interactions dans les feuilles des plantes entre une histone déubiquitinase végétale et un facteur de transcription de la plante en utilisant le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET), ce qui permet la détection de complexes entre des molécules de protéines qui se trouvent à moins de <10 nm les unes des autres. Deux variantes de la technique FRET sont présentées : SE-FRET (émission sensibilisée) et AB-FRET (blanchiment accepteur), dans lesquelles l’énergie est transférée non radiativement du donneur à l’accepteur ou émise radiativement par le donneur lors du photoblanchiment de l’accepteur. Les approches SE-FRET et AB-FRET peuvent être facilement adaptées pour découvrir d’autres interactions entre d’autres protéines in planta.

Introduction

Les histone déubiquitinases végétales jouent un rôle important dans le contrôle de l’expression génique par modification post-traductionnelle des histones, notamment en effaçant leurs marques de monoubiquitylation1. Jusqu’à présent, OTLD1 est l’une des rares histone déubiquitinases végétales caractérisées au niveau moléculaire chez Arabidopsis 2,3. OTLD1 élimine les groupes monoubiquitine des molécules d’histones H2B, favorisant ainsi l’élimination ou l’ajout d’acétylation euchromatique et de modifications de méthylation des histones H3 dans le gène cible chromatine 4,5. De plus, OTLD1 interagit avec une autre enzyme modifiant la chromatine, l’histone lysine déméthylase KDM1C, pour affecter la suppression transcriptionnelle des gènes cibles 6,7.

La plupart des enzymes modifiant les histones n’ont pas de capacités de liaison à l’ADN et ne peuvent donc pas reconnaître directement leurs gènes cibles. Une possibilité est qu’ils coopèrent avec les protéines du facteur de transcription liant l’ADN qui lient ces enzymes et les dirigent vers leurs cibles de chromatine. Plus précisément, chez les plantes, plusieurs enzymes importantes modifiant les histones (c.-à-d. les histone méthyltransférases8,9, les histone acétyltransférases 10, les histone déméthylases 11 et les complexes répressifs Polycomb12,13,14) sont connues pour être recrutées par des facteurs de transcription. Conformément à cette idée, récemment, un mécanisme possible pour le recrutement d’OTLD1 chez les promoteurs cibles a été proposé, basé sur des interactions protéine-protéine spécifiques d’OTLD1 avec un facteur de transcription LSH1015.

LSH10 appartient à une famille de protéines végétales ALOG (Arabidopsis LSH1 et Oryza G1) qui fonctionnent comme régulateurs centraux du développement 16,17,18,19,20,21,22. Le fait que les membres de la famille des protéines ALOG contiennent des motifs de liaison à l’ADN23 et présentent les capacités de régulation transcriptionnelle 22, de localisation nucléaire19 et d’homodimérisation24 renforce l’idée que ces protéines, y compris LSH10, peuvent agir comme facteurs de transcription spécifiques lors de la régulation épigénétique de la transcription. L’une des principales techniques expérimentales utilisées pour caractériser l’interaction LSH10-OTLD1 in vivo est le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET)15.

FRET est une technique d’imagerie permettant de détecter directement les interactions à courte distance entre les protéines à <10 nm les unes des autres25 à l’intérieur des cellules vivantes. Il existe deux variantes principales de l’approche FRET26: l’émission sensibilisée (SE-FRET) (figure 1A) et le blanchiment accepteur (AB-FRET) (figure 1B). Dans le SE-FRET, les protéines en interaction - dont l’une est marquée avec un fluorochrome donneur (par exemple, protéine fluorescente verte, GFP) et l’autre avec un fluorochrome accepteur (par exemple, protéine fluorescente rouge monomère, mRFP27,28) - transfèrent non radiativement l’énergie de l’état excité du donneur à l’accepteur. Parce qu’aucun photon n’est émis pendant ce transfert, un signal fluorescent est produit qui a un spectre d’émission radiatif similaire à celui de l’accepteur. Dans l’AB-FRET, les interactions protéiques sont détectées et quantifiées en fonction de l’émission radiative élevée du donneur lorsque l’accepteur est inactivé en permanence par photoblanchiment et est donc incapable de recevoir l’énergie non radiative transférée du donneur (Figure 1). Il est important de noter que l’emplacement subcellulaire de la fluorescence FRET indique la localisation des protéines en interaction dans la cellule.

La capacité de déployer FRET dans les tissus vivants et de déterminer la localisation subcellulaire des protéines en interaction simultanément avec la détection de cette interaction en soi, fait de FRET la technique de choix pour les études et la caractérisation initiale des interactions protéine-protéine in vivo. Une méthodologie d’imagerie par fluorescence in vivo comparable, la complémentarité par fluorescence bimoléculaire (BiFC)29,30,31,32, est une bonne approche alternative, bien que, contrairement au FRET, le BiFC puisse produire des faux positifs en raison de l’assemblage spontané des rapporteurs BiFC autofluorescents 33, et la quantification de ses données est moins précise.

