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Biology

फ्लोरेसेंस रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर द्वारा विवो में हिस्टोन संशोधित एंजाइम और प्रतिलेखन कारकों के बीच बातचीत की जांच

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

फ्लोरेसेंस रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (फ्रेट) जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए एक इमेजिंग तकनीक है। यहां, प्रतिलेखन कारकों के साथ हिस्टोन-संशोधित एंजाइमों के संबंध का अध्ययन करने के लिए एक फ्रेट प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो उन्हें पौधे के ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति के एपिजेनेटिक विनियमन के लिए लक्षित प्रमोटरों को भर्ती करते हैं।

Abstract

जीन अभिव्यक्ति का एपिजेनेटिक विनियमन आमतौर पर हिस्टोन संशोधित एंजाइमों (एचएमई) से प्रभावित होता है जो क्रमशः ट्रांसक्रिप्शनल दमन या सक्रियण के लिए हेटरोक्रोमैटिक या यूक्रोमैटिक हिस्टोन चिह्न उत्पन्न करते हैं। एचएमई को प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) द्वारा उनके लक्ष्य क्रोमैटिन में भर्ती किया जाता है। इस प्रकार, एचएमई और टीएफ के बीच प्रत्यक्ष बातचीत का पता लगाना और विशेषता उनके कार्य और विशिष्टता को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण है। ये अध्ययन जैविक रूप से अधिक प्रासंगिक होंगे यदि जीवित ऊतकों के भीतर विवो में प्रदर्शन किया जाता है। यहां, प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट) का उपयोग करके पौधे के हिस्टोन डियूबिकिनेस और पौधे प्रतिलेखन कारक के बीच पौधे की पत्तियों में बातचीत की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो प्रोटीन अणुओं के बीच परिसरों का पता लगाने की अनुमति देता है जो एक दूसरे से <10 एनएम के भीतर हैं। फ्रेट तकनीक के दो रूप प्रस्तुत किए गए हैं: एसई-फ्रेट (संवेदी उत्सर्जन) और एबी-फ्रेट (स्वीकर्ता ब्लीचिंग), जिसमें ऊर्जा को दाता से स्वीकर्ता में गैर-विकिरण रूप से स्थानांतरित किया जाता है या स्वीकर्ता के फोटोब्लीचिंग पर दाता द्वारा विकिरण रूप से उत्सर्जित किया जाता है। एसई-फ्रेट और एबी-फ्रेट दोनों दृष्टिकोणों को प्लांटा में अन्य प्रोटीनों के बीच अन्य इंटरैक्शन की खोज के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

प्लांट हिस्टोन डियूबिकिटिनेस हिस्टोन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन द्वारा जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से उनके मोनोव्यापकताचिह्नों को मिटाकर। अब तक, ओटीएलडी 1 एराबिडोप्सिस 2,3 में आणविक स्तर पर विशेषता वाले केवल कुछ पौधों में से एक है हिस्टोन डियूबिकिनेस। ओटीएलडी 1 एच 2 बी हिस्टोन अणुओं से मोनोयूबिकिटिन समूहों को हटा देता है, जिससे लक्ष्य जीन क्रोमैटिन 4,5 में एच 3 हिस्टोन के यूक्रोमैटिक एसिटिलीकरण और मिथाइलेशन संशोधनों को हटाने या जोड़ने को बढ़ावा मिलता है। इसके अलावा, ओटीएलडी 1 लक्ष्य जीन 6,7 के ट्रांसक्रिप्शनल दमन को प्रभावित करने के लिए एक और क्रोमैटिन-संशोधित एंजाइम, हिस्टोन लाइसिन डीमिथाइलेज केडीएम 1 सी के साथ बातचीत करता है।

अधिकांश हिस्टोन-संशोधित एंजाइमों में डीएनए बाध्यकारी क्षमताओं की कमी होती है, और इस प्रकार वे सीधे अपने लक्षित जीन को नहीं पहचान सकते हैं। एक संभावना यह है कि वे डीएनए-बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक प्रोटीन के साथ सहयोग करते हैं जो इन एंजाइमों को बांधते हैं और उन्हें अपने क्रोमैटिन लक्ष्यों के लिए निर्देशित करते हैं। विशेष रूप से, पौधों में, कई प्रमुख हिस्टोन-संशोधित एंजाइम (यानी, हिस्टोन मेथिलट्रांसफेरेज़ 8,9, हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़10, हिस्टोन डीमिथाइलेज11, और पॉलीकॉम्ब दमनकारी कॉम्प्लेक्स12,13,14) प्रतिलेखन कारकों द्वारा भर्ती होने के लिए जाने जाते हैं। इस विचार के अनुरूप, हाल ही में, लक्ष्य प्रमोटरों के लिए ओटीएलडी 1 भर्ती के लिए एक संभावित तंत्र प्रस्तावित किया गया था जो प्रतिलेखन कारक एलएसएच 1015 के साथ ओटीएलडी 1 के विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पर आधारित है।

एलएसएच 10 पौधे एएलओजी (एराबिडोप्सिस एलएसएच 1 और ओरिजा जी 1) प्रोटीन के एक परिवार से संबंधित है जो केंद्रीय विकासनियामकों 16,17,18,19,20,21,22 के रूप में कार्य करता है। तथ्य यह है कि एएलओजी प्रोटीन परिवार के सदस्यों में डीएनए बाइंडिंगमोटिफ्स 23 होते हैं और ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन22, परमाणु स्थानीयकरण19 और होमोडीमराइजेशन24 के लिए क्षमता प्रदर्शित करते हैं, इस धारणा को और समर्थन देते हैं कि एलएसएच 10 सहित ये प्रोटीन प्रतिलेखन के एपिजेनेटिक विनियमन के दौरान विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों के रूप में कार्य कर सकते हैं। विवो में एलएसएच 10-ओटीएलडी 1 इंटरैक्शन को चिह्नित करने के लिए उपयोग की जाने वाली मुख्य प्रयोगात्मक तकनीकों में से एक प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (फ्रेट) 15 है।

