फ्लोरेसेंस रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (फ्रेट) जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए एक इमेजिंग तकनीक है। यहां, प्रतिलेखन कारकों के साथ हिस्टोन-संशोधित एंजाइमों के संबंध का अध्ययन करने के लिए एक फ्रेट प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो उन्हें पौधे के ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति के एपिजेनेटिक विनियमन के लिए लक्षित प्रमोटरों को भर्ती करते हैं।
जीन अभिव्यक्ति का एपिजेनेटिक विनियमन आमतौर पर हिस्टोन संशोधित एंजाइमों (एचएमई) से प्रभावित होता है जो क्रमशः ट्रांसक्रिप्शनल दमन या सक्रियण के लिए हेटरोक्रोमैटिक या यूक्रोमैटिक हिस्टोन चिह्न उत्पन्न करते हैं। एचएमई को प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) द्वारा उनके लक्ष्य क्रोमैटिन में भर्ती किया जाता है। इस प्रकार, एचएमई और टीएफ के बीच प्रत्यक्ष बातचीत का पता लगाना और विशेषता उनके कार्य और विशिष्टता को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण है। ये अध्ययन जैविक रूप से अधिक प्रासंगिक होंगे यदि जीवित ऊतकों के भीतर विवो में प्रदर्शन किया जाता है। यहां, प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट) का उपयोग करके पौधे के हिस्टोन डियूबिकिनेस और पौधे प्रतिलेखन कारक के बीच पौधे की पत्तियों में बातचीत की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो प्रोटीन अणुओं के बीच परिसरों का पता लगाने की अनुमति देता है जो एक दूसरे से <10 एनएम के भीतर हैं। फ्रेट तकनीक के दो रूप प्रस्तुत किए गए हैं: एसई-फ्रेट (संवेदी उत्सर्जन) और एबी-फ्रेट (स्वीकर्ता ब्लीचिंग), जिसमें ऊर्जा को दाता से स्वीकर्ता में गैर-विकिरण रूप से स्थानांतरित किया जाता है या स्वीकर्ता के फोटोब्लीचिंग पर दाता द्वारा विकिरण रूप से उत्सर्जित किया जाता है। एसई-फ्रेट और एबी-फ्रेट दोनों दृष्टिकोणों को प्लांटा में अन्य प्रोटीनों के बीच अन्य इंटरैक्शन की खोज के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
प्लांट हिस्टोन डियूबिकिटिनेस हिस्टोन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन द्वारा जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से उनके मोनोव्यापकताचिह्नों को मिटाकर। अब तक, ओटीएलडी 1 एराबिडोप्सिस 2,3 में आणविक स्तर पर विशेषता वाले केवल कुछ पौधों में से एक है हिस्टोन डियूबिकिनेस। ओटीएलडी 1 एच 2 बी हिस्टोन अणुओं से मोनोयूबिकिटिन समूहों को हटा देता है, जिससे लक्ष्य जीन क्रोमैटिन 4,5 में एच 3 हिस्टोन के यूक्रोमैटिक एसिटिलीकरण और मिथाइलेशन संशोधनों को हटाने या जोड़ने को बढ़ावा मिलता है। इसके अलावा, ओटीएलडी 1 लक्ष्य जीन 6,7 के ट्रांसक्रिप्शनल दमन को प्रभावित करने के लिए एक और क्रोमैटिन-संशोधित एंजाइम, हिस्टोन लाइसिन डीमिथाइलेज केडीएम 1 सी के साथ बातचीत करता है।
अधिकांश हिस्टोन-संशोधित एंजाइमों में डीएनए बाध्यकारी क्षमताओं की कमी होती है, और इस प्रकार वे सीधे अपने लक्षित जीन को नहीं पहचान सकते हैं। एक संभावना यह है कि वे डीएनए-बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक प्रोटीन के साथ सहयोग करते हैं जो इन एंजाइमों को बांधते हैं और उन्हें अपने क्रोमैटिन लक्ष्यों के लिए निर्देशित करते हैं। विशेष रूप से, पौधों में, कई प्रमुख हिस्टोन-संशोधित एंजाइम (यानी, हिस्टोन मेथिलट्रांसफेरेज़ 8,9, हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़10, हिस्टोन डीमिथाइलेज11, और पॉलीकॉम्ब दमनकारी कॉम्प्लेक्स12,13,14) प्रतिलेखन कारकों द्वारा भर्ती होने के लिए जाने जाते हैं। इस विचार के अनुरूप, हाल ही में, लक्ष्य प्रमोटरों के लिए ओटीएलडी 1 भर्ती के लिए एक संभावित तंत्र प्रस्तावित किया गया था जो प्रतिलेखन कारक एलएसएच 1015 के साथ ओटीएलडी 1 के विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पर आधारित है।
एलएसएच 10 पौधे एएलओजी (एराबिडोप्सिस एलएसएच 1 और ओरिजा जी 1) प्रोटीन के एक परिवार से संबंधित है जो केंद्रीय विकासनियामकों 16,17,18,19,20,21,22 के रूप में कार्य करता है। तथ्य यह है कि एएलओजी प्रोटीन परिवार के सदस्यों में डीएनए बाइंडिंगमोटिफ्स 23 होते हैं और ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन22, परमाणु स्थानीयकरण19 और होमोडीमराइजेशन24 के लिए क्षमता प्रदर्शित करते हैं, इस धारणा को और समर्थन देते हैं कि एलएसएच 10 सहित ये प्रोटीन प्रतिलेखन के एपिजेनेटिक विनियमन के दौरान विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों के रूप में कार्य कर सकते हैं। विवो में एलएसएच 10-ओटीएलडी 1 इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए उपयोग की जाने वाली मुख्य प्रयोगात्मक तकनीकों में से एक प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट) 15 है।