Cet article partage l’expérience réussie dans la mise en œuvre des techniques SE-FRET et AB-FRET et présente un protocole pour leur déploiement afin d’étudier les interactions entre OTLD1 et LSH10 dans les cellules végétales.

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Protocol

Nicotiana benthamiana, la souche EHA105 d’Agrobacterium tumefaciens ou GV3101 ont été utilisées pour la présente étude.

1. Construction de vecteurs FRET

  1. Sélectionnez des étiquettes fluorescentes pour la paire donneur/accepteur FRET.
    1. Utilisez l’EGFP de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (voir le tableau des matériaux) pour générer le vecteur donneur.
    2. Utilisez mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (voir Tableau des matériaux) pour générer le vecteur accepteur.
  2. Générer les constructions FRET donneur/accepteur à l’aide d’une technique de clonage par recombinaison spécifique au site34, telle que le système de clonage par recombinaison Gateway35.
    1. Amplifier les séquences codantes des protéines d’intérêt36 (c.-à-d. Arabidopsis OTLD1 et LSH10)15.
      REMARQUE : C’est aussi une bonne idée d’utiliser un témoin négatif qui représente un homologue de l’une des protéines en interaction, mais qui ne devrait pas présenter d’interaction; l’étude d’interaction OTLD1-LSH10 utilise un homologue de LSH10, LSH4, qui ne reconnaît pas OTLD1. Les ADNc OTLD1, LSH10 et LSH4 sont amplifiés par PCR à l’aide des amorces énumérées dans le tableau 1.
    2. Cloner OTLD1, LSH10 et LSH4 dans le vecteur d’entrée pDONR207 par la technique de clonage par recombinaison spécifique au site 34.
    3. Utilisez la passerelle LR Clonase II (voir le tableau des matériaux) pour transférer LSH10 et LSH4 de pDONR207 dans le vecteur de destination binaire pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 pour générer les constructions donneuses binaires p35S::LSH10-GFP (construction testée) et p35S::LSH4-GFP (contrôle négatif).
    4. Utiliser la même enzyme disponible dans le commerce (étape 1.2.3) pour transférer OTLD1 de pDONR207 dans le vecteur de destination binaire pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 pour générer la construction accepteur binaire p35S:: OTLD1-mRFP (construction testée).
    5. Amplifier par PCR36 mRFP à partir de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 à l’aide des amorces répertoriées dans le Tableau 1, cloner par la technique de clonage par recombinaison dans pDONR207, puis utiliser LR Clonase II pour transférer mRFP dans pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 pour générer la construction de fusion binaire p35S::mRFP-GFP (contrôle positif).
  3. Effectuer la transformation des constructions donneuses et accepteuses en Agrobacterium.
    1. Ajouter 1 μg de chaque plasmide des étapes 1.2.3-1.2.5 à 100 μL de la culture de cellules compétentes de la souche EHA105 ou GV3101 d’Agrobacterium tumefaciens , préparée selon les protocoles standard 37 ou obtenue commercialement, et incuber à37 °C pendant 5 min.
    2. Ajouter 1 mL de milieu LB (1 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure et 1 % de NaCl; voir le tableau des matières) au mélange cellulaire compétent et agiter à 200 rpm et 28 °C pendant 1,5 h. Recueillir les cellules par centrifugation à 3 000 × g pendant 1 min à température ambiante.
    3. Resuspendre les cellules dans 0,1 mL de milieu LB par pipetage et les étaler sur gélose LB additionnée avec les antibiotiques appropriés (p. ex. spectinomycine à 0,01 % et rifampicine à 0,005 %; voir le tableau des matières). Cultiver à 28 °C pendant 2 jours.
    4. Choisissez des colonies individuelles et inoculez chacune d’elles séparément dans 1 mL de bouillon LB complété par les antibiotiques appropriés.
    5. Cultiver les cellules à 28 °C pendant 24 h et transférer 0,2 mL de la culture dans un nouveau tube. Recueillir les cellules par centrifugation à 10 000 × g pendant 30 s à température ambiante.
    6. Extraire l’ADN plasmidique par un protocole standard pour isoler les plasmides des cellules d’Agrobacterium 38 et remettre en suspension l’ADN extrait dans30 μL d’eau. Pour identifier les colonies hébergeant les plasmides souhaités, utilisez 2 μL de la préparation d’ADN comme modèle pour la PCR avec des amorces spécifiques aux gènes énumérées dans le tableau 1. Mélanger 0,7 mL de la culture identifiée avec 0,3 mL de glycérol et conserver à -80 °C.