फ्रेट एक इमेजिंग तकनीक है जो जीवित कोशिकाओं के अंदर एक दूसरे से <10 एनएम के भीतर प्रोटीनके बीच घनिष्ठ-दूरी की बातचीत का सीधे पता लगाने के लिए है। फ्रेट दृष्टिकोण26 के दो मुख्य रूप हैं: संवेदनशील उत्सर्जन (एसई-फ्रेट) (चित्रा 1 ए) और स्वीकर्ता ब्लीचिंग (एबी-फ्रेट) (चित्रा 1 बी)। एसई-फ्रेट में, अंतःक्रियात्मक प्रोटीन- जिनमें से एक को दाता फ्लोरोक्रोम (जैसे, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जीएफपी) के साथ टैग किया जाता है और दूसरे को स्वीकर्ता फ्लोरोक्रोम (जैसे, मोनोमेरिक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, एमआरएफपी27,28) के साथ टैग किया जाता है - गैर-विकिरण रूप से दाता से स्वीकर्ता तक उत्तेजित अवस्था ऊर्जा को स्थानांतरित करता है। क्योंकि इस हस्तांतरण के दौरान कोई फोटॉन उत्सर्जित नहीं होता है, एक फ्लोरोसेंट सिग्नल का उत्पादन होता है जिसमें स्वीकर्ता के समान विकिरण उत्सर्जन स्पेक्ट्रम होता है। एबी-फ्रेट में, प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाया जाता है और दाता के ऊंचे विकिरण उत्सर्जन के आधार पर मात्रा निर्धारित की जाती है जब स्वीकर्ता फोटोब्लीचिंग द्वारा स्थायी रूप से निष्क्रिय हो जाता है, और इस प्रकार दाता से स्थानांतरित गैर-विकिरण ऊर्जा प्राप्त करने में असमर्थ होता है (चित्रा 1)। महत्वपूर्ण रूप से, फ्रेट फ्लोरेसेंस का उपकोशिकीय स्थान सेल में अंतःक्रियात्मक प्रोटीन के स्थानीयकरण का संकेत है।

जीवित ऊतकों में फ्रेट को तैनात करने और इस बातचीत का पता लगाने के साथ-साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित करने की क्षमता, फ्रेट को अध्ययन और विवो में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए पसंद की तकनीक बनाती है। विवो फ्लोरेसेंस इमेजिंग पद्धति में एक तुलनीय, द्वि-आणविक प्रतिदीप्ति पूरक (बीआईएफसी) 29,30,31,32, एक अच्छा वैकल्पिक दृष्टिकोण है, हालांकि, फ्रेट के विपरीत, बीआईएफसी ऑटोफ्लोरोसेंट बीआईएफसी रिपोर्टर 33 की सहज असेंबली के कारण गलत सकारात्मक उत्पन्न कर सकता है, और इसके डेटा का परिमाणीकरण कम सटीक है।

यह लेख एसई-फ्रेट और एबी-फ्रेट तकनीकों दोनों को लागू करने में सफल अनुभव साझा करता है और पौधे की कोशिकाओं में ओटीएलडी 1 और एलएसएच 10 के बीच बातचीत की जांच करने के लिए उनकी तैनाती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

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Protocol

निकोटियाना बेंथामियाना, एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स स्ट्रेन ईएचए 105, या जीवी 3101 का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए किया गया था।

1. फ्रेट वेक्टर निर्माण

  1. दाता / स्वीकर्ता फ्रेट जोड़ी के लिए फ्लोरोसेंट टैग का चयन करें।
    1. दाता वेक्टर उत्पन्न करने के लिए pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 15,28 (सामग्री की तालिका देखें) से EGFP का उपयोग करें।
    2. स्वीकर्ता वेक्टर उत्पन्न करने के लिए pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 ( सामग्री की तालिका देखें) से mRFP का उपयोग करें।
  2. साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन क्लोनिंग तकनीक34 का उपयोग करके दाता / स्वीकर्ता फ्रेट निर्माण उत्पन्न करें, जैसे गेटवे पुनर्संयोजन क्लोनिंग सिस्टम35।
    1. रुचि36 (यानी, एराबिडोप्सिस ओटीएलडी 1 और एलएसएच 10) 15 के प्रोटीन के कोडिंग अनुक्रमों को बढ़ाएं।
      नोट: एक नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करना भी एक अच्छा विचार है जो बातचीत करने वाले प्रोटीनों में से एक के होमोलॉग का प्रतिनिधित्व करता है लेकिन बातचीत प्रदर्शित करने की उम्मीद नहीं है; ओटीएलडी 1-एलएसएच 10 इंटरैक्शन अध्ययन एलएसएच 10, एलएसएच 4 के एक होमोलॉग को नियोजित करता है, जो ओटीएलडी 1 को नहीं पहचानता है। ओटीएलडी 1, एलएसएच 10, और एलएसएच 4 सीडीएनए को तालिका 1 में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जाता है।
    2. साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन क्लोनिंग तकनीक34 द्वारा प्रविष्टि वेक्टर पीडीएनआर 207 में क्लोन ओटीएलडी 1, एलएसएच 10 और एलएसएच 4।
    3. बाइनरी दाता निर्माण p35S:: LSH10-GFP (परीक्षण निर्माण) और p35S:: LSH4-GFP (नकारात्मक नियंत्रण) उत्पन्न करने के लिए PDONR207 से LSH10 और LSH4 को बाइनरी गंतव्य वेक्टर pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 में स्थानांतरित करने के लिए गेटवे एलआर क्लोनेस II (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    4. द्विआधारी स्वीकर्ता निर्माण p35S::OTLD1-mRFP (परीक्षण निर्माण) उत्पन्न करने के लिए PDONR207 से OTLD1 को द्विआधारी गंतव्य वेक्टर pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 में स्थानांतरित करने के लिए उसी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम (चरण 1.2.3) का उपयोग करें।
    5. तालिका 1 में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग करकेपीसीआर-36 एमआरएफपी को pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 से बढ़ाता है, इसे pDONR207 में पुनर्संयोजन क्लोनिंग तकनीक द्वारा क्लोन करता है, और फिर LR Clonase II का उपयोग करके mRFP को pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 में स्थानांतरित करने के लिए बाइनरी संलयन निर्माण p35S:: mRFP-GFP (सकारात्मक नियंत्रण) उत्पन्न करता है।
  3. एग्रोबैक्टीरियम में दाता और स्वीकर्ता संरचनाओं का परिवर्तन करें।
    1. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेसिएन्स स्ट्रेन ईएचए 105 या जीवी 3101 की सक्षम कोशिकाओं की संस्कृति के चरण 1.2.3-1.2.5 से 100 μL तक प्रत्येक प्लास्मिड का 1 μg जोड़ें, जो मानक प्रोटोकॉल 37 का उपयोग करके तैयार किया गया है या व्यावसायिक रूप से प्राप्तकिया गया है, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. सक्षम सेल मिश्रण में 1 एमएल एलबी माध्यम (1% ट्रिप्टोन, 0.5% खमीर निकालने, और 1% एनएसीएल; सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और 1.5 घंटे के लिए 200 आरपीएम और 28 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन करें। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    3. एलबी माध्यम के 0.1 एमएल में कोशिकाओं को पाइपिंग द्वारा पुन: निलंबित करें और उन्हें उचित एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे, 0.01% स्पेक्टिनोमाइसिन और 0.005% रिफैम्पिसिन) के साथ पूरक एलबी एगर पर फैलाएं; सामग्री की तालिका देखें)। 2 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें।
    4. अलग-अलग कॉलोनियों को चुनें और उनमें से प्रत्येक को उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक एलबी शोरबा के 1 एमएल में अलग से टीका लगाएं।
    5. कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं और संस्कृति के 0.2 एमएल को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए 10,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    6. एग्रोबैक्टीरियम कोशिकाओं38 से प्लास्मिड को अलग करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल द्वारा प्लास्मिड डीएनए निकालें और निकाले गए डीएनए को 30 μL पानी में पुन: निलंबित करें। वांछित प्लास्मिड को आश्रय देने वाली कॉलोनियों की पहचान करने के लिए, तालिका 1 में सूचीबद्ध जीन-विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में डीएनए तैयारी के 2 μL का उपयोग करें। 0.3 एमएल ग्लिसरॉल के साथ पहचाने गए कल्चर के 0.7 एमएल मिलाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एग्रोइनफिल्ट्रेशन

