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Biology

Investigando interações entre enzimas modificadoras de histonas e fatores de transcrição in vivo por transferência de energia de ressonância de fluorescência

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

A transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) é uma técnica de imagem para detectar interações proteicas em células vivas. Aqui, um protocolo FRET é apresentado para estudar a associação de enzimas modificadoras de histona com fatores de transcrição que as recrutam para os promotores alvo da regulação epigenética da expressão gênica em tecidos vegetais.

Abstract

A regulação epigenética da expressão gênica é comumente afetada por enzimas modificadoras de histonas (HMEs) que geram marcas de histonas heterocromáticas ou eucromáticas para repressão ou ativação transcricional, respectivamente. HMEs são recrutados para sua cromatina alvo por fatores de transcrição (TFs). Assim, detectar e caracterizar interações diretas entre HMEs e TFs são fundamentais para melhor compreensão de sua função e especificidade. Esses estudos seriam mais biologicamente relevantes se realizados in vivo dentro de tecidos vivos. Aqui, um protocolo é descrito para visualizar interações em folhas de plantas entre uma histona desubiquitinase vegetal e um fator de transcrição de plantas usando transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), que permite a detecção de complexos entre moléculas de proteína que estão dentro de <10 nm uma da outra. Duas variações da técnica de FRET são apresentadas: SE-FRET (emissão sensibilizada) e AB-FRET (clareamento aceptor), em que a energia é transferida não radiativamente do doador para o aceitador ou emitida radiativamente pelo doador após o fotobranqueamento do aceitador. Ambas as abordagens SE-FRET e AB-FRET podem ser adaptadas facilmente para descobrir outras interações entre outras proteínas na planta.

Introduction

As histonas desubiquitinases vegetais desempenham um papel importante no controle da expressão gênica pela modificação pós-translacional das histonas, especificamente apagando suas marcas de monoubiquitilação1. Até o momento, a OTLD1 é uma das poucas histonas desubiquitinases vegetais caracterizadas em nível molecular em Arabidopsis 2,3. O OTLD1 remove os grupos monoubiquitina das moléculas de histona H2B, promovendo assim a remoção ou adição de acetilação eucromática e modificações de metilação das histonas H3 no gene alvo da cromatina 4,5. Além disso, o OTLD1 interage com outra enzima modificadora da cromatina, a histona lisina desmetilase KDM1C, para afetar a supressão transcricional dos genes-alvo 6,7.

A maioria das enzimas modificadoras da histona não possui capacidades de ligação ao DNA e, portanto, não pode reconhecer seus genes-alvo diretamente. Uma possibilidade é que eles cooperem com proteínas do fator de transcrição de ligação ao DNA que se ligam a essas enzimas e as direcionam para seus alvos de cromatina. Especificamente, em plantas, várias enzimas modificadoras importantes da histona (isto é, histona metiltransferases 8,9, histonas acetiltransferases 10, histonas desmetilases 11 e complexos repressivos Polycomb12,13,14) são conhecidas por serem recrutadas por fatores de transcrição. Consistente com essa ideia, recentemente, foi proposto um possível mecanismo de recrutamento de OTLD1 para os promotores-alvo, que se baseia em interações proteína-proteína específicas de OTLD1 com um fator de transcrição LSH1015.

O LSH10 pertence a uma família de proteínas vegetais ALOG (Arabidopsis LSH1 e Oryza G1) que funcionam como reguladores centrais do desenvolvimento 16,17,18,19,20,21,22. O fato de os membros da família de proteínas ALOG conterem motivos de ligação ao DNA23 e exibirem as capacidades de regulação transcricional 22, localização nuclear19 e homodimerização24 dá mais suporte à noção de que essas proteínas, incluindo o LSH10, podem atuar como fatores de transcrição específicos durante a regulação epigenética da transcrição. Uma das principais técnicas experimentais utilizadas para caracterizar a interação LSH10-OTLD1 in vivo é a transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET)15.

FRET é uma técnica de imagem para detectar diretamente interações de curto alcance entre proteínas dentro de <10 nm umas das outras25 dentro de células vivas. Existem duas variações principais da abordagem FRET26: emissão sensibilizada (SE-FRET) (Figura 1A) e clareamento aceptor (AB-FRET) (Figura 1B). No SE-FRET, as proteínas que interagem - uma das quais é marcada com um fluorocromo do doador (por exemplo, proteína fluorescente verde, GFP) e a outra com um fluorocromo aceptor (por exemplo, proteína fluorescente vermelha monomérica, mRFP27,28) - transferem sem radiatividade a energia do estado excitado do doador para o aceitador. Como nenhum fóton é emitido durante essa transferência, é produzido um sinal fluorescente que tem um espectro de emissão radiativa semelhante ao do aceitador. No AB-FRET, as interações proteicas são detectadas e quantificadas com base na elevada emissão radiativa do doador quando o aceptor é permanentemente inativado pelo fotobranqueamento e, portanto, é incapaz de receber a energia não radiativa transferida do doador (Figura 1). É importante ressaltar que a localização subcelular da fluorescência FRET é indicativa da localização das proteínas que interagem na célula.