2. Agroinfiltration

  1. Cultivez des plantes de Nicotiana benthamiana .
    REMARQUE: Tout au long de l’expérience, toutes les plantes doivent être en bonne santé.
    1. Semez et cultivez des graines de N. benthamiana dans un pot contenant un sol humide à haute densité.
    2. Conserver les graines plantées dans une chambre de croissance réglée à 23 °C avec 16 h de lumière et 8 h de cycle sombre avec une intensité lumineuse de 150-170 μmol/m2s jusqu’à ce que le diamètre de l’euphylle atteigne 0,5 cm.
    3. Transférez les plants dans des pots plus grands et laissez-les pousser dans la même chambre avec les mêmes paramètres.
      REMARQUE: Les plantes sont prêtes pour l’agroinfiltration lorsque leurs plus grandes feuilles ont un diamètre de 5 à 7 cm, généralement dans les 4 à 5 semaines. Dans les petites usines trop jeunes, les effets de l’agroinfiltration seront trop graves pour l’analyse FRET.
  2. Préparer les cellules bactériennes pour l’agroinfiltration.
    1. Cultiver chaque colonie d’Agrobacterium contenant les constructions FRET pendant la nuit dans 5 mL de milieu LB complété par les antibiotiques appropriés (étape 1.3.3) et 150 μM d’acétosyringone à 28 °C (voir le tableau des matières).
    2. Centrifuger les cellules à 3 000 × g pendant 5 min à température ambiante.
    3. Remettre les cellules en suspension dans un tampon agroinfiltration (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acétosyringone) à OD600 =0,5.
    4. Combiner les cellules remises en suspension dans un rapport de 1:1 v/v entre les cellules abritant les constructions appropriées (étape 2.2.5).
    5. Pour les agroinfiltrations à double construction, mélanger les aliquotes de deux cultures et, pour les agroinfiltrations à construction unique, mélanger les aliquotes de la même culture:
      1. Protéines testées : OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bactéries hébergeant les constructions p35S::OTLD1-mRFP et p35S::LSH10-GFP).
      2. Contrôle négatif : OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bactéries hébergeant les constructions p35S::OTLD1-mRFP et p35S::LSH4-GFP).
      3. Contrôle négatif : LSH10-GFP + mRFP libre (bactéries hébergeant les constructions p35S::LSH10-GFP et pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Contrôle positif : mRFP-GFP (bactéries hébergeant la construction p35S::mRFP-GFP).
    6. Incuber les cellules à 28 °C pendant 0,5-1 h.
  3. Effectuer l’agroinfiltration.
    1. Chargez la culture bactérienne dans une seringue sans aiguille de 1 mL.
    2. Pressez doucement mais fermement la buse de la seringue contre la face abaxiale des feuilles de N. benthamiana complètement dilatées tout en tenant la feuille avec un doigt ganté sur la face adaxiale.
    3. Infiltrer jusqu’à quatre taches sur une feuille, trois feuilles par plante, deux ou trois plantes pour chaque culture bactérienne. Changez de gants entre les échantillons pour éviter la contamination croisée.
    4. Maintenir les plantes agroinfiltrées dans la même chambre de croissance dans les mêmes conditions, telles que décrites à l’étape 2.1.2, pendant 24 h à 36 h. Ne conservez pas les plantes agroinfiltrées plus de 36 h, car cela réduirait le signal de fluorescence.