  1. निकोटियाना बेंथामियाना के पौधे उगाएं।
    नोट: पूरे प्रयोग के दौरान, सभी पौधों को स्वस्थ होना चाहिए।
    1. उच्च घनत्व पर गीली मिट्टी वाले बर्तन में एन. बेंथामियाना के बीज बोएं और उगाएं।
    2. लगाए गए बीजों को 23 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे प्रकाश के साथ और 8 घंटे के अंधेरे चक्र में 150-170 μmol /m2s प्रकाश तीव्रता के साथ सेट किए गए विकास कक्ष में रखें जब तक कि यूफिल का व्यास 0.5 सेमी तक न पहुंच जाए।
    3. रोपाई को बड़े बर्तनों में स्थानांतरित करें और उन्हें समान मापदंडों के साथ एक ही कक्ष में बढ़ने की अनुमति दें।
      नोट: पौधे कृषिभ्रषण के लिए तैयार होते हैं जब उनकी सबसे बड़ी पत्तियां व्यास में 5-7 सेमी होती हैं, आमतौर पर 4-5 सप्ताह के भीतर। छोटे पौधों में जो बहुत छोटे हैं, फ्रेट विश्लेषण के लिए कृषि घुसपैठ के प्रभाव बहुत गंभीर होंगे।
  2. एग्रोइनफिल्ट्रेशन के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं को तैयार करें।
    1. 28 डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं (चरण 1.3.3) और 150 μM एसिटोसिरिंगोन के साथ पूरक एलबी माध्यम के 5 एमएल में रात भर फ्रेट संरचनाओं वाले प्रत्येक एग्रोबैक्टीरियम कॉलोनी को उगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. कोशिकाओं को एग्रोइनफिल्ट्रेशन बफर (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μM एसिटोसाइरिंगोन) सेOD 600 = 0.5 तक पुन: निलंबित करें।
    4. पुन: निलंबित कोशिकाओं को उपयुक्त संरचनाओं (चरण 2.2.5) को आश्रय देने वाली कोशिकाओं के बीच 1: 1 v / v अनुपात पर संयोजित करें।
    5. डबल-निर्माण कृषिभिंचन के लिए, दो संस्कृतियों के एलिकोट को मिलाएं और, एकल-निर्माण कृषिभ्रण के लिए, एक ही संस्कृति के एलिकोट को मिलाएं:
      1. परीक्षण किए गए प्रोटीन: ओटीएलडी 1-एमआरएफपी + एलएसएच 10-जीएफपी (पी 35 एस को आश्रय देने वाले बैक्टीरिया:: ओटीएलडी 1-एमआरएफपी और पी 35 एस:: एलएसएच 10-जीएफपी निर्माण)।
      2. नकारात्मक नियंत्रण: ओटीएलडी 1-एमआरएफपी + एलएसएच 4-जीएफपी (पी 35 एस को आश्रय देने वाले बैक्टीरिया:: ओटीएलडी 1-एमआरएफपी और पी 35 एस:: एलएसएच 4-जीएफपी निर्माण)।
      3. नकारात्मक नियंत्रण: एलएसएच 10-जीएफपी + मुक्त एमआरएफपी (पी 35 एस को आश्रय देने वाले बैक्टीरिया:: एलएसएच 10-जीएफपी और पीपीजेडपी-आरसीएस 2 ए-डीईएसटी-एमआरएफपी-सी 1 निर्माण)।
      4. सकारात्मक नियंत्रण: mRFP-GFP (पी 35 एस को परेशान करने वाले बैक्टीरिया:: mRFP-GFP निर्माण)।
    6. कोशिकाओं को 0.5-1 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. कृषि घुसपैठ का प्रदर्शन करें।
    1. बैक्टीरियल कल्चर को 1 एमएल सुई रहित सिरिंज में लोड करें।
    2. धीरे से लेकिन दृढ़ता से सिरिंज के नोजल को पूरी तरह से विस्तारित एन बेंथामियाना पत्तियों के अक्षीय पक्ष के खिलाफ दबाएं, जबकि पत्ती को अक्षीय पक्ष पर एक प्यारी उंगली के साथ पकड़ें।
    3. एक पत्ती पर चार स्थानों तक घुसपैठ करें, प्रति पौधे तीन पत्ते, प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के लिए दो या तीन पौधे। क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए नमूनों के बीच दस्ताने बदलें।
    4. कृषिभूत्सित पौधों को समान परिस्थितियों में एक ही विकास कक्ष में बनाए रखें, जैसा कि चरण 2.1.2 में वर्णित है, 24 घंटे से 36 घंटे तक। एग्रोइंफिलट्रेटेड पौधों को 36 घंटे से अधिक समय तक न रखें, क्योंकि इससे प्रतिदीप्ति संकेत कम हो जाएगा।

3. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. प्रतिदीप्ति विज़ुअलाइज़ेशन के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें।
    1. घुसपैठ के 24-36 घंटे के बाद, नसों के बीच प्रत्येक एग्रोइनफिल्ट्रेटेड पत्ती को छोटे टुकड़ों (2 मिमी x 4 मिमी) में काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
    2. पत्ती के टुकड़ों को कांच की स्लाइड पर रखें, जिसमें अक्षीय पत्ती की सतह ऊपर की ओर हो। पत्ती के टुकड़ों पर पानी की एक बूंद रखें और उन्हें कवर ग्लास से कवर करें। हवा के बुलबुले को हटाने के लिए कवर ग्लास को थोड़ा टैप करें।
    3. माइक्रोस्कोप और लेजर चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें)। विशिष्ट फ्रेट मापदंडों (चरण 3.2 और 3.3) के तहत इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्टेज होल्डर में स्लाइड रखें।
    4. जीएफपी और एमआरएफपी संकेतों दोनों को प्रदर्शित करने वाली कोशिकाओं की पहचान करने के लिए 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग करके अवलोकन शुरू करें, और फिर बाद के विस्तृत अवलोकनों के लिए 40x उद्देश्य लेंस का उपयोग करें।
      नोट: महत्वपूर्ण रूप से, एसई-फ्रेट और एबी-फ्रेट आमतौर पर एक ही ऊतक नमूने पर किए जाते हैं, जिससे फ्रेट चैनल को छोड़कर एक ही चैनल सेटिंग्स (चरण 3.2) का उपयोग करने की अनुमति मिलती है, जिसे क्रमशः एसई-फ्रेट और एबी-फ्रेट अवलोकनों के लिए चालू /बंद किया जाता है (चरण 3.2.2.3 और 3.3.1)।
  2. एसई-फ्रेट (चित्रा 1 ए) के लिए पैरामीटर सेट करें।
    1. बहु-आयामी अधिग्रहण (MDA) उपकरण खोलें।
    2. एक ही क्षेत्र में तीन कॉन्फोकल चैनलों का एक सेट स्थापित करें (पूरक चित्र 1)।
      1. 405 एनएम उत्तेजना लेजर और 400-597 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ दाता फ्लोरोक्रोम के उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए दाता चैनल (जीएफपी चैनल) सेट करें।
      2. 561 एनएम उत्तेजना लेजर और 400-597 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ स्वीकर्ता फ्लोरोक्रोम के उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए स्वीकर्ता चैनल (एमआरएफपी चैनल) सेट करें।
        नोट: एमआरएफपी के लिए उत्सर्जन फिल्टर 400-597 एनएम पर सेट किया गया था ताकि एमआरएफपी सिग्नल को 597-617 एनएम (चरण 3.2.2.3) पर फ्रेट सिग्नल से अलग किया जा सके और इसलिए, फ्रेट-स्वतंत्र एमआरएफपी उत्सर्जन को कम किया जा सके।
      3. दाता की उत्तेजना और 405 एनएम उत्तेजना लेजर और 597-617 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ स्वीकर्ता फ्लोरोक्रोम के उत्सर्जन के लिए फ्रेट चैनल सेट करें।
    3. फोटोब्लीचिंग से बचने के दौरान फ्रेट का निरीक्षण करने के लिए दाता उत्तेजना तीव्रता को न्यूनतम स्तर पर सेट करें, एसई-फ्रेट दक्षता को कम करें।
      नोट: फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए फ्रेट प्रक्रिया का संचालन करने से पहले इस उत्तेजना तीव्रता को प्रयोगात्मक रूप से चुना जाता है। यह पत्ती की मोटाई, उम्र और ओवरएक्प्रेशन के बाद के समय के आधार पर भिन्न होता है।
    4. दाता को उत्तेजित करें और स्वीकर्ता के अपेक्षित प्रतिदीप्ति संकेत वाली कोशिकाओं के लिए स्कैन करें।
    5. उस क्षेत्र का चयन करें जिसमें ब्याज का प्रतिदीप्ति संकेत शामिल है।
    6. स्नैप बटन दबाकर एसई-फ्रेट छवि अनुक्रम प्राप्त करें।
      1. छवि 10-15 कोशिकाएं जो पहले एमआरएफपी-जीएफपी निर्माण (सकारात्मक नियंत्रण) को व्यक्त करती हैं; कैप्चर किए जाने वाले रुचि के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए फोकस, ज़ूम और स्मार्ट गेन पैरामीटर समायोजित करें (पूरक चित्रा 2)।
      2. एक ही सेटिंग्स का उपयोग करते हुए, छवि 10-15 कोशिकाएं, प्रत्येक ओटीएलडी 1-एमआरएफपी, मुफ्त एमआरएफपी, एलएसएच 10-जीएफपी, या एलएसएच 4-जीएफपी को अलग से व्यक्त करती हैं।
        नोट: इन छवियों को इमेजजे के "पिक्सफ्रेट" प्लग-इन ( सामग्री की तालिका देखें) द्वारा प्राप्त किया जाता है, जिसका उपयोग फ्रेट डेटा विश्लेषण (चरण 3.4.1) के लिए किया गया था ताकि स्वीकर्ताओं और दाताओं के लिए वर्णक्रमीय ब्लीड-थ्रू (एसबीटी) मूल्यों को निर्धारित किया जा सके; इन छवियों का उपयोग सॉफ्टवेयर द्वारा ओटीएलडी 1-एमआरएफपी + एलएसएच 10-जीएफपी, ओटीएलडी 1-एमआरएफपी + एलएसएच 4-जीएफपी, और एलएसएच 10-जीएफपी + मुक्त एमआरएफपी प्रोटीन जोड़े (चरण 3.2.6.3) के लिए एसई-फ्रेट छवियों को उत्पन्न करने के लिए किया जाता है।
      3. इसके अलावा, समान सेटिंग्स का उपयोग करते हुए, छवि 10-15 कोशिकाएं ओटीएलडी 1-एमआरएफपी + एलएसएच 10-जीएफपी, ओटीएलडी 1-एमआरएफपी + एलएसएच 4-जीएफपी, और एलएसएच 10-जीएफपी + मुक्त एमआरएफपी प्रोटीन जोड़े को सह-व्यक्त करती हैं।
  3. AB-FRET (चित्रा 1B) के लिए पैरामीटर सेट करें।
    1. एसई-फ्रेट (चरण 3.2.2) के लिए निर्धारित दाता और स्वीकर्ता चैनल पैरामीटर का उपयोग करें, लेकिन फ्रेट चैनल को बंद करें।
    2. स्वीकर्ता (एमआरएफपी) के फोटोब्लीचिंग के लिए पैरामीटर सेट करें (पूरक चित्रा 3)।
      1. सुनिश्चित करें कि पांच छवियों के बाद ब्लीचिंग शुरू होती है। प्रत्येक क्षेत्र ब्लीच के लिए 200 पुनरावृत्तियों की अनुमति दें। 561 एनएम पर 100% लेजर तीव्रता रखें।
      2. 45 सेकंड की विरंजन अवधि बनाए रखें। 400 हर्ट्ज पर 512 x 512 पिक्सेल की स्कैन गति सुनिश्चित करें।
    3. ब्लीच किए जाने के लिए सेल के क्षेत्र को खींचें; उदाहरण के लिए, परमाणु इंटरैक्शन के लिए, सेल न्यूक्लियस39 के पूरे क्षेत्र के आसपास रुचि के क्षेत्रों को खींचा जाता है।
    4. प्रारंभ प्रयोग बटन दबाकर विरंजन को सक्रिय करें; इस फ़ंक्शन को सक्रिय करने से फोटोब्लीचिंग होगी और एबी-फ्रेट छवि अनुक्रम प्राप्त होगा।
  4. फ्रेट डेटा का विश्लेषण करें।
    1. एसई-फ्रेट डेटा का विश्लेषण करने के लिए, एसबीटी40 (चरण 3.2.6.2) को घटाने के बाद एसई-फ्रेट दक्षता की सही छवियों को उत्पन्न करने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर के लिए "पिक्सफ्रेट" प्लग-इन का उपयोग करें।
    2. एबी-फ्रेट डेटा का विश्लेषण करने के लिए, निम्नलिखित सूत्र41 का उपयोग करके एमआरएफपी फोटोब्लीचिंग के बाद जीएफपी उत्सर्जन में प्रतिशत वृद्धि के रूप में %AB-FRET की गणना करें: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, जहां GFPpost mRFP फोटोब्लीचिंग के बाद GFP उत्सर्जन है, और GFPPRFP फोटोब्लीचिंग से पहले GFP उत्सर्जन है।
    3. फ्रेट छवियों की समीक्षा करते समय, फ्रेट सिग्नल के उपकोशिकीय स्थानीयकरण पर ध्यान दें।
      नोट: कई मामलों में, इन सेलुलर डिब्बों (जैसे, नाभिक, क्लोरोप्लास्ट, ईआर, आदि) को आसानी से पहचाना जा सकता है और, फ्रेट तकनीक के अतिरिक्त लाभ के रूप में, बातचीत करने वाले प्रोटीन के जैविक कार्य के लिए महत्वपूर्ण सुराग प्रदान करते हैं।