A capacidade de implantar FRET em tecidos vivos e determinar a localização subcelular das proteínas que interagem simultaneamente com a detecção dessa interação per se, torna FRET a técnica de escolha para estudos e caracterização inicial das interações proteína-proteína in vivo. Uma metodologia de imagem de fluorescência in vivo comparável, a complementação por fluorescência bimolecular (BiFC)29,30,31,32, é uma boa abordagem alternativa, embora, ao contrário do FRET, o BiFC possa produzir falsos positivos devido à montagem espontânea dos repórteres autofluorescentes do BiFC 33, e a quantificação de seus dados seja menos precisa.

Este artigo compartilha a experiência bem-sucedida na implementação das técnicas SE-FRET e AB-FRET e apresenta um protocolo para sua implantação para investigar as interações entre OTLD1 e LSH10 em células vegetais.

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Protocol

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 ou GV3101 foram utilizadas para o presente estudo.

1. Construção do vetor FRET

  1. Selecione etiquetas fluorescentes para o par FRET doador/aceitador.
    1. Use EGFP de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (ver Tabela de Materiais) para gerar o vetor doador.
    2. Use mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (consulte Tabela de Materiais) para gerar o vetor aceitador.
  2. Gerar as construções FRET doador/aceitador usando uma técnica de clonagem de recombinação específica do local34, como o sistema de clonagem de recombinação Gateway35.
    1. Amplificar as sequências codificadoras das proteínas de interesse36 (i.e., as Arabidopsis OTLD1 e LSH10)15.
      NOTA: Também é uma boa ideia utilizar um controle negativo que represente um homólogo de uma das proteínas que interagem, mas não se espera que exiba interação; o estudo de interação OTLD1-LSH10 emprega um homólogo de LSH10, LSH4, que não reconhece OTLD1. Os cDNAs OTLD1, LSH10 e LSH4 são amplificados por PCR usando primers listados na Tabela 1.
    2. Clone OTLD1, LSH10 e LSH4 no vetor de entrada pDONR207 pela técnica de clonagem de recombinação site-specific34.
    3. Use o Gateway LR Clonase II (consulte Tabela de Materiais) para transferir LSH10 e LSH4 de pDONR207 para o vetor de destino binário pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 para gerar as construções de doador binário p35S::LSH10-GFP (construção testada) e p35S::LSH4-GFP (controle negativo).
    4. Use a mesma enzima comercialmente disponível (etapa 1.2.3) para transferir OTLD1 de pDONR207 para o vetor de destino binário pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 para gerar a construção do aceitador binário p35S:: OTLD1-mRFP (construção testada).
    5. PCR-amplificar36 mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 usando primers listados na Tabela 1, cloná-lo pela técnica de clonagem de recombinação em pDONR207 e, em seguida, usar LR Clonase II para transferir mRFP para pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 para gerar a construção de fusão binária p35S::mRFP-GFP (controle positivo).
  3. Realizar a transformação dos edifícios doador e aceitador em Agrobactéria.
    1. Adicionar 1 μg de cada plasmídeo das etapas 1.2.3-1.2.5 a 100 μL da cultura de células competentes da estirpe EHA105 ou GV3101 de Agrobacterium tumefaciens , preparadas utilizando os protocolos padrão 37 ou obtidas comercialmente, e incubar a37 °C durante 5 min.
    2. Adicione 1 mL de meio LB (triptona a 1%, extrato de levedura a 0,5% e NaCl a 1%; ver Tabela de Materiais) à mistura celular competente e agite a 200 rpm e 28°C por 1,5 h. Recolher as células por centrifugação a 3.000 × g durante 1 min à temperatura ambiente.
    3. Ressuspender as células em 0,1 mL de meio LB pipetando e espalhá-las em ágar LB suplementado com os antibióticos apropriados (por exemplo, espectinomicina a 0,01% e rifampicina a 0,005%; ver Tabela de Materiais). Crescer a 28 °C durante 2 dias.
    4. Escolha colônias individuais e inocular cada uma delas separadamente em 1 mL de caldo LB suplementado com os antibióticos apropriados.
    5. Cultivar as células a 28 °C durante 24 h e transferir 0,2 ml da cultura para um novo tubo. Recolher as células por centrifugação a 10.000 × g durante 30 s à temperatura ambiente.
    6. Extrair o DNA plasmídico por um protocolo padrão para isolar plasmídeos de células Agrobacterium 38 e ressuspender o DNA extraído em30 μL de água. Para identificar as colônias que abrigam os plasmídeos desejados, utilizar 2 μL da preparação de DNA como molde para PCR com primers gene-específicos listados na Tabela 1. Misture 0,7 mL da cultura identificada com 0,3 mL de glicerol e armazene a -80 °C.