3. Microscopie confocale

  1. Préparez des lames de microscope pour la visualisation de la fluorescence.
    1. Après 24-36 h de l’infiltration, utiliser une lame de rasoir pour couper chaque feuille agroinfiltrée en petits morceaux (2 mm x 4 mm) entre les nervures.
    2. Placez les morceaux de feuilles sur une lame de verre avec la surface de la feuille abaxiale tournée vers le haut. Placez une goutte d’eau sur les morceaux de feuilles et recouvrez-les avec le verre de couverture. Tapotez légèrement le verre du couvercle pour éliminer les bulles d’air.
    3. Allumez le microscope et le laser (voir Tableau des matériaux). Placez la lame dans le support de la platine du microscope pour l’imagerie sous les paramètres FRET spécifiques (étapes 3.2 et 3.3).
    4. Commencez les observations à l’aide d’une lentille d’objectif 10x pour identifier les cellules qui présentent à la fois les signaux GFP et mRFP, puis utilisez une lentille d’objectif 40x pour les observations détaillées ultérieures.
      REMARQUE : Il est important de noter que SE-FRET et AB-FRET sont généralement effectués sur le même échantillon de tissu, ce qui permet l’utilisation des mêmes réglages de canal (étape 3.2), à l’exception du canal FRET, qui est activé/désactivé pour les observations SE-FRET et AB-FRET, respectivement (étapes 3.2.2.3 et 3.3.1).
  2. Configurez les paramètres pour SE-FRET (Figure 1A).
    1. Ouvrez l’outil Acquisition multidimensionnelle (MDA).
    2. Établir un ensemble de trois canaux confocaux dans le même champ de vision (figure supplémentaire 1).
      1. Réglez le canal donneur (le canal GFP) pour l’excitation et l’émission du fluorochrome donneur avec le laser d’excitation 405 nm et le filtre d’émission 400-597 nm.
      2. Réglez le canal accepteur (le canal mRFP) pour l’excitation et l’émission du fluorochrome accepteur avec le laser d’excitation 561 nm et le filtre d’émission 400-597 nm.
        REMARQUE: Le filtre d’émission pour mRFP a été réglé sur 400-597 nm pour séparer le signal mRFP du signal FRET à 597-617 nm (étape 3.2.2.3) et, par conséquent, réduire l’émission mRFP indépendante du FRET.
      3. Réglez le canal FRET pour l’excitation du donneur et l’émission des fluorochromes accepteurs avec le laser d’excitation 405 nm et le filtre d’émission 597-617 nm.
    3. Réglez l’intensité d’excitation du donneur à un niveau minimum pour observer le FRET tout en évitant le photoblanchiment, réduisant ainsi l’efficacité du SE-FRET.
      REMARQUE: Cette intensité d’excitation est sélectionnée expérimentalement avant d’effectuer la procédure FRET pour éviter le photoblanchiment. Il varie en fonction de l’épaisseur des feuilles, de l’âge et du temps après la surexpression.
    4. Excitez le donneur et recherchez des cellules contenant le signal de fluorescence attendu de l’accepteur.
    5. Sélectionnez la région qui contient le signal de fluorescence d’intérêt.
    6. Acquérir une séquence d’images SE-FRET en appuyant sur le bouton Snap .
      1. Image 10-15 cellules exprimant la construction mRFP-GFP (contrôle positif) en premier; ajustez les paramètres de mise au point, de zoom et de gain intelligent pour effectuer la mise au point sur la zone d’intérêt à capturer (Figure supplémentaire 2).
      2. En utilisant les mêmes paramètres, imagez 10 à 15 cellules, chacune exprimant OTLD1-mRFP, mRFP libre, LSH10-GFP ou LSH4-GFP séparément.
        NOTE: Ces images sont acquises par le plug-in « PixFRET » d’ImageJ (voir Tableau des matériaux), qui a été utilisé pour les analyses de données FRET (étape 3.4.1) pour déterminer les valeurs de bleed-through spectrale (SBT) pour les accepteurs et les donneurs; ces images sont utilisées par le logiciel pour générer les images SE-FRET pour les paires de protéines OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP et LSH10-GFP + mRFP libre (étape 3.2.6.3).
      3. En outre, en utilisant les mêmes paramètres, imagez 10-15 cellules co-exprimant OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP et LSH10-GFP + mRFP libre paires de protéines.
  3. Définissez les paramètres AB-FRET (Figure 1B).
    1. Utilisez les paramètres de canal donneur et accepteur définis pour SE-FRET (étape 3.2.2) mais désactivez le canal FRET.
    2. Définir les paramètres de photoblanchiment de l’accepteur (mRFP) (figure supplémentaire 3).
      1. Assurez-vous que le blanchiment commence après cinq images. Permettre 200 itérations pour chaque zone d’eau de Javel. Maintenez une intensité laser de 100 % à 561 nm.
      2. Maintenir une durée de blanchiment de 45 s. Assurez une vitesse de numérisation de 512 x 512 pixels à 400 Hz.
    3. Dessiner la région de la cellule à blanchir; Par exemple, pour les interactions nucléaires, les régions d’intérêt sont dessinées autour de toute la zone du noyau cellulaire39.
    4. Activez le blanchiment en appuyant sur le bouton Démarrer l’expérience ; l’activation de cette fonction effectuera le photoblanchiment et acquerra la séquence d’images AB-FRET.
  4. Analysez les données FRET.
    1. Pour analyser les données SE-FRET, utiliser le plug-in « PixFRET » du logiciel ImageJ pour générer des images corrigées de l’efficacité SE-FRET après soustraction du SBT40 (étape 3.2.6.2).
    2. Pour analyser les données AB-FRET, calculez %AB-FRET comme le pourcentage d’augmentation des émissions de GFP après photoblanchiment mRFP en utilisant la formule41 suivante : %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, où GFPpost est l’émission de GFP après photoblanchiment mRFP et GFPpre est l’émission de GFP avant photoblanchiment mRFP.
    3. Lors de l’examen des images FRET, faites attention à la localisation subcellulaire du signal FRET.
      REMARQUE : Dans de nombreux cas, ces compartiments cellulaires (p. ex., noyau, chloroplastes, RE, etc.) peuvent être facilement identifiés et, comme avantage supplémentaire de la technique FRET, fournissent des indices importants sur la fonction biologique des protéines en interaction.

