Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Abstract

Epigenetische regulatie van genexpressie wordt vaak beïnvloed door histonmodificerende enzymen (HME's) die heterochromatische of euchromatische histonmarkeringen genereren voor respectievelijk transcriptionele repressie of activering. HME's worden gerekruteerd voor hun doelchromatine door transcriptiefactoren (TF's). Het detecteren en karakteriseren van directe interacties tussen HME's en TF's is dus van cruciaal belang om hun functie en specificiteit beter te begrijpen. Deze studies zouden biologisch relevanter zijn als ze in vivo worden uitgevoerd in levende weefsels. Hier wordt een protocol beschreven voor het visualiseren van interacties in plantenbladeren tussen een plant histon deubiquitinase en een plant transcriptiefactor met behulp van fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET), die de detectie van complexen tussen eiwitmoleculen die zich binnen <10 nm van elkaar bevinden. Twee varianten van de FRET-techniek worden gepresenteerd: SE-FRET (sensitized emission) en AB-FRET (acceptor bleaching), waarbij de energie niet-radiatief van de donor naar de acceptor wordt overgebracht of stralingsbestraling door de donor wordt uitgezonden bij fotobleaching van de acceptor. Zowel SE-FRET- als AB-FRET-benaderingen kunnen eenvoudig worden aangepast om andere interacties tussen andere eiwitten in planta te ontdekken.

Introduction

Plant histon deubiquitinasen spelen een belangrijke rol bij het beheersen van genexpressie door post-translationele modificatie van histonen, met name door het wissen van hun monoubiquityleringsmarkeringen1. Tot nu toe is OTLD1 een van de weinige plantaardige histondeubiquitinasen die op moleculair niveau worden gekarakteriseerd in Arabidopsis 2,3. OTLD1 verwijdert monoubiquitinegroepen uit de H2B-histonmoleculen, waardoor de verwijdering of toevoeging van euchromatische acetylering en methylatiemodificaties van H3-histonen in het doelgenchromatine 4,5 wordt bevorderd. Bovendien interageert OTLD1 met een ander chromatine-modificerend enzym, het histon lysine demethylase KDM1C, om transcriptionele onderdrukking van de doelgenen te beïnvloeden 6,7.

De meeste histonmodificerende enzymen missen DNA-bindingsmogelijkheden en kunnen daarom hun doelgenen niet direct herkennen. Een mogelijkheid is dat ze samenwerken met DNA-bindende transcriptiefactoreiwitten die deze enzymen binden en naar hun chromatinedoelen leiden. Met name in planten is bekend dat verschillende belangrijke histonmodificerende enzymen (d.w.z. histonmethyltransferasen 8,9, histonacetyltransferases10, histondemethylases11 en Polycomb-repressieve complexen 12,13,14) worden gerekruteerd door transcriptiefactoren. In overeenstemming met dit idee werd onlangs een mogelijk mechanisme voor OTLD1-rekrutering voor de doelpromotors voorgesteld dat is gebaseerd op specifieke eiwit-eiwitinteracties van OTLD1 met een transcriptiefactor LSH1015.

LSH10 behoort tot een familie van de plantaardige ALOG (Arabidopsis LSH1 en Oryza G1) eiwitten die functioneren als centrale ontwikkelingsregulatoren 16,17,18,19,20,21,22. Het feit dat de leden van de ALOG-eiwitfamilie DNA-bindingsmotieven23 bevatten en de capaciteiten voor transcriptionele regulatie22, nucleaire lokalisatie19 en homodimerisatie24 vertonen, geeft verdere ondersteuning aan het idee dat deze eiwitten, waaronder LSH10, kunnen fungeren als specifieke transcriptiefactoren tijdens epigenetische regulatie van transcriptie. Een van de belangrijkste experimentele technieken die worden gebruikt om de LSH10-OTLD1-interactie in vivo te karakteriseren, is fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET)15.