2. Agroinfiltração

  1. Cultive plantas de Nicotiana benthamiana .
    NOTA: Ao longo de todo o experimento, todas as plantas devem estar saudáveis.
    1. Semeie e cultive sementes de N. benthamiana em um vaso contendo solo úmido em alta densidade.
    2. Manter as sementes plantadas em câmara de crescimento fixada a 23 °C com 16 h de ciclo claro e 8 h de ciclo escuro com intensidade luminosa de 150-170 μmol/m2s até que o diâmetro do eufilo atinja 0,5 cm.
    3. Transfira as mudas para vasos maiores e deixe-as crescer na mesma câmara com os mesmos parâmetros.
      NOTA: As plantas estão prontas para a agroinfiltração quando suas folhas maiores têm 5-7 cm de diâmetro, geralmente dentro de 4-5 semanas. Em plantas menores que são muito jovens, os efeitos da agroinfiltração serão muito graves para a análise FET.
  2. Preparar células bacterianas para agroinfiltração.
    1. Cultivar cada colónia de Agrobacterium contendo os construtos de FRET durante a noite em 5 ml de meio LB suplementado com os antibióticos apropriados (passo 1.3.3) e acetosiringona de 150 μM a 28 °C (ver Tabela de Materiais).
    2. Centrifugar as células a 3.000 × g durante 5 min à temperatura ambiente.
    3. Ressuspender as células em tampão de agroinfiltração (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM de acetosiringona) para OD600 = 0,5.
    4. Combinar as células ressuspensas numa relação de 1:1 v/v entre as células que ostentem as construções apropriadas (passo 2.2.5).
    5. Para as agroinfiltrações de dupla construção, misture as alíquotas de duas culturas e, para as agroinfiltrações de construção única, misture as alíquotas da mesma cultura:
      1. Proteínas testadas: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bactérias que abrigam as construções p35S::OTLD1-mRFP e p35S::LSH10-GFP).
      2. Controle negativo: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bactérias que abrigam as construções p35S::OTLD1-mRFP e p35S::LSH4-GFP).
      3. Controle negativo: LSH10-GFP + mRFP livre (bactérias que abrigam as construções p35S::LSH10-GFP e pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. Controle positivo: mRFP-GFP (bactérias que abrigam a construção p35S::mRFP-GFP).
    6. Incubar as células a 28 °C durante 0,5-1 h.
  3. Realizar agroinfiltração.
    1. Carregue a cultura bacteriana em uma seringa sem agulha de 1 mL.
    2. Pressione suavemente, mas com firmeza, o bocal da seringa contra o lado abaxial das folhas de N. benthamiana totalmente expandidas, segurando a folha com um dedo enluvado no lado adaxial.
    3. Infiltre até quatro pontos em uma folha, três folhas por planta, duas ou três plantas para cada cultura bacteriana. Troque as luvas entre as amostras para evitar a contaminação cruzada.
    4. Manter as plantas agroinfiltradas na mesma câmara de crescimento nas mesmas condições, conforme descrito na etapa 2.1.2, por 24 h a 36 h. Não mantenha as plantas agroinfiltradas por mais de 36 h, pois isso reduzirá o sinal de fluorescência.