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Representative Results

चित्रा 2 एक एसई-फ्रेट प्रयोग के विशिष्ट परिणामों को दर्शाता है, जिसमें सेल नाभिक को एक साथ तीन चैनलों (यानी, दाता जीएफपी, स्वीकर्ता एमआरएफपी और एसई-फ्रेट) में दर्ज किया गया था। इन आंकड़ों का उपयोग छद्म-रंग पैमाने में कोडित एसई-फ्रेट दक्षता की छवियों को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। इस पैमाने पर, नीले से लाल रंग में संक्रमण फ्रेट दक्षता में वृद्धि से मेल खाता है, प्रोटीन-प्रोटीन निकटता का माप 0% से 100% तक। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, एसई-फ्रेट सिग्नल को सेल न्यूक्लियस में दर्ज किया गया था, और एलएसएच 10 और ओटीएलडी 1 के सह-अभिव्यक्ति के बाद इसकी तीव्रता एमआरएफपी-जीएफपी (यानी, सकारात्मक नियंत्रण) की अभिव्यक्ति के बाद देखी गई तीव्रता के बराबर थी। नकारात्मक नियंत्रणों (यानी, ओटीएलडी 1-एमआरएफपी और एलएसएच 4-जीएफपी या मुक्त एमआरएफपी और एलएसएच 10-जीएफपी की सह-अभिव्यक्ति) में कोई एसई-फ्रेट नहीं देखा गया था।

एलएसएच 10-ओटीएलडी 1 इंटरैक्शन को एबी-फ्रेट का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। इसके लिए, दाता जीएफपी प्रतिदीप्ति को दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति माप (पूरक चित्रा 4) की फोटोब्लीचिंग समय श्रृंखला के रूप में स्वीकर्ता एमआरएफपी के फोटोब्लीचिंग से पहले और बाद में सेल नाभिक में दर्ज किया गया था। जीएफपी प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए रिकॉर्ड किए गए सेल नाभिक की छवियों को छद्म रंग में प्रस्तुत किया गया था। चित्र 3 से पता चलता है कि एलएसएच 10-जीएफपी / ओटीएलडी 1-एमआरएफपी सहअभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप एमआरएफपी स्वीकर्ता को फोटोब्लीच किए जाने के बाद जीएफपी दाता प्रतिदीप्ति में वृद्धि हुई और फ्लोरेस करने की क्षमता खो दी गई। दाता प्रतिदीप्ति में एक समान वृद्धि एमआरएफपी-जीएफपी सकारात्मक नियंत्रण में देखी गई थी, लेकिन एलएसएच 4-जीएफपी / ओटीएलडी 1-एमआरएफपी या एलएसएच 10-जीएफपी / एमआरएफपी सहअभिव्यक्ति के नकारात्मक नियंत्रण में नहीं, जबकि स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति सभी फोटोब्लीचिंग प्रयोगों में निष्क्रिय थी। चित्रा 4 एबी-फ्रेट डेटा के मात्रात्मक विश्लेषण को दर्शाता है, जो एलएसएच 10 और ओटीएलडी 1 को व्यक्त करने के बाद लगभग 13% की दाता प्रतिदीप्ति (% एबी-फ्रेट) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण वृद्धि का प्रदर्शन करता है। सकारात्मक mRFP-GFP नियंत्रण ने लगभग 30% की %AB-FRET का उत्पादन किया, जबकि नकारात्मक नियंत्रणों ने %AB-FRET का उत्पादन नहीं किया। एसई-फ्रेट और एबी-फ्रेट दोनों छवियों ने सेल नाभिक में फ्रेट सिग्नल दिखाया, जो प्रतिलेखन कारक-हिस्टोन-संशोधित एंजाइम परिसरों के साथ-साथ जीएफपी / एमआरएफपी प्रोटीन34 (चित्रा 2 और चित्रा 3) की न्यूक्लियोसाइटोप्लाज्मिक प्रकृति के लिए अपेक्षित उपकोशिकीय स्थानीयकरण के अनुरूप है।