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Representative Results

La figure 2 illustre les résultats typiques d’une expérience SE-FRET, dans laquelle les noyaux cellulaires ont été enregistrés simultanément dans trois canaux (c.-à-d. GFP du donneur, accepteur mRFP et SE-FRET). Ces données ont été utilisées pour générer des images de l’efficacité SE-FRET codées dans une pseudo-échelle de couleurs. Sur cette échelle, le passage du bleu au rouge correspond à une augmentation de l’efficacité du FRET, une mesure de la proximité protéine-protéine de 0% à 100%. Dans cette expérience représentative, le signal SE-FRET a été enregistré dans le noyau cellulaire, et son intensité après la coexpression de LSH10 et OTLD1 était comparable à celle observée après l’expression du mRFP-GFP (c’est-à-dire un contrôle positif). Aucun SE-FRET n’a été observé chez les témoins négatifs (c.-à-d. coexpression de OTLD1-mRFP et LSH4-GFP ou mRFP libre et LSH10-GFP).

Les interactions LSH10-OTLD1 ont été quantifiées à l’aide d’AB-FRET. À cette fin, la fluorescence GFP du donneur a été enregistrée dans le noyau cellulaire avant et après le photoblanchiment de l’accepteur mRFP en tant que série chronologique de photoblanchiment des mesures de fluorescence du donneur et de l’accepteur (figure supplémentaire 4). Les images des noyaux cellulaires enregistrés ont été présentées en pseudo-couleur pour quantifier le changement de fluorescence GFP. La figure 3 montre que la coexpression LSH10-GFP/OTLD1-mRFP a entraîné une augmentation de la fluorescence du donneur GFP après que l’accepteur mRFP ait été photoblanchi et ait perdu sa capacité à fluorescence. Une augmentation similaire de la fluorescence du donneur a été observée dans le contrôle positif mRFP-GFP, mais pas dans les contrôles négatifs de la coexpression LSH4-GFP/OTLD1-mRFP ou LSH10-GFP/mRFP, alors que la fluorescence accepteur a été inactivée dans toutes les expériences de photoblanchiment. La figure 4 montre l’analyse quantitative des données AB-FRET, démontrant l’augmentation statistiquement significative de la fluorescence du donneur (%AB-FRET) d’environ 13% après coexpression de LSH10 et OTLD1. Le contrôle mRFP-GFP positif a produit un %AB-FRET d’environ 30%, tandis que les témoins négatifs n’ont produit aucun %AB-FRET. Les images SE-FRET et AB-FRET ont montré le signal FRET dans le noyau cellulaire, ce qui correspond à la localisation subcellulaire attendue pour les complexes enzymatiques facteur de transcription-histone-modifiant ainsi que pour la nature nucléocytoplasmique des protéines GFP/mRFP34 (Figure 2 et Figure 3).

En résumé, les données représentatives montrent que ce protocole FRET peut être utilisé pour démontrer et quantifier les interactions entre les enzymes modifiant les histones et les facteurs de transcription et déterminer leur localisation subcellulaire dans les cellules végétales vivantes.