3. Microscopia confocal

  1. Prepare lâminas de microscópio para visualização por fluorescência.
    1. Após 24-36 h da infiltração, use uma lâmina de barbear para cortar cada folha agroinfiltrada em pequenos pedaços (2 mm x 4 mm) entre as veias.
    2. Coloque as peças foliares em uma lâmina de vidro com a superfície da folha abaxial voltada para cima. Coloque uma gota de água sobre os pedaços de folhas e cubra-os com o vidro da tampa. Bata levemente no vidro da tampa para remover as bolhas de ar.
    3. Ligue o microscópio e o laser (consulte Tabela de materiais). Colocar a lâmina no suporte do palco do microscópio para obtenção de imagens de acordo com os parâmetros FRET específicos (passos 3.2 e 3.3).
    4. Comece as observações usando uma lente objetiva de 10x para identificar células que exibem os sinais GFP e mRFP e, em seguida, use uma lente objetiva de 40x para observações detalhadas subsequentes.
      NOTA: É importante ressaltar que o SE-FRET e o AB-FRET geralmente são realizados na mesma amostra de tecido, permitindo o uso das mesmas configurações de canal (etapa 3.2), exceto para o canal FET, que é ativado/desativado para as observações SE-FRET e AB-FRE, respectivamente (etapas 3.2.2.3 e 3.3.1).
  2. Configure os parâmetros para SE-FRET (Figura 1A).
    1. Abra a ferramenta MDA (Multi-Dimensional Acquisition).
    2. Estabeleça um conjunto de três canais confocais no mesmo campo de visão (Figura 1 Suplementar).
      1. Ajuste o canal doador (o canal GFP) para excitação e emissão do fluorocromo doador com o laser de excitação de 405 nm e o filtro de emissão de 400-597 nm.
      2. Ajuste o canal aceptor (o canal mRFP) para excitação e emissão do fluorocromo aceptor com o laser de excitação de 561 nm e o filtro de emissão de 400-597 nm.
        NOTA: O filtro de emissão para mRFP foi ajustado em 400-597 nm para separar o sinal mRFP do sinal FRET em 597-617 nm (etapa 3.2.2.3) e, portanto, reduzir a emissão de mRFP independente de FRET.
      3. Ajuste o canal FRET para excitação do doador e emissão dos fluorocromos aceptores com o laser de excitação de 405 nm e o filtro de emissão de 597-617 nm.
    3. Defina a intensidade de excitação do doador em um nível mínimo para observar o FET, evitando o fotobranqueamento, reduzindo a eficiência do SE-FET.
      NOTA: Esta intensidade de excitação é selecionada experimentalmente antes da realização do procedimento FRET para evitar o fotobranqueamento. Varia dependendo da espessura da folha, idade e tempo após a superexpressão.
    4. Excite o doador e procure células que contenham o sinal de fluorescência esperado do aceitador.
    5. Selecione a região que contém o sinal de fluorescência de interesse.
    6. Adquira uma sequência de imagens SE-FRET pressionando o botão Snap .
      1. Imagem 10-15 células expressando o construto mRFP-GFP (controle positivo) primeiro; ajustar os parâmetros de foco, zoom e ganho inteligente para se concentrar na área de interesse a ser capturada (Figura 2 Suplementar).
      2. Usando as mesmas configurações, imagem de 10-15 células, cada uma expressando OTLD1-mRFP, mRFP livre, LSH10-GFP ou LSH4-GFP separadamente.
        NOTA: Essas imagens são adquiridas pelo plug-in "PixFRET" do ImageJ (ver Tabela de Materiais), que foi utilizado para a análise dos dados FRET (etapa 3.4.1) para determinar os valores de sangramento espectral (SBT) para os aceitadores e os doadores; essas imagens são usadas pelo software para gerar as imagens SE-FRET para os pares de proteínas OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP e LSH10-GFP + mRFP livre (etapa 3.2.6.3).
      3. Além disso, usando as mesmas configurações, imagem 10-15 células co-expressando OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP e LSH10-GFP + pares de proteínas mRFP livres.
  3. Configure parâmetros para AB-FRET (Figura 1B).
    1. Utilize os parâmetros do canal doador e do receptor definidos para SE-FRET (etapa 3.2.2), mas desligue o canal FRE.
    2. Defina os parâmetros para o fotobranqueamento do aceitador (mRFP) (Figura 3 Suplementar).
      1. Certifique-se de que o branqueamento comece após cinco imagens. Permita 200 iterações para cada alvejante da área. Mantenha 100% da intensidade do laser a 561 nm.
      2. Manter uma duração de branqueamento de 45 s. Garanta uma velocidade de digitalização de 512 x 512 pixels a 400 Hz.
    3. Desenhe a região da célula a ser branqueada; por exemplo, para interações nucleares, regiões de interesse são desenhadas em torno de toda a área do núcleo celular39.
    4. Ative o branqueamento pressionando o botão Iniciar experimento ; ativando esta função irá realizar o fotobranqueamento e adquirir a sequência de imagens AB-FET.
  4. Analise os dados FET.
    1. Para analisar os dados do SE-FET, use o plug-in "PixFRET" para o software ImageJ para gerar imagens corrigidas da eficiência do SE-FRET após a subtração do SBT40 (etapa 3.2.6.2).
    2. Para analisar os dados AB-FRET, calcule %AB-FRET como o aumento percentual na emissão de GFP após o fotobranqueamento mRFP usando a seguinte fórmula41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, onde GFPpost é a emissão de GFP após o fotobranqueamento mRFP e GFPpre é a emissão GFP antes do fotobranqueamento mRFP.
    3. Ao revisar as imagens FET, preste atenção à localização subcelular do sinal FET.
      NOTA: Em muitos casos, esses compartimentos celulares (por exemplo, núcleo, cloroplastos, RE, etc.) podem ser facilmente identificados e, como um benefício adicional da técnica FET, fornecem pistas importantes para a função biológica das proteínas que interagem.