सारांश में, प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है कि इस फ्रेट प्रोटोकॉल का उपयोग हिस्टोन-संशोधित एंजाइमों और प्रतिलेखन कारकों के बीच बातचीत को प्रदर्शित करने और निर्धारित करने और जीवित पौधों की कोशिकाओं में उनके उपकोशिकीय स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: SE-FRET और AB-FRET तकनीकों का योजनाबद्ध सारांश। (A) SE-FRET का मूल सिद्धांत। परीक्षण किए गए प्रोटीनों में से एक को जीएफपी के साथ टैग किया गया है, जो दाता फ्लोरोक्रोम के रूप में कार्य करता है, और दूसरा एमआरएफपी के साथ, जो स्वीकर्ता फ्लोरोक्रोम के रूप में कार्य करता है। दाता अणु उत्साहित है, और स्वीकर्ता उत्सर्जन दर्ज किया गया है। यदि परीक्षण किए गए प्रोटीन एक-दूसरे के साथ बातचीत करते हैं जैसे कि वे एक-दूसरे के 10 एनएम के भीतर स्थित होते हैं, तो उत्तेजित दाता से ऊर्जा को गैर-विकिरण रूप से स्वीकर्ता में स्थानांतरित किया जाता है, जो तब उत्तेजित हो जाता है और फ्रेट उत्सर्जन चैनल में प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है। यदि कोई बातचीत नहीं होती है, तो दाता से स्वीकर्ता को कोई ऊर्जा स्थानांतरित नहीं होती है, और स्वीकर्ता द्वारा कोई फ्रेट उत्सर्जन का पता नहीं लगाया जाता है। (बी) एबी-फ्रेट का मूल सिद्धांत। परीक्षण किए गए प्रोटीन को एसई-फ्रेट के लिए (ए) में वर्णित के रूप में टैग किया गया है। दाता अणु उत्तेजित होता है, और यदि परीक्षण किए गए प्रोटीन के बीच बातचीत होती है, तो दाता स्वीकर्ता को गैर-विकिरण फैशन में उत्तेजित करता है, जिसके परिणामस्वरूप फ्रेट होता है। फिर, स्वीकर्ता को फोटोब्लीचिंग द्वारा स्थायी रूप से निष्क्रिय कर दिया जाता है, जिससे दाता से गैर-विकिरण ऊर्जा को स्वीकार करने और फ्रेट उत्सर्जन चैनल में फ्रेट फ्लोरेसेंस का उत्सर्जन करने की क्षमता खो जाती है; दूसरी ओर, दाता द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है क्योंकि दाता गैर-विकिरण हस्तांतरण द्वारा कम ऊर्जा खो देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: एसई-फ्रेट द्वारा पता लगाए गए एन बेंथामियाना पत्तियों में ओटीएलडी 1 के साथ एलएसएच 10 की विशिष्ट बातचीत। संकेतित प्रोटीन संयोजनों के लिए तीन डिटेक्शन चैनलों (दाता, स्वीकर्ता और एसई-फ्रेट) से छवियां दिखाई जाती हैं। एसई-फ्रेट दक्षता छवियों की गणना वर्णक्रमीय रक्तस्राव-माध्यम (एसबीटी) के घटाव द्वारा की गई थी और छद्म रंग में दिखाया गया है, जिसमें रंग लाल और नीले क्रमशः उच्चतम और निम्नतम संकेत को दर्शाते हैं। (ए) एमआरएफपी-जीएफपी सकारात्मक नियंत्रण द्वारा उत्पादित उच्च एसई-फ्रेट दक्षता संकेत। (बी) एलएसएच 10-जीएफपी और ओटीएलडी 1-एमआरएफपी प्रोटीन द्वारा उत्पादित सकारात्मक एसई-फ्रेट दक्षता संकेत। (ग) नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन एलएसएच4-जीएफपी और ओटीएलडी1-एमआरएफपी के सह-अभिव्यक्ति ने कोई एसई-फ्रेट दक्षता संकेत उत्पन्न नहीं किया। (डी) नकारात्मक नियंत्रण-मुक्त एमआरएफपी प्रोटीन और एलएसएच 10-जीएफपी के सह-अभिव्यक्ति ने कोई एसई-फ्रेट दक्षता संकेत उत्पन्न नहीं किया। स्केल पट्टियाँ = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एबी-फ्रेट द्वारा पता लगाए गए एन बेंथामियाना पत्तियों में ओटीएलडी 1 के साथ एलएसएच 10 की विशिष्ट बातचीत। फोटोब्लीचिंग से पहले और बाद में दो डिटेक्शन चैनलों (दाता और स्वीकर्ता) से छवियां संकेतित प्रोटीन संयोजनों के लिए दिखाई जाती हैं। वृत्त फोटोब्लीच किए गए क्षेत्र को इंगित करता है। एबी-फ्रेट, जिसे एमआरएफपी फोटोब्लीचिंग के बाद जीएफपी फ्लोरेसेंस में वृद्धि के रूप में देखा जाता है, को लाल और नीले रंगों के साथ छद्म रंग का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है, जो क्रमशः उच्चतम और निम्नतम संकेत को दर्शाता है। (ए) एमआरएफपी-जीएफपी सकारात्मक नियंत्रण द्वारा उत्पादित जीएफपी दाता प्रतिदीप्ति में वृद्धि। (बी) एलएसएच 10-जीएफपी और ओटीएलडी 1-एमआरएफपी प्रोटीन द्वारा उत्पादित जीएफपी दाता प्रतिदीप्ति में वृद्धि। (सी) नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन एलएसएच 4-जीएफपी और ओटीएलडी 1-एमआरएफपी के सह-अभिव्यक्ति ने जीएफपी दाता प्रतिदीप्ति में नगण्य परिवर्तन पैदा किए। (डी) नकारात्मक नियंत्रण मुक्त एमआरएफपी प्रोटीन और एलएसएच 10-जीएफपी की सह-अभिव्यक्ति ने जीएफपी दाता प्रतिदीप्ति में नगण्य परिवर्तन पैदा किए। स्केल पट्टियाँ = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एबी-फ्रेट का परिमाणीकरण। एमआरएफपी फोटोब्लीचिंग (% एबी-फ्रेट) के बाद जीएफपी दाता प्रतिदीप्ति में प्रतिशत वृद्धि संकेतित प्रोटीन संयोजनों के लिए दिखाई गई है। त्रुटि पट्टियाँ प्रत्येक माप के लिए n = 13 कक्षों के माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं। दो पूंछ वाले टी-टेस्ट ने निर्धारित किया कि औसत मूल्यों के बीच अंतर पी-मानों के लिए सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं * पी < 0.05, ** पी < 0.01, और *** पी < 0.001; पी≥ 0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं हैं (एनएस)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राइमर का नाम अनुक्रम (5' से 3') लक्ष्य
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag सीडीएनए से ओटीएलडी 1 को बढ़ाएं
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaagctgggtgttccgtggctttgcctgctc सीडीएनए से ओटीएलडी 1 को बढ़ाएं
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgtcctccaagagaagagg सीडीएनए से एलएसएच 10 को बढ़ाएं
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaac सीडीएनए से एलएसएच 10 को बढ़ाएं
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg सीडीएनए से एलएसएच 4 को बढ़ाएं
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc सीडीएनए से एलएसएच 4 को बढ़ाएं
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggccccctccggacgt pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 से mRFP को बढ़ाएं
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaagagctgggtgttggatctgccccccgggg pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 से mRFP को बढ़ाएं
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण द्वारा pDONR207 में अनुक्रमों की पुष्टि करें
AttL2 gtaacatcagagattttgacac पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण द्वारा pDONR207 में अनुक्रमों की पुष्टि करें
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण द्वारा गंतव्य वैक्टर में अनुक्रमों की पुष्टि करें
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण द्वारा गंतव्य वैक्टर में अनुक्रमों की पुष्टि करें
35 एस प्रमोटर एफडब्ल्यू ctatccttcgcaagacccttc पीसीआर द्वारा गंतव्य वैक्टर में अनुक्रमों की पुष्टि करें

तालिका 1: क्लोनर 207 और गंतव्य वैक्टर में क्लोन अनुक्रमों की क्लोनिंग और पुष्टि करने के लिए प्राइमर। एफडब्ल्यू, फॉरवर्ड प्राइमर; आरवी, रिवर्स प्राइमर।

