蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、生細胞におけるタンパク質相互作用を検出するためのイメージング技術です。ここでは、ヒストン修飾酵素と、植物組織における遺伝子発現のエピジェネティックな調節のためにそれらを標的プロモーターに動員する転写因子との関連を研究するためのFRETプロトコルが提示されています。
遺伝子発現のエピジェネティックな調節は、転写抑制または活性化のためにそれぞれヘテロクロマティックまたはユークロマティックヒストンマークを生成するヒストン修飾酵素(HME)によって一般的に影響を受けます。HMEは、転写因子(TF)によって標的クロマチンにリクルートされます。したがって、HMEとTFの間の直接的な相互作用を検出して特徴付けることは、それらの機能と特異性をよりよく理解するために重要です。これらの研究は、生体組織内で in vivo で実施された場合、生物学的により関連性があります。ここでは、植物ヒストンデユビキチナーゼと植物転写因子との間の植物葉における相互作用を蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を用いて可視化するためのプロトコルを記述し、互いに<10nm以内にあるタンパク質分子間の複合体の検出を可能にする。FRET技術の2つのバリエーションが提示される:SE-FRETおよびAB-FRET(アクセプター漂白)は、エネルギーがドナーからアクセプターに非放射的に伝達されるか、アクセプターの光退色時にドナーによって放射的に放出される。SE-FRETとAB-FRETの両方のアプローチは、 プランタ内の他のタンパク質間の他の相互作用を発見するために容易に適応させることができます。
植物ヒストンデユビキチナーゼは、ヒストンの翻訳後修飾、特にモノユビキチル化マークを消去することにより、遺伝子発現を制御する上で重要な役割を果たします1。これまでのところ、OTLD1はシロイヌナズナ2,3において分子レベルで特徴付けられる数少ない植物ヒストンデユビキチナーゼの1つである。OTLD1は、H2Bヒストン分子からモノユビキチン基を除去し、それによって標的遺伝子クロマチン4,5におけるH3ヒストンのユークロマティックアセチル化およびメチル化修飾の除去または付加を促進する。さらに、OTLD1は、別のクロマチン修飾酵素であるヒストンリジン脱メチル化酵素KDM1Cと相互作用して、標的遺伝子の転写抑制に影響を及ぼす6,7。
ほとんどのヒストン修飾酵素はDNA結合能力を欠いているため、標的遺伝子を直接認識することはできません。1つの可能性は、これらの酵素に結合し、それらをクロマチン標的に導くDNA結合転写因子タンパク質と協力することです。具体的には、植物では、いくつかの主要なヒストン修飾酵素(すなわち、ヒストンメチルトランスフェラーゼ8,9、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ10、ヒストンデメチラーゼ11、およびポリコーム抑制複合体12,13,14)が転写因子によってリクルートされることが知られている。この考えと一致して、最近、OTLD1と転写因子LSH1015との特異的なタンパク質間相互作用に基づく、標的プロモーターへのOTLD1リクルートメントの1つの可能なメカニズムが提案された。
LSH10は、中枢発生調節因子として機能する植物ALLOG(シロイヌナズナLSH1およびOryza G1)タンパク質のファミリーに属する16、17、18、19、20、21、22。ALOGタンパク質ファミリーのメンバーにDNA結合モチーフ23が含まれ、転写調節22、核局在19、およびホモ二量体化24の能力を示すという事実は、LSH10を含むこれらのタンパク質が転写のエピジェネティック調節中に特異的転写因子として作用する可能性があるという考えをさらに裏付けるものです。in vivoでのLSH10-OTLD1相互作用の特性評価に使用される主な実験技術の1つは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)15です。
FRETは、生細胞内のタンパク質同士25<10nm以内の近距離相互作用を直接検出するイメージング技術です。FRETアプローチ26には、増感発光(SE-FRET)(図1A)とアクセプター漂白(AB-FRET)(図1B)の2つの主要なバリエーションがあります。SE-FRETでは、相互作用するタンパク質(一方はドナー蛍光色素(例えば、緑色蛍光タンパク質、GFP)でタグ付けされ、もう一方はアクセプター蛍光色素(例えば、単量体赤色蛍光タンパク質、mRFP27,28)でタグ付けされ、励起状態エネルギーをドナーからアクセプターに非放射的に伝達する。この転送中に光子が放出されないため、アクセプターと同様の放射発光スペクトルを持つ蛍光シグナルが生成されます。AB-FRETでは、アクセプターが光退色によって永久に不活性化され、ドナーから伝達された非放射エネルギーを受け取ることができない場合、ドナーの放射放出の上昇に基づいてタンパク質相互作用が検出され、定量化されます(図1)。重要なことに、FRET蛍光の細胞内位置は、細胞内の相互作用タンパク質の局在を示すものである。
FRETを生体組織に展開し、相互作用タンパク質の細胞内局在を決定すると同時にこの相互作用自体を検出することができるため、FRETはin vivoでのタンパク質間相互作用の研究および初期特性評価に最適な技術となっています。同等のインビボ蛍光イメージング方法論である二分子蛍光相補(BiFC)29,30,31,32は、良好な代替アプローチであるが、FRETとは異なり、BiFCは自己蛍光BiFCレポーター33の自発的な集合により偽陽性を生じる可能性があり、そのデータの定量化はそれほど正確ではない。
本稿では、SE-FRETとAB-FRETの両方の技術の実装における成功事例を共有し、植物細胞におけるOTLD1とLSH10の相互作用を調査するための展開のプロトコルを紹介します。
このFRETプロトコルはシンプルで再現が簡単です。また、最小限の供給投資を必要とし、多くの近代的な研究所で標準装置を利用しています。具体的には、5つの主要な技術的特徴がこの手順の多様性を区別します。まず、FRETコンストラクトは、従来の制限酵素ベースのクローニングと比較して使いやすく、正確な結果を生成し、時間を節約するクローニングアプローチである部位特異的組換?…
The authors have nothing to disclose.
VCの研究室での作業は、NIH(R35GM144059およびR01GM50224)、NSF(MCB1913165およびIOS1758046)、およびBARD(IS-5276-20)からVCへの助成金によってサポートされています。
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) | Sigma-Aldrich | #D134406-1G | |
Bacto Agar | BD Biosciences | #214010 | |
Bacto trypton | BD Biosciences | #211705 | |
Bacto yeast extract | BD Biosciences | #212750 | |
Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM900 | Any CLSM with similar capabilities is suitable |
EHA105 | VWR | 104013-310 | We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection |
Gateway BP Clonase II | Invitrogen | #11789100 | |
Gateway LR Clonase II | Invitrogen | #11791020 | |
GV3101 | VWR | 104013-296 | We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection |
ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
MES | Sigma-Aldrich | #69889-10G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | #63068-250G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | #S5886-500G | |
Nicotiana benthamiana seeds | Herbalistics Pty | RA4 or LAB | We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection |
pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 | N/A | Refs. 15, 28 | |
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 | N/A | Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28) | |
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 | N/A | Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct | |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | #R7382-5G | |
Spectinomycin | Sigma-Aldrich | #S4014-5G | |
Syringes without needles | BD | 309659 | |
Zen software for CLSM imaging | Zeiss | ZEN 3.0 version | The software should be compatible with the CLSM used |