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Representative Results

A Figura 2 ilustra os resultados típicos de um experimento SE-FET, no qual os núcleos celulares foram registrados simultaneamente em três canais (ou seja, GFP doador, mRFP aceitador e SE-FRET). Esses dados foram utilizados para gerar imagens de eficiência SE-FRET codificadas em uma escala de pseudo-cores. Nesta escala, a transição do azul para o vermelho corresponde a um aumento na eficiência do FET, uma medida da proximidade proteína-proteína de 0% a 100%. Neste experimento representativo, o sinal SE-FRET foi registrado no núcleo celular, e sua intensidade após a coexpressão de LSH10 e OTLD1 foi comparável à observada após a expressão do mRFP-GFP (ou seja, controle positivo). Nenhum SE-FRET foi observado em controles negativos (ou seja, coexpressão de OTLD1-mRFP e LSH4-GFP ou mRFP livre e LSH10-GFP).

As interações LSH10-OTLD1 foram quantificadas usando AB-FRET. Para tanto, a fluorescência da GFP do doador foi registrada no núcleo celular antes e após o fotobranqueamento do aceptor mRFP como séries temporais de fotobranqueamento das medidas de fluorescência do doador e do aceitador (Figura Suplementar 4). As imagens dos núcleos celulares registrados foram apresentadas em pseudocor para quantificar a mudança na fluorescência da GFP. A Figura 3 mostra que a coexpressão LSH10-GFP/OTLD1-mRFP resultou em um aumento da fluorescência do doador de GFP após o aceptor mRFP ser fotobranqueado e perder sua capacidade de fluorescer. Um aumento semelhante na fluorescência do doador foi observado no controle positivo mRFP-GFP, mas não nos controles negativos da coexpressão LSH4-GFP/OTLD1-mRFP ou LSH10-GFP/mRFP, enquanto a fluorescência do aceptor foi inativada em todos os experimentos de fotobranqueamento. A Figura 4 mostra a análise quantitativa dos dados AB-FET, demonstrando o aumento estatisticamente significativo da fluorescência do doador (%AB-FRET) de aproximadamente 13% após a coexpressão LSH10 e OTLD1. O controle positivo mRFP-GFP produziu %AB-FRET de aproximadamente 30%, enquanto os controles negativos não produziram %AB-FRET. As imagens SE-FRET e AB-FRET mostraram o sinal FRET no núcleo celular, consistente com a localização subcelular esperada para os complexos enzimáticos modificadores do fator de transcrição histona, bem como para a natureza nucleocitoplasmática das proteínas GFP/mRFP34 (Figura 2 e Figura 3).

Em resumo, os dados representativos mostram que este protocolo FRET pode ser usado para demonstrar e quantificar interações entre enzimas modificadoras de histonas e fatores de transcrição e determinar sua localização subcelular em células vegetais vivas.