पूरक चित्रा 1: कॉन्फोकल चैनलों के लिए पैरामीटर सेट करना। (ए) दाता चैनल (जीएफपी) के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन पैरामीटर सेटअप के लिए स्क्रीनशॉट। (बी) स्वीकर्ता चैनल (एमआरएफपी) के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन पैरामीटर सेटअप के लिए स्क्रीनशॉट। (सी) फ्रेट चैनल के लिए उत्तेजना और उत्सर्जन पैरामीटर सेटअप के लिए स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: रुचि के नमूने के एसई-फ्रेट छवियों के अधिग्रहण के लिए मापदंडों को समायोजित करना। (ए) स्कैन क्षेत्र पैरामीटर सेटअप के लिए स्क्रीनशॉट (यानी, छवि आकार, स्कैन गति, दिशा और औसत)। (बी) जीएफपी चैनल पैरामीटर सेटअप (यानी, लेजर, पिनहोल, मास्टर गेन और डिजिटल गेन) के लिए स्क्रीनशॉट। (सी) एमआरएफपी चैनल पैरामीटर सेटअप (यानी, लेजर, पिनहोल, मास्टर गेन और डिजिटल गेन) के लिए स्क्रीनशॉट। (डी) फ्रेट चैनल पैरामीटर सेटअप (यानी, लेजर, पिनहोल, मास्टर गेन और डिजिटल गेन) के लिए स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: स्वीकर्ता फोटोब्लीचिंग के लिए पैरामीटर सेट करना। (ए) स्कैन क्षेत्र पैरामीटर सेटअप के लिए स्क्रीनशॉट (यानी, छवि आकार, स्कैन गति, दिशा और औसत)। (बी) समय श्रृंखला और समय विरंजन पैरामीटर सेटअप के लिए स्क्रीनशॉट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 4: एपी-फ्रेट के दौरान दाता और स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति माप की समय श्रृंखला। फोटोब्लीचिंग अवधि से पहले, दौरान और बाद में संकेतित नमूनों के लिए स्वीकर्ता (एमआरएफपी) और दाता (जीएफपी) प्रतिदीप्ति के कैनेटीक्स निर्धारित किए गए थे। (ए) सकारात्मक एमआरएफपी-जीएफपी नियंत्रण। (बी) एलएसएच 10-जीएफपी + ओटीएलडी 1-एमआरएफपी। (सी) नकारात्मक एलएसएच 4-जीएफपी + ओटीएलडी 1-एमआरएफपी नियंत्रण। (डी) नकारात्मक एलएसएच 10-जीएफपी + मुक्त एमआरएफपी नियंत्रण। पीली रेखाएं फोटोब्लीचिंग समय अवधि को इंगित करती हैं। सफेद वक्र प्रतिदीप्ति कैनेटीक्स के माप को प्लॉट करते हैं। प्रत्येक पैनल में, ऊपरी और निचली छवियां क्रमशः स्वीकर्ता (एमआरएफपी) और दाता (जीएफपी) प्रतिदीप्ति के कैनेटीक्स दिखाती हैं। ध्यान दें कि, स्वाभाविक रूप से, जीएफपी प्रतिदीप्ति अक्सर समय के साथ कम हो जाती है क्योंकि लेजर धीरे-धीरे जीएफपी को ही फोटोब्लीच करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह फ्रेट प्रोटोकॉल सरल और पुन: उत्पन्न करने में आसान है; यह न्यूनतम आपूर्ति निवेश की भी आवश्यकता है और कई आधुनिक प्रयोगशालाओं के लिए मानक उपकरणों का उपयोग करता है। विशेष रूप से, पांच मुख्य तकनीकी विशेषताएं इस प्रक्रिया की बहुमुखी प्रतिभा को अलग करती हैं। सबसे पहले, फ्रेट संरचनाएं साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन का उपयोग करके उत्पन्न होती हैं, एक क्लोनिंग दृष्टिकोण जो उपयोग करना आसान है, सटीक परिणाम उत्पन्न करता है, और पारंपरिक प्रतिबंध एंजाइम-आधारित क्लोनिंग की तुलना में समय बचाता है। बेंथामियाना पौधे बढ़ने के लिए सरल हैं, अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में ऊतक का उत्पादन करते हैं और अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं। तीसरा, एग्रोइनफिल्ट्रेशन के परिणामस्वरूप वितरित संरचनाओं की क्षणिक अभिव्यक्ति होती है और इस प्रकार, ट्रांसजेनिक पौधों का उत्पादन करने के लिए आवश्यक महीनों की तुलना में अपेक्षाकृत कम समय (यानी, 24-36 घंटे) के भीतर डेटा उत्पन्न होता है। चौथा, सह-कृषि घुसपैठ द्वारा रुचि के निर्माण के विभिन्न संयोजनों को वितरित करने की क्षमता किसी भी प्रोटीन के बीच बातचीत के परीक्षण की अनुमति देती है। अंत में, एसई-फ्रेट और एबी-फ्रेट दोनों को लेजर चैनल सेटिंग्स में से एक को चालू / बंद करके एक ही ऊतक नमूने पर क्रमिक रूप से किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि माइक्रोबॉम्बार्डमेंट डिलीवरी42 का उपयोग एग्रोइनफिल्ट्रेशन के बजाय पौधे के ऊतकों में निर्माण वितरण के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में किया जा सकता है; इस मामले में, कृषि घुसपैठ के लिए आवश्यक बाइनरी वैक्टर का उपयोग अनावश्यक है।

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम फ्रेट दक्षता को अनुकूलित करने के लिए दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोक्रोम जोड़ी का ठीक से चयन करना है। निम्नलिखित तीन कारकों पर विचार किया जाना चाहिए: (1) दाता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को स्थानांतरित ऊर्जा की मात्रा को अधिकतम करने के लिए स्वीकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रम को अधिकतम रूप से ओवरलैप करने की आवश्यकता होती है; (2) दाता और स्वीकर्ता के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को एक दूसरे से अलग करने और माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाए गए सिग्नल के एसबीटी को कम करने के लिए पर्याप्त रूप से अलग होना चाहिए; (3) दाता के उत्तेजना के दौरान स्वीकर्ता की उत्तेजना को कम करने के लिए स्वीकर्ता के अधिकतम अवशोषण पर स्वीकर्ता को न्यूनतम प्रत्यक्ष उत्तेजना होनी चाहिए। उपयोग किए जाने वाले सामान्य दाता / स्वीकर्ता फ्रेट जोड़े सियान / पीले और हरे / लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (यानी, सीएफपी / वाईएफपी और जीएफपी / एमआरएफपी, क्रमशः) हैं। यह प्रोटोकॉल जीएफपी / एमआरएफपी जोड़ी का उपयोग करता है क्योंकि यह लाइव सेल इमेजिंग के लिए उपयुक्त है और, सियान / पीले फ्रेट जोड़े के विपरीत, कम फोटोटॉक्सिसिटी और कम फोटोब्लीचिंग43 प्रदर्शित करता है। सुविधाजनक रूप से, फ्रेट जोड़ी (यानी, एमआरएफपी-जीएफपी) के बीच ट्रांसलेशनल संलयन एक आदर्श फ्रेट सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।