Figure 1
Figure 1: Résumé schématique des techniques SE-FRET et AB-FRET. (A) Le principe de base du SE-FRET. L’une des protéines testées est marquée avec GFP, qui agit comme un fluorochrome donneur, et l’autre avec mRFP, qui agit comme un fluorochrome accepteur. La molécule donneuse est excitée et l’émission acceptrice est enregistrée. Si les protéines testées interagissent les unes avec les autres de telle sorte qu’elles sont positionnées à moins de 10 nm l’une de l’autre, l’énergie du donneur excité est transférée non radiativement à l’accepteur, qui devient alors excité et émet une fluorescence dans le canal d’émission FRET. Si aucune interaction ne se produit, aucune énergie n’est transférée du donneur à l’accepteur et aucune émission de FRET par l’accepteur n’est détectée. (B) Le principe de base de l’AB-FRET. Les protéines testées sont marquées comme décrit en (A) pour SE-FRET. La molécule donneuse est excitée, et si l’interaction entre les protéines testées se produit, le donneur excite l’accepteur d’une manière non radiative, ce qui entraîne FRET. Ensuite, l’accepteur est inactivé de façon permanente par photoblanchiment, perdant ainsi sa capacité à accepter l’énergie non radiative du donneur et à émettre la fluorescence FRET dans le canal d’émission FRET; La fluorescence émise par le donneur, en revanche, est augmentée car le donneur perd moins d’énergie par le transfert non radiatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Interaction spécifique de LSH10 avec OTLD1 dans les feuilles de N. benthamiana détectées par SE-FRET. Des images provenant de trois canaux de détection (donneur, accepteur et SE-FRET) sont présentées pour les combinaisons de protéines indiquées. Les images d’efficacité SE-FRET ont été calculées par soustraction de bleed-through spectral (SBT) et sont montrées en pseudo-couleur, les couleurs rouge et bleu signifiant respectivement le signal le plus élevé et le plus bas. (A) Signal d’efficacité SE-FRET élevé produit par la commande positive mRFP-GFP. (B) Signal d’efficacité SE-FRET positif produit par les protéines LSH10-GFP et OTLD1-mRFP en interaction. (C) La coexpression de la protéine témoin négative LSH4-GFP et de l’OTLD1-mRFP n’a produit aucun signal d’efficacité SE-FRET. (D) La coexpression de la protéine mRFP sans contrôle négatif et du LSH10-GFP n’a produit aucun signal d’efficacité SE-FRET. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Interaction spécifique de LSH10 avec OTLD1 dans les feuilles de N. benthamiana détectées par AB-FRET. Des images provenant de deux canaux de détection (donneur et accepteur) avant et après photoblanchiment sont montrées pour les combinaisons de protéines indiquées. Le cercle indique la région photoblanchie. AB-FRET, visualisé comme une augmentation de la fluorescence GFP après photoblanchiment mRFP, est affiché en utilisant une pseudo-couleur avec les couleurs rouge et bleu, signifiant le signal le plus élevé et le plus bas, respectivement. (A) Une augmentation de la fluorescence du donneur GFP produite par le témoin positif mRFP-GFP. (B) Une augmentation de la fluorescence du donneur GFP produite par les protéines LSH10-GFP et OTLD1-mRFP en interaction. (C) La coexpression de la protéine témoin négative LSH4-GFP et de l’OTLD1-mRFP a produit des changements négligeables dans la fluorescence du donneur de GFP. (D) La coexpression de la protéine mRFP sans contrôle négatif et de LSH10-GFP a produit des changements négligeables dans la fluorescence du donneur GFP. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Quantification de l’AB-FRET. Le pourcentage d’augmentation de la fluorescence du donneur GFP après photoblanchiment mRFP (%AB-FRET) est indiqué pour les combinaisons de protéines indiquées. Les barres d’erreur représentent la moyenne pour n = 13 cellules pour chaque mesure. Le test t bilatéral a permis de déterminer que les différences entre les valeurs moyennes sont statistiquement significatives pour les valeurs p *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001; p≥ 0,05 ne sont pas statistiquement significatifs (NS). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom de l’amorce Séquence (5ʹ à 3ʹ) But
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag Amplifier OTLD1 à partir de l’ADNc
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttccgtggctttgcctttgcgtc Amplifier OTLD1 à partir de l’ADNc
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaaagcaggctcaatgtcctccaagagaaagagg Amplifier LSH10 à partir de l’ADNc
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaac Amplifier LSH10 à partir de l’ADNc
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg Amplifier LSH4 à partir de l’ADNc
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc Amplifier LSH4 à partir de l’ADNc
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggcctcccccgaggacgt Amplifier mRFP à partir de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttggagatctgcggccgcgg Amplifier mRFP à partir de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc Confirmer les séquences dans pDONR207 par PCR et séquençage de l’ADN
AttL2 gtaacatcagagattttgagacac Confirmer les séquences dans pDONR207 par PCR et séquençage de l’ADN
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct Confirmer les séquences dans les vecteurs de destination par PCR et séquençage de l’ADN
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt Confirmer les séquences dans les vecteurs de destination par PCR et séquençage de l’ADN
35S Promoteur Fw ctatccttcgcaagacccttc Confirmer les séquences dans les vecteurs de destination par PCR

Tableau 1 : Amorces pour le clonage et confirmation des séquences clonées dans pDONOR207 et vecteurs de destination. Fw, amorces avant; Rv, amorces inversées.