Figure 1
Figura 1: Resumo esquemático das técnicas SE-FRET e AB-FRE . (A) O princípio básico do SE-FRET. Uma das proteínas testadas é marcada com GFP, que atua como um fluorocromo doador, e a outra com mRFP, que atua como um fluorocromo aceptor. A molécula doadora é excitada e a emissão do aceitador é registrada. Se as proteínas testadas interagirem umas com as outras de tal forma que estejam posicionadas dentro de 10 nm uma da outra, a energia do doador excitado é transferida não radiativamente para o aceitador, que então se torna excitado e emite fluorescência no canal de emissão FET. Se nenhuma interação ocorrer, nenhuma energia é transferida do doador para o aceitador, e nenhuma emissão de FRET pelo aceitador é detectada. (B) O princípio básico da AB-FRET. As proteínas testadas são marcadas conforme descrito em (A) para SE-FRET. A molécula doadora é excitada e, se ocorrer a interação entre as proteínas testadas, o doador excita o aceitador de forma não radiativa, resultando em FRET. Em seguida, o aceptor é permanentemente inativado por fotobranqueamento, perdendo assim sua capacidade de aceitar energia não radiativa do doador e emitir a fluorescência FRET no canal de emissão FET; a fluorescência emitida pelo doador, por outro lado, é aumentada porque o doador perde menos energia pela transferência não radiativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Interação específica do LSH10 com o OTLD1 em folhas de N. benthamiana detectadas pelo SE-FRET. Imagens de três canais de detecção (doador, aceitador e SE-FRET) são mostradas para as combinações de proteínas indicadas. As imagens de eficiência SE-FRET foram calculadas pela subtração do sangramento espectral (SBT) e são mostradas em pseudocor, com as cores vermelho e azul significando o maior e o menor sinal, respectivamente. (A) Sinal de alta eficiência SE-FRET produzido pelo controle positivo mRFP-GFP. (B) Sinal positivo de eficiência SE-FRET produzido pela interação das proteínas LSH10-GFP e OTLD1-mRFP. (C) A coexpressão da proteína de controlo negativo LSH4-GFP e OTLD1-mRFP não produziu qualquer sinal de eficiência SE-FRET. (D) A coexpressão da proteína mRFP livre de controlo negativa e do LSH10-GFP não produziu qualquer sinal de eficiência SE-FRET. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Interação específica do LSH10 com o OTLD1 em folhas de N. benthamiana detectadas pelo AB-FRET. Imagens de dois canais de detecção (doador e aceitador) antes e depois do fotobranqueamento são mostradas para as combinações proteicas indicadas. O círculo indica a região fotobranqueada. O AB-FRET, visualizado como um aumento na fluorescência da GFP após o fotobranqueamento mRFP, é exibido usando pseudo-cor com as cores vermelho e azul, significando o sinal mais alto e mais baixo, respectivamente. (A) Um aumento na fluorescência do doador de GFP produzido pelo controle positivo mRFP-GFP. (B) Um aumento na fluorescência do doador de GFP produzido pela interação das proteínas LSH10-GFP e OTLD1-mRFP. (C) A coexpressão da proteína de controle negativo LSH4-GFP e OTLD1-mRFP produziu alterações insignificantes na fluorescência do doador de GFP. (D) A coexpressão da proteína mRFP livre de controle negativo e do LSH10-GFP produziu alterações insignificantes na fluorescência do doador de GFP. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Uma quantificação do AB-FRET. O aumento percentual na fluorescência do doador de GFP após o fotobranqueamento mRFP (%AB-FRET) é mostrado para as combinações proteicas indicadas. As barras de erro representam a média de n = 13 células para cada medição. O teste t bicaudal determinou que as diferenças entre os valores médios são estatisticamente significativas para os valores de p *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001; p≥ 0,05 não são estatisticamente significativos (ns). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da cartilha Sequência (5· a 3·) Propósito
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag Amplificar OTLD1 a partir de cDNA
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttccgtggctttgcctttgcgtc Amplificar OTLD1 a partir de cDNA
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaagcaggctcaatgtcctctccaagagaaagagg Amplificar LSH10 a partir de cDNA
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaac Amplificar LSH10 a partir de cDNA
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg Amplificar LSH4 a partir de cDNA
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc Amplificar LSH4 a partir de cDNA
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt Amplificar mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttggagatctgcggccgcgg Amplificar mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc Confirmar sequências em pDONR207 por PCR e sequenciamento de DNA
AttL2 gtaacatcagagattttgagacac Confirmar sequências em pDONR207 por PCR e sequenciamento de DNA
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct Confirmar sequências em vetores de destino por PCR e sequenciamento de DNA
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt Confirmar sequências em vetores de destino por PCR e sequenciamento de DNA
Promotor 35S Fw ctatccttcgcaagacccttc Confirmar sequências em vetores de destino por PCR

Tabela 1: Primers para clonagem e confirmação das sequências clonadas em pDONOR207 e vetores de destino. Fw, primers para a frente; Rv, primers reversos.