FRET is een beeldvormingstechniek voor het direct detecteren van interacties op korte afstand tussen eiwitten binnen <10 nm van elkaar25 in levende cellen. Er zijn twee belangrijke varianten van de FRET-benadering26: sensibiliseerde emissie (SE-FRET) (figuur 1A) en acceptorbleking (AB-FRET) (figuur 1B). In SE-FRET dragen de interagerende eiwitten - waarvan er één is gelabeld met een donorfluorchroom (bijv. Groen fluorescerend eiwit, GFP) en de andere met een acceptorfluorchroom (bijv. Monomeer rood fluorescerend eiwit, mRFP27,28) - niet-radiatief de geëxciteerde toestandsenergie van de donor naar de acceptor over. Omdat er tijdens deze overdracht geen fotonen worden uitgezonden, wordt een fluorescerend signaal geproduceerd dat een stralingsemissiespectrum heeft dat vergelijkbaar is met dat van de acceptor. In AB-FRET worden eiwitinteracties gedetecteerd en gekwantificeerd op basis van verhoogde stralingsemissie van de donor wanneer de acceptor permanent wordt geïnactiveerd door fotobleaching en dus niet in staat is om de niet-stralingsenergie te ontvangen die van de donor wordt overgedragen (figuur 1). Belangrijk is dat de subcellulaire locatie van de FRET-fluorescentie indicatief is voor de lokalisatie van de interagerende eiwitten in de cel.

Het vermogen om FRET in levende weefsels in te zetten en de subcellulaire lokalisatie van de interagerende eiwitten tegelijkertijd te bepalen met het detecteren van deze interactie op zich, maakt FRET de voorkeurstechniek voor studies en initiële karakterisering van eiwit-eiwitinteracties in vivo. Een vergelijkbare in vivo fluorescentiebeeldvormingsmethodologie, bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC)29,30,31,32, is een goede alternatieve benadering, hoewel BiFC, in tegenstelling tot FRET, valse positieven kan produceren als gevolg van spontane assemblage van de autofluorescente BiFC-verslaggevers33, en de kwantificering van de gegevens is minder nauwkeurig.

Dit artikel deelt de succesvolle ervaring met het implementeren van zowel SE-FRET- als AB-FRET-technieken en presenteert een protocol voor hun inzet om de interacties tussen OTLD1 en LSH10 in plantencellen te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens stam EHA105 of GV3101 werden gebruikt voor deze studie.

1. FRET vector constructie

  1. Selecteer fluorescerende tags voor het FRET-paar donor/acceptor.
    1. Gebruik EGFP van pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (zie Materiaaltabel) om de donorvector te genereren.
    2. Gebruik mRFP van pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (zie Materiaaltabel) om de acceptorvector te genereren.
  2. Genereer de donor/acceptor FRET-constructies met behulp van een locatiespecifieke recombinatiekloontechniek34, zoals het Gateway-recombinatieklonensysteem35.
    1. Versterk de coderende sequenties van de eiwitten van belang36 (d.w.z. de Arabidopsis OTLD1 en LSH10)15.
      OPMERKING: Het is ook een goed idee om een negatieve controle te gebruiken die een homoloog van een van de interagerende eiwitten vertegenwoordigt, maar naar verwachting geen interactie zal vertonen; de OTLD1-LSH10 interactiestudie maakt gebruik van een homoloog van LSH10, LSH4, die OTLD1 niet herkent. OTLD1, LSH10 en LSH4 cDNA's worden versterkt door PCR met behulp van primers vermeld in tabel 1.
    2. Kloon OTLD1, LSH10 en LSH4 in de ingangsvector pDONR207 met behulp van de site-specifieke recombinatie kloontechniek34.
    3. Gebruik de Gateway LR Clonase II (zie Tabel met materialen) om LSH10 en LSH4 van pDONR207 over te brengen naar de binaire doelvector pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 om de binaire donorconstructen p35S::LSH10-GFP (getest construct) en p35S::LSH4-GFP (negatieve controle) te genereren.
    4. Gebruik hetzelfde in de handel verkrijgbare enzym (stap 1.2.3) om OTLD1 van pDONR207 over te brengen naar de binaire doelvector pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 om de binaire acceptorconstructie p35S::OTLD1-mRFP (getest construct) te genereren.
    5. PCR-amplify36 mRFP van pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 met behulp van primers vermeld in tabel 1, kloon het door de recombinatie-kloontechniek in pDONR207 en gebruik vervolgens LR Clonase II om mRFP over te brengen naar pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 om het binaire fusieconstruct p35S::mRFP-GFP (positieve controle) te genereren.
  3. Voer transformatie van de donor- en acceptorconstructies uit in Agrobacterium.
    1. Voeg 1 μg van elk plasmide uit stap 1.2.3-1.2.5 toe aan 100 μL van de kweek van competente cellen van Agrobacterium tumefaciens stam EHA105 of GV3101, bereid met behulp van standaardprotocollen37 of commercieel verkregen, en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten.
    2. Voeg 1 ml LB-medium (1% trypton, 0,5% gistextract en 1% NaCl; zie materiaaltabel) toe aan het competente celmengsel en roer bij 200 tpm en 28 ° C gedurende 1,5 uur. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 3.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    3. Resuspendeer de cellen in 0,1 ml LB-medium door pipetteer en verspreid ze op LB-agar aangevuld met de juiste antibiotica (bijv. 0,01% spectinomycine en 0,005% rifampicine; zie Materiaaltabel). Groei bij 28 °C gedurende 2 dagen.
    4. Kies individuele kolonies en ent elk van hen afzonderlijk in 1 ml LB-bouillon aangevuld met de juiste antibiotica.
    5. Laat de cellen groeien bij 28 °C gedurende 24 uur en breng 0,2 ml van de cultuur over in een nieuwe buis. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 10.000 × g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
    6. Extraheer plasmide-DNA volgens een standaardprotocol voor het isoleren van plasmiden uit Agrobacterium-cellen38 en resuspendeer het geëxtraheerde DNA in 30 μL water. Om de kolonies te identificeren die de gewenste plasmiden herbergen, gebruikt u 2 μL van het DNA-preparaat als sjabloon voor PCR met genspecifieke primers vermeld in tabel 1. Meng 0,7 ml van de geïdentificeerde cultuur met 0,3 ml glycerol en bewaar bij -80 °C.