Figure supplémentaire 1 : Définition des paramètres pour les canaux confocaux. (A) Capture d’écran de la configuration des paramètres d’excitation et d’émission pour le canal donneur (GFP). (B) Capture d’écran de la configuration des paramètres d’excitation et d’émission pour le canal accepteur (mRFP). (C) Capture d’écran de la configuration des paramètres d’excitation et d’émission pour le canal FRET. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2: Paramètres d’ajustement pour l’acquisition d’images SE-FRET de l’échantillon d’intérêt. (A) Capture d’écran de la configuration des paramètres de la zone de numérisation (c.-à-d. taille de l’image, vitesse de numérisation, direction et moyenne). (B) Capture d’écran pour la configuration des paramètres du canal GFP (c.-à-d. laser, trou d’épingle, gain principal et gain numérique). (C) Capture d’écran pour la configuration des paramètres du canal mRFP (c.-à-d. laser, sténopé, gain principal et gain numérique). (D) Capture d’écran pour la configuration des paramètres du canal FRET (c.-à-d. laser, sténopé, gain principal et gain numérique). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Réglage des paramètres pour le photoblanchiment de l’accepteur. (A) Capture d’écran de la configuration des paramètres de la zone de numérisation (c.-à-d. taille de l’image, vitesse de numérisation, direction et moyenne). (B) Capture d’écran de la série chronologique et de la configuration des paramètres de blanchiment temporel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Séries chronologiques des mesures de fluorescence du donneur et de l’accepteur au cours de l’AP-FRET. La cinétique de la fluorescence de l’accepteur (mRFP) et du donneur (GFP) a été déterminée pour les échantillons indiqués avant, pendant et après la période de photoblanchiment. (A) Contrôle mRFP-GFP positif. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) Contrôle LSH4-GFP + OTLD1-mRFP négatif. (D) LSH10-GFP négatif + contrôle mRFP libre. Les lignes jaunes indiquent la période de photoblanchiment. Les courbes blanches tracent les mesures de la cinétique de fluorescence. Dans chaque panneau, les images supérieure et inférieure montrent respectivement la cinétique de la fluorescence de l’accepteur (mRFP) et du donneur (GFP). Notez que, naturellement, la fluorescence GFP diminue souvent avec le temps car le laser photoblanchit progressivement la GFP elle-même. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ce protocole FRET est simple et facile à reproduire ; Il nécessite également un investissement minimal en fournitures et utilise un équipement standard pour de nombreux laboratoires modernes. Plus précisément, cinq caractéristiques techniques principales distinguent la polyvalence de cette procédure. Tout d’abord, les constructions FRET sont générées à l’aide d’une recombinaison spécifique au site, une approche de clonage facile à utiliser, produisant des résultats précis et permettant de gagner du temps par rapport au clonage traditionnel à base d’enzymes de restriction. Deuxièmement, les plantes de N. benthamiana sont simples à cultiver, produisent des quantités relativement importantes de tissus et sont disponibles dans la plupart des laboratoires. Troisièmement, l’agroinfiltration entraîne une expression transitoire des constructions livrées et, par conséquent, génère des données dans un laps de temps relativement court (c.-à-d. 24-36 h) par rapport aux mois nécessaires pour produire des plantes transgéniques. Quatrièmement, la capacité de fournir différentes combinaisons des constructions d’intérêt par co-agroinfiltration permet de tester les interactions entre toutes les protéines. Enfin, SE-FRET et AB-FRET peuvent être effectués séquentiellement sur le même échantillon de tissu uniquement en activant / désactivant l’un des réglages du canal laser. Il convient toutefois de noter que l’administration par microbombardement42 peut être utilisée comme une approche alternative pour la construction de l’administration dans les tissus végétaux au lieu de l’agroinfiltration; Dans ce cas, l’utilisation de vecteurs binaires nécessaires à l’agroinfiltration n’est pas nécessaire.

Une étape critique de ce protocole consiste à sélectionner correctement la paire fluorochrome donneuse et accepteur afin d’optimiser l’efficacité du FRET. Les trois facteurs suivants doivent être pris en considération: 1) le spectre d’émission du donneur doit chevaucher au maximum le spectre d’absorption de l’accepteur pour maximiser la quantité d’énergie transférée; 2° les spectres d’émission du donneur et de l’accepteur doivent être suffisamment différents pour être distingués l’un de l’autre et pour minimiser la TAS du signal détecté par microscopie; (3) L’accepteur doit avoir une excitation directe minimale au maximum d’absorbance du donneur afin de minimiser l’excitation de l’accepteur pendant l’excitation du donneur. Les paires FRET donneur/accepteur couramment utilisées sont des protéines fluorescentes cyan/jaune et vert/rouge (c.-à-d. CFP/YFP et GFP/mRFP, respectivement). Ce protocole utilise la paire GFP/mRFP parce qu’il convient à l’imagerie de cellules vivantes et, contrairement aux paires FRET cyan/jaune, présente une faible phototoxicité et un faible photoblanchiment43. De manière pratique, la fusion translationnelle entre la paire FRET (c’est-à-dire mRFP-GFP) sert de contrôle positif FRET idéal.