Figura 1 Suplementar: Definindo parâmetros para canais confocais. (A) Captura de tela para a configuração do parâmetro de excitação e emissão para o canal doador (GFP). (B) Captura de tela para a configuração do parâmetro de excitação e emissão para o canal aceitador (mRFP). (C) Captura de tela para a configuração do parâmetro de excitação e emissão para o canal FET. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: Ajustando parâmetros para a aquisição de imagens SE-FRET da amostra de interesse. (A) Captura de tela para a configuração do parâmetro da área de digitalização (ou seja, tamanho da imagem, velocidade de digitalização, direção e média). (B) Captura de tela para a configuração do parâmetro de canal GFP (ou seja, laser, pinhole, ganho mestre e ganho digital). (C) Captura de tela para a configuração do parâmetro de canal mRFP (ou seja, laser, pinhole, ganho mestre e ganho digital). (D) Captura de tela para a configuração do parâmetro de canal FRET (ou seja, laser, pinhole, ganho mestre e ganho digital). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 suplementar: Definindo parâmetros para o fotobranqueamento do aceitador. (A) Captura de tela para a configuração do parâmetro da área de digitalização (ou seja, tamanho da imagem, velocidade de digitalização, direção e média). (B) Captura de tela para a configuração do parâmetro de branqueamento temporal e de série temporal. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 4 Suplementar: Séries temporais das medições de fluorescência do doador e do aceitador durante o AP-FRET. A cinética da fluorescência do aceptor (mRFP) e do doador (GFP) foi determinada para as amostras indicadas antes, durante e após o período de fotobranqueamento. (A) Controle positivo de mRFP-GFP. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) Controle LSH4-GFP negativo + OTLD1-mRFP. (D) LSH10-GFP negativo + Controle mRFP livre. Linhas amarelas indicam o período de tempo de fotobranqueamento. As curvas brancas plotam as medidas da cinética de fluorescência. Em cada painel, as imagens superior e inferior mostram a cinética da fluorescência do aceitador (mRFP) e do doador (GFP), respectivamente. Observe que, naturalmente, a fluorescência da GFP geralmente diminui com o tempo porque o laser gradualmente fotobranqueia a própria GFP. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Este protocolo FRET é simples e fácil de reproduzir; também requer um investimento mínimo de fornecimento e utiliza equipamentos padrão para muitos laboratórios modernos. Especificamente, cinco características técnicas principais distinguem a versatilidade deste procedimento. Primeiro, as construções FRET são geradas usando recombinação site-specific, uma abordagem de clonagem que é fácil de usar, produz resultados precisos e economiza tempo em comparação com a clonagem tradicional baseada em enzimas de restrição. Em segundo lugar, as plantas de N. benthamiana são simples de cultivar, produzem quantidades relativamente grandes de tecido e estão disponíveis na maioria dos laboratórios. Em terceiro lugar, a agroinfiltração resulta na expressão transitória dos construtos entregues e, portanto, gera dados dentro de um período de tempo relativamente curto (ou seja, 24-36 h) em comparação com os meses necessários para produzir plantas transgênicas. Em quarto lugar, a capacidade de fornecer diferentes combinações dos construtos de interesse por co-agroinfiltração permite o teste de interações entre quaisquer proteínas. Por fim, tanto o SE-FRET quanto o AB-FRET podem ser realizados sequencialmente na mesma amostra de tecido apenas ligando/desligando uma das configurações do canal laser. Deve-se notar, no entanto, que a entrega de microbombardeio42 pode ser usada como uma abordagem alternativa para a entrega de construção nos tecidos da planta em vez de agroinfiltração; neste caso, o uso de vetores binários necessários para a agroinfiltração é desnecessário.

Uma etapa crítica deste protocolo é selecionar adequadamente o par de fluorocromo doador e aceitador para otimizar a eficiência do FET. Os três fatores a seguir devem ser considerados: (1) o espectro de emissão do doador precisa se sobrepor ao máximo ao espectro de absorção do aceitador para maximizar a quantidade de energia transferida; (2) Os espectros de emissão do dador e do aceitador devem ser suficientemente diferentes para serem distinguidos entre si e para minimizar o SBT do sinal detectado por microscopia; (3) o aceitador deve ter excitação direta mínima na absorbância máxima do doador para minimizar a excitação do aceitador durante a excitação do doador. Os pares FRET doador/aceitador comuns utilizados são proteínas fluorescentes ciano/amarela e verde/vermelha (ou seja, CFP/YFP e GFP/mRFP, respectivamente). Este protocolo utiliza o par GFP/mRFP por ser adequado para imagens de células vivas e, ao contrário dos pares FRET ciano/amarelo, apresentar baixa fototoxicidade e baixo fotobranqueamento43. Convenientemente, a fusão translacional entre o par FRET (ou seja, mRFP-GFP) serve como um controle positivo ideal do FRET.