2. Agro-infiltratie

  1. Kweek Nicotiana benthamiana planten.
    OPMERKING: Gedurende het hele experiment moeten alle planten gezond zijn.
    1. Zaai en kweek N. benthamiana zaden in een pot met natte grond met een hoge dichtheid.
    2. Bewaar de geplante zaden in een groeikamer van 23 °C met 16 uur licht en 8 uur donkere cyclus met 150-170 μmol/m2s lichtintensiteit totdat de diameter van de eufyl 0,5 cm bereikt.
    3. Breng de zaailingen over naar grotere potten en laat ze in dezelfde kamer groeien met dezelfde parameters.
      OPMERKING: Planten zijn klaar voor agro-infiltratie wanneer hun grootste bladeren 5-7 cm in diameter zijn, meestal binnen 4-5 weken. Bij kleinere planten die te jong zijn, zullen de effecten van agro-infiltratie te ernstig zijn voor de FRET-analyse.
  2. Bereid bacteriële cellen voor op agro-infiltratie.
    1. Kweek elke Agrobacterium-kolonie die de FRET-constructen bevat 's nachts in 5 ml LB-medium aangevuld met de juiste antibiotica (stap 1.3.3) en 150 μM acetosyringon bij 28 °C (zie Materiaaltabel).
    2. Centrifugeer de cellen bij 3.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Resuspensie van de cellen in agro-infiltratiebuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acetosyringon) tot OD600 = 0,5.
    4. Combineer de geresuspendeerde cellen in een verhouding van 1:1 v/v tussen cellen met de juiste constructies (stap 2.2.5).
    5. Meng voor de agro-integraties met dubbele constructie de aliquots van twee culturen en meng voor agro-filtraties met één constructie de aliquots van dezelfde cultuur:
      1. Geteste eiwitten: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bacteriën die de p35S::OTLD1-mRFP en p35S::LSH10-GFP constructen herbergen).
      2. Negatieve controle: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bacteriën die de p35S::OTLD1-mRFP en p35S::LSH4-GFP constructen herbergen).
      3. Negatieve controle: LSH10-GFP + vrije mRFP (bacteriën die de p35S::LSH10-GFP en pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 constructen herbergen).
      4. Positieve controle: mRFP-GFP (bacteriën die het p35S::mRFP-GFP-GFP-construct herbergen).
    6. Incubeer de cellen bij 28 °C gedurende 0,5-1 uur.
  3. Voer agro-infiltratie uit.
    1. Laad de bacteriecultuur in een naaldloze spuit van 1 ml.
    2. Druk het mondstuk van de spuit zachtjes maar stevig tegen de abaxiale kant van de volledig geëxpandeerde N. benthamiana bladeren terwijl u het blad met een gehandschoende vinger aan de adaxiale kant vasthoudt.
    3. Infiltreer tot vier vlekken op een blad, drie bladeren per plant, twee of drie planten voor elke bacteriecultuur. Wissel handschoenen tussen monsters om kruisbesmetting te voorkomen.
    4. Houd de agro-geïnfiltreerde planten in dezelfde groeikamer onder dezelfde omstandigheden, zoals beschreven in stap 2.1.2, gedurende 24 uur tot 36 uur. Bewaar de agro-geïnfiltreerde planten niet langer dan 36 uur, omdat dit het fluorescentiesignaal zal verminderen.