फ्रेट एक इमेजिंग तकनीक है जो जीवित कोशिकाओं के अंदर एक दूसरे से <10 एनएम के भीतर प्रोटीनके बीच घनिष्ठ-दूरी की बातचीत का सीधे पता लगाने के लिए है। फ्रेट दृष्टिकोण26 के दो मुख्य रूप हैं: संवेदनशील उत्सर्जन (एसई-फ्रेट) (चित्रा 1 ए) और स्वीकर्ता ब्लीचिंग (एबी-फ्रेट) (चित्रा 1 बी)। एसई-फ्रेट में, अंतःक्रियात्मक प्रोटीन- जिनमें से एक को दाता फ्लोरोक्रोम (जैसे, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जीएफपी) के साथ टैग किया जाता है और दूसरे को स्वीकर्ता फ्लोरोक्रोम (जैसे, मोनोमेरिक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एमआरएफपी27,28) के साथ टैग किया जाता है – गैर-विकिरण रूप से दाता से स्वीकर्ता तक उत्तेजित अवस्था ऊर्जा को स्थानांतरित करता है। क्योंकि इस हस्तांतरण के दौरान कोई फोटॉन उत्सर्जित नहीं होता है, एक फ्लोरोसेंट सिग्नल का उत्पादन होता है जिसमें स्वीकर्ता के समान विकिरण उत्सर्जन स्पेक्ट्रम होता है। एबी-फ्रेट में, प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाया जाता है और दाता के ऊंचे विकिरण उत्सर्जन के आधार पर मात्रा निर्धारित की जाती है जब स्वीकर्ता फोटोब्लीचिंग द्वारा स्थायी रूप से निष्क्रिय हो जाता है, और इस प्रकार दाता से स्थानांतरित गैर-विकिरण ऊर्जा प्राप्त करने में असमर्थ होता है (चित्रा 1)। महत्वपूर्ण रूप से, फ्रेट फ्लोरेसेंस का उपकोशिकीय स्थान सेल में अंतःक्रियात्मक प्रोटीन के स्थानीयकरण का संकेत है।
जीवित ऊतकों में फ्रेट को तैनात करने और इस बातचीत का पता लगाने के साथ-साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित करने की क्षमता, फ्रेट को अध्ययन और विवो में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए पसंद की तकनीक बनाती है। विवो फ्लोरेसेंस इमेजिंग पद्धति में एक तुलनीय, द्वि-आणविक प्रतिदीप्ति पूरक (बीआईएफसी) 29,30,31,32, एक अच्छा वैकल्पिक दृष्टिकोण है, हालांकि, फ्रेट के विपरीत, बीआईएफसी ऑटोफ्लोरोसेंट बीआईएफसी रिपोर्टर 33 की सहज असेंबली के कारण गलत सकारात्मक उत्पन्न कर सकता है, और इसके डेटा का परिमाणीकरण कम सटीक है।
यह लेख एसई-फ्रेट और एबी-फ्रेट तकनीकों दोनों को लागू करने में सफल अनुभव साझा करता है और पौधे की कोशिकाओं में ओटीएलडी 1 और एलएसएच 10 के बीच बातचीत की जांच करने के लिए उनकी तैनाती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।
यह फ्रेट प्रोटोकॉल सरल और पुन: उत्पन्न करने में आसान है; यह न्यूनतम आपूर्ति निवेश की भी आवश्यकता है और कई आधुनिक प्रयोगशालाओं के लिए मानक उपकरणों का उपयोग करता है। विशेष रूप से, पांच मुख्य तकनीकी विशेषत…
The authors have nothing to disclose.
वीसी की प्रयोगशाला में काम एनआईएच (आर 35 जीएम 144059 और आर01 जीएम 50224), एनएसएफ (एमसीबी 1913165 और आईओएस 1758046), और बार्ड (आईएस -5276-20) से वीसी को अनुदान द्वारा समर्थित है।
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) | Sigma-Aldrich | #D134406-1G | |
Bacto Agar | BD Biosciences | #214010 | |
Bacto trypton | BD Biosciences | #211705 | |
Bacto yeast extract | BD Biosciences | #212750 | |
Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM900 | Any CLSM with similar capabilities is suitable |
EHA105 | VWR | 104013-310 | We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection |
Gateway BP Clonase II | Invitrogen | #11789100 | |
Gateway LR Clonase II | Invitrogen | #11791020 | |
GV3101 | VWR | 104013-296 | We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection |
ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
MES | Sigma-Aldrich | #69889-10G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | #63068-250G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | #S5886-500G | |
Nicotiana benthamiana seeds | Herbalistics Pty | RA4 or LAB | We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection |
pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 | N/A | Refs. 15, 28 | |
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 | N/A | Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28) | |
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 | N/A | Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct | |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | #R7382-5G | |
Spectinomycin | Sigma-Aldrich | #S4014-5G | |
Syringes without needles | BD | 309659 | |
Zen software for CLSM imaging | Zeiss | ZEN 3.0 version | The software should be compatible with the CLSM used |