Une autre étape critique est la sélection des contrôles négatifs appropriés. Par exemple, dans le cas de l’interaction LSH10-OTLD1, l’analyse FRET doit toujours inclure l’expression de OTLD1 seul, LSH10 seul et la coexpression d’OTLD1 et LSH10 avec des protéines pour lesquelles l’interaction n’est pas attendue (c’est-à-dire LSH4 et mRFP libre, respectivement). En ce qui concerne le choix des témoins négatifs, les expériences FRET peuvent suivre les lignes directrices sur les meilleures pratiques pour l’utilisation de la technique BiFC44, une autre approche basée sur l’imagerie par fluorescence adaptée à la détection des interactions protéiques dans les cellules végétales vivantes 29,30,31,32.

Enfin, un facteur affectant l’expérimentation FRET est commun à toutes les expériences sur les tissus végétaux vivants, et il découle des conditions physiologiques variables de la plante, en général, et des cellules transformées agroinfiltrées, en particulier, même lorsqu’elles sont maintenues dans des conditions de croissance contrôlées. Cette variabilité physiologique peut contribuer à une certaine variabilité des données FRET entre les expériences individuelles, les plantes et même les feuilles. Ainsi, il est important d’utiliser au moins deux plantes et trois feuilles par plante pour chaque expérience et de sélectionner des feuilles matures et complètement expansées pour l’agroinfiltration, car elles donnent de meilleures images.

Comme toutes les méthodologies expérimentales, FRET a ses limites techniques et basées sur l’utilisation. L’un de ces facteurs limitatifs est la nature de l’étiquette autofluorescente et son emplacement dans la protéine d’intérêt (par exemple, à l’extrémité amino- ou carboxyle), ce qui peut interférer avec les propriétés biologiques de cette protéine, telles que son modèle natif de localisation subcellulaire ou la capacité de reconnaître ses interacteurs naturels. Avant le marquage, chaque protéine d’intérêt doit être analysée, dans la mesure du possible, pour ses caractéristiques structurelles qui peuvent être compromises par le marquage. Dans de nombreux cas, cependant, les paramètres de marquage doivent être déterminés empiriquement en fonction des activités connues de la protéine d’intérêt. Une autre limitation majeure est la sophistication technique relative du FRET, qui nécessite l’utilisation de la microscopie confocale avec le matériel et les logiciels appropriés. Contrairement à plusieurs autres méthodes d’interaction protéique, telles que le système à deux hybrides de levure (Y2H)45,46,47, FRET ne convient pas pour identifier les interactions protéiques par criblage de bibliothèques d’expression, en particulier les cribles à haut débit 48. En outre, comme la plupart des essais effectués in vivo, le FRET n’est pas un système biochimiquement pur et, par conséquent, il ne détecte pas l’implication potentielle d’autres facteurs cellulaires inconnus dans l’interaction.

L’importance du FRET par rapport à d’autres tests d’interactions protéiques réside dans sa détection des interactions à courte distance, ce qui réduit les risques de résultats faussement positifs, son applicabilité au déploiement in vivo dans une variété de cellules, de tissus et d’organismes (y compris les plantes) et la détection de la localisation subcellulaire des protéines en interaction. Bon nombre de ces caractéristiques du FRET se retrouvent dans d’autres approches in vivo, telles que la luciférase fractionnée 49,50 ou la BiFC29,30,31,32,33, parmi lesquelles la BiFC est peut-être la plus couramment utilisée. Un autre test d’interaction largement utilisé est Y2H45,46,47; Cependant, en dehors de la recherche sur la biologie de la levure, ce test utilise un système expérimental hétérologue, sujet aux faux positifs, et ses résultats doivent être confirmés par une autre technique. Une variation conceptuelle de Y2H est un test d’ubiquitine fractionnée qui est mieux adapté pour détecter les interactions entre les protéines membranaires51,52 et qui présente des limites par rapport au FRET qui sont similaires à Y2H. Enfin, les interactions protéiques peuvent être détectées par co-immunoprécipitation (co-IP), qui s’applique à la détection dans un environnement complexe d’extraits cellulaires ainsi que dans des réactions in vitro précisément définies53,54,55 ; d’après notre expérience, la copropriété est très utile en tant que méthode alternative et indépendante pour confirmer les données obtenues à l’aide des approches in vivo fondées sur la fluorescence.

Alors que ce protocole FRET spécifique a été développé pour étudier les interactions entre les facteurs de transcription des plantes et les enzymes modifiant les histones, il peut être utilisé pour découvrir et caractériser les interactions entre de nombreuses autres classes de protéines inplanta.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Acknowledgments

Le travail dans le laboratoire de V.C. est soutenu par des subventions des NIH (R35GM144059 et R01GM50224), NSF (MCB1913165 et IOS1758046) et BARD (IS-5276-20) à V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

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Biologie numéro 188 Enzymes modifiant les histones (HME) facteurs de transcription (TF) interactions protéine-protéine FRET
Étude des interactions entre les enzymes modifiant l’histone et les facteurs de transcription <em>in vivo</em> par transfert d’énergie par résonance de fluorescence
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Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

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