3. Confocale microscopie

  1. Bereid microscoopglaasjes voor fluorescentievisualisatie voor.
    1. Gebruik na 24-36 uur van de infiltratie een scheermesje om elk agro-geïnfiltreerd blad in kleine stukjes (2 mm x 4 mm) tussen de aderen te snijden.
    2. Leg de bladstukken op een glazen glijbaan met het abaxiale bladoppervlak naar boven gericht. Leg een druppel water op de bladstukken en bedek ze met het afdekglas. Tik lichtjes op het afdekglas om luchtbellen te verwijderen.
    3. Zet de microscoop en laser aan (zie Materiaaltabel). Plaats de dia in de microscooptraphouder voor beeldvorming onder de specifieke FRET-parameters (stappen 3.2 en 3.3).
    4. Begin de waarnemingen met een 10x objectieflens om cellen te identificeren die zowel de GFP- als de mRFP-signalen vertonen en gebruik vervolgens een 40x-objectieflens voor daaropvolgende gedetailleerde waarnemingen.
      OPMERKING: Belangrijk is dat SE-FRET en AB-FRET meestal op hetzelfde weefselmonster worden uitgevoerd, waardoor dezelfde kanaalinstellingen (stap 3.2) kunnen worden gebruikt, behalve het FRET-kanaal, dat is in- en uitgeschakeld voor respectievelijk de SE-FRET- en AB-FRET-waarnemingen (stappen 3.2.2.3 en 3.3.1).
  2. Stel de parameters voor SE-FRET in (figuur 1A).
    1. Open het hulpprogramma Multi-Dimensional Acquisition (MDA).
    2. Stel een set van drie confocale kanalen in hetzelfde gezichtsveld vast (aanvullende figuur 1).
      1. Stel het donorkanaal (het GFP-kanaal) in voor excitatie en emissie van het donorfluorchroom met de 405 nm excitatielaser en het 400-597 nm emissiefilter.
      2. Stel het acceptorkanaal (het mRFP-kanaal) in voor excitatie en emissie van het acceptorfluorchroom met de 561 nm excitatielaser en het 400-597 nm emissiefilter.
        OPMERKING: Het emissiefilter voor mRFP is ingesteld op 400-597 nm om het mRFP-signaal te scheiden van het FRET-signaal bij 597-617 nm (stap 3.2.2.3) en zo de FRET-onafhankelijke mRFP-emissie te verminderen.
      3. Stel het FRET-kanaal in voor excitatie van de donor en emissie van de acceptorfluorchromen met de 405 nm excitatielaser en het 597-617 nm emissiefilter.
    3. Stel de intensiteit van de donorexcitatie in op een minimumniveau om FRET te observeren en tegelijkertijd fotobleaching te vermijden, waardoor de SE-FRET-efficiëntie wordt verminderd.
      OPMERKING: Deze excitatie-intensiteit wordt experimenteel geselecteerd voordat de FRET-procedure wordt uitgevoerd om fotobleaching te voorkomen. Het varieert afhankelijk van bladdikte, leeftijd en tijd na overexpressie.
    4. Prikkel de donor en scan naar cellen die het verwachte fluorescentiesignaal van de acceptor bevatten.
    5. Selecteer het gebied dat het fluorescentiesignaal van belang bevat.
    6. Verkrijg een SE-FRET-beeldreeks door op de Snap-knop te drukken.
      1. Afbeelding 10-15 cellen die eerst het mRFP-GFP-construct (positieve controle) tot expressie brengen; pas de parameters voor focus, zoom en slimme versterking aan om scherp te stellen op het interessegebied dat moet worden vastgelegd (aanvullende figuur 2).
      2. Met dezelfde instellingen kunt u 10-15 cellen weergeven, die elk AFZONDERLIJK OTLD1-mRFP, vrije mRFP, LSH10-GFP of LSH4-GFP tot expressie brengen.
