Fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) är en avbildningsteknik för att detektera proteininteraktioner i levande celler. Här presenteras ett FRET-protokoll för att studera sambandet mellan histonmodifierande enzymer och transkriptionsfaktorer som rekryterar dem till målpromotorerna för epigenetisk reglering av genuttryck i växtvävnader.
Epigenetisk reglering av genuttryck påverkas vanligtvis av histonmodifierande enzymer (HME) som genererar heterokromatiska eller eukromatiska histonmärken för transkriptionell repression respektive aktivering. HME rekryteras till sitt målkromatin genom transkriptionsfaktorer (TF). Således är detektion och karakterisering av direkta interaktioner mellan HME och TF avgörande för att förstå deras funktion och specificitet bättre. Dessa studier skulle vara mer biologiskt relevanta om de utfördes in vivo i levande vävnader. Här beskrivs ett protokoll för att visualisera interaktioner i växtblad mellan ett växthistondeubiquitinas och en växttranskriptionsfaktor med hjälp av fluorescensresonansenergiöverföring (FRET), vilket möjliggör detektering av komplex mellan proteinmolekyler som ligger inom < 10 nm från varandra. Två varianter av FRET-tekniken presenteras: SE-FRET (sensibiliserad emission) och AB-FRET (acceptorblekning), där energin överförs icke-radiativt från givaren till acceptorn eller avges strålande av givaren vid fotoblekning av acceptorn. Både SE-FRET- och AB-FRET-metoder kan enkelt anpassas för att upptäcka andra interaktioner mellan andra proteiner i planta.
Växthiston deubiquitinaser spelar en viktig roll för att kontrollera genuttryck genom post-translationell modifiering av histoner, särskilt genom att radera deras monoubiquitylationsmärken1. Hittills är OTLD1 en av de få växthistondeubiquitinaser som karakteriseras på molekylär nivå i Arabidopsis 2,3. OTLD1 avlägsnar monoubiquitingrupper från H2B-histonmolekylerna och främjar därigenom avlägsnande eller tillsats av eukromatisk acetylering och metyleringsmodifieringar av H3-histoner i målgenenkromatin 4,5. Dessutom interagerar OTLD1 med ett annat kromatinmodifierande enzym, histonlysindemetylas KDM1C, för att påverka transkriptionell undertryckning av målgenerna 6,7.
De flesta histonmodifierande enzymer saknar DNA-bindningsförmåga och kan därför inte känna igen sina målgener direkt. En möjlighet är att de samarbetar med DNA-bindande transkriptionsfaktorproteiner som binder dessa enzymer och leder dem till deras kromatinmål. Specifikt, i växter, är flera stora histonmodifierande enzymer (dvs. histonmetyltransferaser 8,9, histonacetyltransferaser 10, histondemetylaser 11 och polykombrepressiva komplex12,13,14) kända för att rekryteras av transkriptionsfaktorer. I överensstämmelse med denna idé föreslogs nyligen en möjlig mekanism för OTLD1-rekrytering till målpromotorerna som är baserad på specifika protein-proteininteraktioner av OTLD1 med en transkriptionsfaktor LSH1015.
LSH10 tillhör en familj av växten ALOG (Arabidopsis LSH1 och Oryza G1) proteiner som fungerar som centrala utvecklingsregulatorer 16,17,18,19,20,21,22. Det faktum att medlemmarna i ALOG-proteinfamiljen innehåller DNA-bindande motiv23 och uppvisar kapacitet för transkriptionell reglering 22, kärnlokalisering19 och homodimerisering24 ger ytterligare stöd för uppfattningen att dessa proteiner, inklusive LSH10, kan fungera som specifika transkriptionsfaktorer under epigenetisk reglering av transkription. En av de viktigaste experimentella teknikerna som används för att karakterisera LSH10-OTLD1-interaktionen in vivo är fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)15.