एक और महत्वपूर्ण कदम उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रणों का चयन है। उदाहरण के लिए, LSH10-OTLD1 इंटरैक्शन के मामले में, FRET विश्लेषण में हमेशा अकेले OTLD1 की अभिव्यक्ति, अकेले LSH10, और प्रोटीन के साथ OTLD1 और LSH10 की सह-अभिव्यक्ति शामिल होनी चाहिए, जिसके लिए बातचीत की उम्मीद नहीं है (यानी, LSH4 और मुक्त mRFP, क्रमशः)। नकारात्मक नियंत्रण की पसंद के संदर्भ में, फ्रेट प्रयोग बीआईएफसी तकनीक44 के उपयोग के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं पर दिशानिर्देशों का पालन कर सकते हैं, एक और प्रतिदीप्ति इमेजिंग-आधारित दृष्टिकोण जो जीवित पौधों की कोशिकाओं29,30,31,32 में प्रोटीन इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए अनुकूलित है।

अंत में, फ्रेट प्रयोग को प्रभावित करने वाला एक कारक जीवित पौधों के ऊतकों में सभी प्रयोगों के लिए आम है, और यह सामान्य रूप से पौधे की अलग-अलग शारीरिक स्थितियों और विशेष रूप से, नियंत्रण विकास स्थितियों के तहत बनाए रखने पर भी कृषिभूत परिवर्तित कोशिकाओं से प्राप्त होता है। यह शारीरिक परिवर्तनशीलता व्यक्तिगत प्रयोगों, पौधों और यहां तक कि पत्तियों के बीच फ्रेट डेटा की एक निश्चित परिवर्तनशीलता में योगदान कर सकती है। इस प्रकार, प्रत्येक प्रयोग के लिए प्रति पौधे कम से कम दो पौधों और तीन पत्तियों का उपयोग करना और कृषि घुसपैठ के लिए परिपक्व, पूरी तरह से विस्तारित पत्तियों का चयन करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे बेहतर छवियां उत्पन्न करते हैं।

सभी प्रयोगात्मक पद्धतियों के साथ, फ्रेट की अपनी तकनीकी और उपयोग-आधारित सीमाएं हैं। ऐसा ही एक सीमित कारक ऑटोफ्लोरोसेंट टैग की प्रकृति और रुचि के प्रोटीन (जैसे, अमीनो- या कार्बोक्सिल-टर्मिनस पर) के भीतर इसका स्थान है, जो इस प्रोटीन के जैविक गुणों में हस्तक्षेप कर सकता है, जैसे कि उपकोशिकीय स्थानीयकरण का मूल पैटर्न या इसके प्राकृतिक इंटरएक्टर्स को पहचानने की क्षमता। टैगिंग से पहले, रुचि के प्रत्येक प्रोटीन का विश्लेषण किया जाना चाहिए, जहां तक संभव हो, इसकी संरचनात्मक विशेषताओं के लिए जिन्हें टैगिंग द्वारा समझौता किया जा सकता है। कई मामलों में, हालांकि, टैगिंग मापदंडों को रुचि के प्रोटीन की ज्ञात गतिविधियों के आधार पर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। एक और प्रमुख सीमा फ्रेट का सापेक्ष तकनीकी परिष्कार है, जिसके लिए उपयुक्त हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। कई अन्य प्रोटीन इंटरैक्शन विधियों के विपरीत, जैसे कि खमीर दो-हाइब्रिड सिस्टम (वाई 2 एच) 45,46,47, फ्रेट स्क्रीनिंग अभिव्यक्ति पुस्तकालयों द्वारा प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए अनुपयुक्त है, विशेष रूप से उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन48। इसके अलावा, जैसा कि विवो में किए गए अधिकांश परख, फ्रेट एक जैव रासायनिक रूप से शुद्ध प्रणाली नहीं है, और इस प्रकार, यह बातचीत में अन्य अज्ञात सेलुलर कारकों की संभावित भागीदारी का पता नहीं लगाता है।

प्रोटीन इंटरैक्शन के अन्य परखों के संबंध में फ्रेट का महत्व कम दूरी की बातचीत का पता लगाने, गलत-सकारात्मक परिणामों की संभावना को कम करने, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, ऊतकों और जीवों (पौधों सहित) में विवो में तैनाती के लिए प्रयोज्यता और अंतःक्रियात्मक प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का पता लगाने में निहित है। फ्रेट की इन विशेषताओं में से कई विवो दृष्टिकोणों में अन्य में पाई जाती हैं, जैसे कि स्प्लिट-लूसिफेरस49,50 या बीआईएफसी 29,30,31,32,33, जिनमें से बीआईएफसी शायद सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली इंटरैक्शन परख वाई 2 एच 45,46,47 है; हालांकि, खमीर जीव विज्ञान अनुसंधान के बाहर, यह परख एक हेटरोलॉगस प्रयोगात्मक प्रणाली का उपयोग करती है, जो झूठी सकारात्मकता से ग्रस्त है, और इसके निष्कर्षों को किसी अन्य तकनीक द्वारा पुष्टि की आवश्यकता होती है। वाई 2 एच की एक वैचारिक भिन्नता एक विभाजित-यूबिकिटिन परख है जो झिल्ली प्रोटीन51,52 के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए बेहतर अनुकूल है और जो वाई 2 एच के समान फ्रेट के सापेक्ष सीमाओं को प्रदर्शित करता है। अंत में, प्रोटीन इंटरैक्शन को सह-इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (को-आईपी) द्वारा पता लगाया जा सकता है, जो सेल अर्क के जटिल वातावरण के साथ-साथ सटीक रूप से परिभाषित इन विट्रो प्रतिक्रियाओं में पता लगाने पर लागू होता है। हमारे अनुभव में, को-आईपी विवो दृष्टिकोण में प्रतिदीप्ति-आधारित का उपयोग करके प्राप्त डेटा की पुष्टि करने के लिए एक वैकल्पिक और स्वतंत्र विधि के रूप में सबसे उपयोगी है।

जबकि इस विशिष्ट फ्रेट प्रोटोकॉल को पौधे प्रतिलेखन कारकों और हिस्टोन-संशोधित एंजाइमों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, इसका उपयोग प्रोटीन इनप्लांटा के कई अन्य वर्गों के बीच बातचीत को खोजने और चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई।

Acknowledgments

वीसी की प्रयोगशाला में काम एनआईएच (आर 35 जीएम 144059 और आर01 जीएम 50224), एनएसएफ (एमसीबी 1913165 और आईओएस 1758046), और बार्ड (आईएस -5276-20) से वीसी को अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

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References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
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जीव विज्ञान अंक 188 हिस्टोन संशोधित एंजाइम (एचएमई) प्रतिलेखन कारक (टीएफ) प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन फ्रेट
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Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

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