        OPMERKING: Deze beelden worden verkregen door de "PixFRET" plug-in van ImageJ (zie Materiaaltabel), die werd gebruikt voor de FRET-gegevensanalyses (stap 3.4.1) om de spectrale doorbloedingswaarden (SBT) voor de acceptanten en de donoren te bepalen; deze beelden worden door de software gebruikt om de SE-FRET-beelden te genereren voor de OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP en LSH10-GFP + vrije mRFP-eiwitparen (stap 3.2.6.3).
      3. Met dezelfde instellingen kunt u ook 10-15 cellen weergeven die OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP en LSH10-GFP + vrije mRFP-eiwitparen co-expressie geven.
  3. Stel parameters in voor AB-FRET (figuur 1B).
    1. Gebruik de donor- en acceptorkanaalparameters die zijn ingesteld voor SE-FRET (stap 3.2.2), maar schakel het FRET-kanaal uit.
    2. Stel de parameters in voor fotobleaching van de acceptor (mRFP) (aanvullende figuur 3).
      1. Zorg ervoor dat het bleken begint na vijf afbeeldingen. Sta 200 iteraties toe voor elk bleekmiddel. Houd 100% laserintensiteit op 561 nm.
      2. Houd een bleekduur van 45 s aan. Zorg voor een scansnelheid van 512 x 512 pixels bij 400 Hz.
    3. Teken het gebied van de cel dat moet worden gebleekt; voor nucleaire interacties worden bijvoorbeeld interessegebieden getekend rond het hele gebied van de celkern39.
    4. Activeer bleken door op de knop Start experiment te drukken; het activeren van deze functie zal de fotobleaching uitvoeren en de AB-FRET-beeldreeks verkrijgen.
  4. Analyseer de FRET-gegevens.
    1. Gebruik voor het analyseren van SE-FRET-gegevens de plug-in "PixFRET" voor de ImageJ-software om gecorrigeerde afbeeldingen van de SE-FRET-efficiëntie te genereren na aftrek van SBT40 (stap 3.2.6.2).
    2. Bereken voor het analyseren van de AB-FRET-gegevens %AB-FRET als de procentuele toename van de GFP-emissie na mRFP-fotobleaching met behulp van de volgende formule41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, waarbij GFPpost GFP-emissie is na mRFP-fotobleaching en GFPpre GFP-emissie vóór mRFP-fotobleaching.
    3. Let bij het bekijken van de FRET-beelden op de subcellulaire lokalisatie van het FRET-signaal.
      OPMERKING: In veel gevallen kunnen deze cellulaire compartimenten (bijv. Kern, chloroplasten, ER, enz.) gemakkelijk worden geïdentificeerd en, als bijkomend voordeel van de FRET-techniek, belangrijke aanwijzingen geven voor de biologische functie van de interagerende eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 2 illustreert de typische resultaten van een SE-FRET-experiment, waarbij de celkernen tegelijkertijd werden geregistreerd in drie kanalen (d.w.z. donor-GFP, acceptor mRFP en SE-FRET). Deze gegevens werden gebruikt om afbeeldingen van SE-FRET-efficiëntie te genereren die gecodeerd zijn in een pseudo-kleurenschaal. Op deze schaal komt de overgang van blauw naar rood overeen met een toename van de FRET-efficiëntie, een maat voor de nabijheid van eiwitten en eiwitten van 0% tot 100%. In dit representatieve experiment werd het SE-FRET-signaal geregistreerd in de celkern en de intensiteit ervan na de co-expressie van LSH10 en OTLD1 was vergelijkbaar met die waargenomen na de expressie van de mRFP-GFP (d.w.z. positieve controle). Er werd geen SE-FRET waargenomen bij negatieve controles (d.w.z. coexpressie van OTLD1-mRFP en LSH4-GFP of vrije mRFP en LSH10-GFP).