FRET är en avbildningsteknik för att direkt detektera interaktioner på nära håll mellan proteiner inom <10 nm från varandra25 inuti levande celler. Det finns två huvudsakliga varianter av FRET-metoden26: sensibiliserad emission (SE-FRET) (figur 1A) och acceptorblekning (AB-FRET) (figur 1B). I SE-FRET är de interagerande proteinerna märkta med en donatorfluorokr (t.ex. grönt fluorescerande protein, GFP) och det andra med en acceptorfluorokr (t.ex. monomert rött fluorescerande protein, mRFP27,28) – överför icke-radiativt den exciterade tillståndsenergin från givaren till acceptorn. Eftersom inga fotoner emitteras under denna överföring produceras en fluorescerande signal som har ett strålningsemissionsspektrum som liknar acceptorns. I AB-FRET detekteras och kvantifieras proteininteraktioner baserat på förhöjd strålningsemission från givaren när acceptorn inaktiveras permanent genom fotoblekning och därmed inte kan ta emot den icke-strålningsenergi som överförs från givaren (figur 1). Det är viktigt att den subcellulära platsen för FRET-fluorescensen indikerar lokaliseringen av de interagerande proteinerna i cellen.
Förmågan att distribuera FRET i levande vävnader och bestämma den subcellulära lokaliseringen av de interagerande proteinerna samtidigt med att detektera denna interaktion i sig, gör FRET till den valda tekniken för studier och initial karakterisering av protein-proteininteraktioner in vivo. En jämförbar in vivo-metod för fluorescensavbildning, bimolekylär fluorescenskomplementering (BiFC)29,30,31,32, är ett bra alternativt tillvägagångssätt, även om BiFC, till skillnad från FRET, kan producera falska positiva resultat på grund av spontan montering av de autofluorescerande BiFC-reportrarna 33, och kvantifieringen av dess data är mindre exakt.
Den här artikeln delar den framgångsrika erfarenheten av att implementera både SE-FRET- och AB-FRET-tekniker och presenterar ett protokoll för deras distribution för att undersöka interaktionerna mellan OTLD1 och LSH10 i växtceller.
Detta FRET-protokoll är enkelt och lätt att reproducera; Det kräver också minimala leveransinvesteringar och använder standardutrustning för många moderna laboratorier. Specifikt skiljer fem huvudsakliga tekniska egenskaper mångsidigheten i denna procedur. För det första genereras FRET-konstruktionerna med hjälp av platsspecifik rekombination, en kloningsmetod som är enkel att använda, ger exakta resultat och sparar tid jämfört med traditionell restriktionsenzymbaserad kloning. För det andra är N. be…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i V.C.:s laboratorium stöds av bidrag från NIH (R35GM144059 och R01GM50224), NSF (MCB1913165 och IOS1758046) och BARD (IS-5276-20) till V.C.
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) | Sigma-Aldrich | #D134406-1G | |
Bacto Agar | BD Biosciences | #214010 | |
Bacto trypton | BD Biosciences | #211705 | |
Bacto yeast extract | BD Biosciences | #212750 | |
Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM900 | Any CLSM with similar capabilities is suitable |
EHA105 | VWR | 104013-310 | We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection |
Gateway BP Clonase II | Invitrogen | #11789100 | |
Gateway LR Clonase II | Invitrogen | #11791020 | |
GV3101 | VWR | 104013-296 | We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection |
ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
MES | Sigma-Aldrich | #69889-10G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | #63068-250G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | #S5886-500G | |
Nicotiana benthamiana seeds | Herbalistics Pty | RA4 or LAB | We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection |
pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 | N/A | Refs. 15, 28 | |
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 | N/A | Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28) | |
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 | N/A | Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct | |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | #R7382-5G | |
Spectinomycin | Sigma-Aldrich | #S4014-5G | |
Syringes without needles | BD | 309659 | |
Zen software for CLSM imaging | Zeiss | ZEN 3.0 version | The software should be compatible with the CLSM used |