Outro passo crítico é a seleção dos controles negativos apropriados. Por exemplo, no caso da interação LSH10-OTLD1, a análise FRET deve sempre incluir a expressão de OTLD1 sozinho, LSH10 sozinho e coexpressão de OTLD1 e LSH10 com proteínas para as quais a interação não é esperada (ou seja, LSH4 e mRFP livre, respectivamente). Em termos de escolha dos controles negativos, os experimentos FRET podem seguir as diretrizes sobre as melhores práticas para o uso da técnica BiFC44, outra abordagem baseada em imagens de fluorescência adaptada para a detecção de interações proteicas em células vegetais vivas 29,30,31,32.

Finalmente, um fator que afeta a experimentação de FRET é comum a todos os experimentos em tecidos vegetais vivos, e deriva das diferentes condições fisiológicas da planta, em geral, e das células transformadas agroinfiltradas, em particular, mesmo quando mantidas sob condições de crescimento sob controle. Essa variabilidade fisiológica pode contribuir para uma certa variabilidade dos dados do FRET entre experimentos individuais, plantas e até folhas. Assim, é importante utilizar pelo menos duas plantas e três folhas por planta para cada experimento e selecionar folhas maduras e totalmente expandidas para agroinfiltração, pois produzem melhores imagens.

Tal como acontece com todas as metodologias experimentais, o FRET tem suas limitações técnicas e baseadas no uso. Um desses fatores limitantes é a natureza da etiqueta autofluorescente e sua localização dentro da proteína de interesse (por exemplo, no terminal amino- ou carboxila), que pode interferir nas propriedades biológicas dessa proteína, como seu padrão nativo de localização subcelular ou a capacidade de reconhecer seus interatores naturais. Antes da marcação, cada proteína de interesse deve ser analisada, na medida do possível, quanto às suas características estruturais que podem ser comprometidas pela marcação. Em muitos casos, no entanto, os parâmetros de marcação devem ser determinados empiricamente com base nas atividades conhecidas da proteína de interesse. Outra grande limitação é a relativa sofisticação técnica do FRET, que requer o uso de microscopia confocal com o hardware e o software apropriados. Ao contrário de vários outros métodos de interação proteica, como o sistema híbrido de levedura dupla (Y2H)45,46,47, o FRET é inadequado para identificar interações proteicas por meio de bibliotecas de expressão de triagem, especialmente telas de alto rendimento 48. Além disso, como a maioria dos ensaios realizados in vivo, o FRET não é um sistema bioquimicamente puro e, portanto, não detecta o potencial envolvimento de outros fatores celulares desconhecidos na interação.

A importância do FRET em relação a outros ensaios de interações proteicas reside na detecção de interações de curta distância, reduzindo as chances de resultados falso-positivos, aplicabilidade para implantação in vivo em uma variedade de células, tecidos e organismos (incluindo plantas) e detecção da localização subcelular das proteínas que interagem. Muitas dessas características do FRET são encontradas em outras abordagens in vivo, como a luciferase 49,50 ou a BiFC29,30,31,32,33, dentre as quais a BiFC talvez seja a mais comumente utilizada. Outro ensaio de interação amplamente utilizado é o Y2H45,46,47; no entanto, fora da pesquisa em biologia de leveduras, este ensaio utiliza um sistema experimental heterólogo, propenso a falsos positivos, e suas descobertas requerem confirmação por outra técnica. Uma variação conceitual de Y2H é um ensaio de ubiquitina dividida que é mais adequado para detectar interações entre proteínas de membrana51,52 e que exibe limitações em relação ao FRET que é semelhante ao Y2H. Finalmente, as interações proteicas podem ser detectadas por co-imunoprecipitação (co-IP), que se aplica à detecção em um ambiente complexo de extratos celulares, bem como em reações in vitro precisamente definidas53,54,55; em nossa experiência, o co-IP é mais útil como um método alternativo e independente para confirmar dados obtidos usando as abordagens in vivo baseadas em fluorescência.

Considerando que este protocolo FRET específico foi desenvolvido para estudar as interações entre fatores de transcrição de plantas e enzimas modificadoras de histona, ele pode ser usado para descobrir e caracterizar interações entre muitas outras classes de proteínas inplanta.

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Disclosures

Não foram declarados conflitos de interesses.

Acknowledgments

O trabalho no laboratório de V.C. é apoiado por doações do NIH (R35GM144059 e R01GM50224), NSF (MCB1913165 e IOS1758046) e BARD (IS-5276-20) para V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

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Biologia Edição 188 Enzimas modificadoras de histona (HMEs) fatores de transcrição (TFs) interações proteína-proteína FRET
Investigando interações entre enzimas modificadoras de histonas e fatores de transcrição <em>in vivo</em> por transferência de energia de ressonância de fluorescência
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Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

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