De LSH10-OTLD1 interacties werden gekwantificeerd met behulp van AB-FRET. Hiertoe werd de donor-GFP-fluorescentie voor en na de fotobleaching van de acceptor mRFP in de celkern geregistreerd als fotobleachingtijdreeks van donor- en acceptorfluorescentiemetingen (aanvullende figuur 4). De beelden van de opgenomen celkernen werden gepresenteerd in pseudo-kleur om de verandering in GFP-fluorescentie te kwantificeren. Figuur 3 laat zien dat de LSH10-GFP/OTLD1-mRFP coexpressie resulteerde in een verhoogde GFP-donorfluorescentie nadat de mRFP-acceptor was gefotobleacheerd en zijn vermogen tot fluoresceren verloor. Een vergelijkbare toename van de donorfluorescentie werd waargenomen in de mRFP-GFP positieve controle, maar niet in de negatieve controles van LSH4-GFP/OTLD1-mRFP of LSH10-GFP/mRFP coexpressie, terwijl de acceptorfluorescentie werd geïnactiveerd in alle fotobleaching-experimenten. Figuur 4 toont de kwantitatieve analyse van de AB-FRET-gegevens, die de statistisch significante toename van de donorfluorescentie (%AB-FRET) van ongeveer 13% na co-expressie van LSH10 en OTLD1 aantonen. De positieve mRFP-GFP-controle leverde %AB-FRET van ongeveer 30% op, terwijl de negatieve controles geen %AB-FRET opleverden. Zowel SE-FRET- als AB-FRET-beelden toonden het FRET-signaal in de celkern, consistent met de subcellulaire lokalisatie die wordt verwacht voor de transcriptiefactor-histonmodificerende enzymcomplexen en voor de nucleocytoplasmatische aard van de GFP / mRFP-eiwitten34 (figuur 2 en figuur 3).

Samenvattend tonen de representatieve gegevens aan dat dit FRET-protocol kan worden gebruikt om interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren aan te tonen en te kwantificeren en hun subcellulaire lokalisatie in levende plantencellen te bepalen.

Figure 1
Figuur 1: Schematische samenvatting van de SE-FRET- en AB-FRET-technieken. (A) Het basisprincipe van SE-FRET. Een van de geteste eiwitten is gelabeld met GFP, dat fungeert als een donorfluorchroom, en de andere met mRFP, dat fungeert als een acceptorfluorchroom. Het donormolecuul wordt geëxciteerd en de acceptoremissie wordt geregistreerd. Als de geteste eiwitten zodanig met elkaar interageren dat ze binnen 10 nm van elkaar worden geplaatst, wordt de energie van de geëxciteerde donor niet-radiatief overgedragen aan de acceptor, die vervolgens geëxciteerd raakt en fluorescentie uitzendt in het FRET-emissiekanaal. Als er geen interactie optreedt, wordt er geen energie overgedragen van de donor naar de acceptor en wordt er geen FRET-emissie door de acceptor gedetecteerd. (B) Het basisprincipe van AB-FRET. De geteste eiwitten zijn gelabeld zoals beschreven in (A) voor SE-FRET. Het donormolecuul is geëxciteerd en als de interactie tussen de geteste eiwitten optreedt, prikkelt de donor de acceptor op een niet-radiatieve manier, wat resulteert in FRET. Vervolgens wordt de acceptor permanent geïnactiveerd door fotobleaching, waardoor hij zijn vermogen verliest om niet-stralingsenergie van de donor te accepteren en de FRET-fluorescentie in het FRET-emissiekanaal uit te zenden; de fluorescentie die door de donor wordt uitgestoten, wordt daarentegen verhoogd omdat de donor minder energie verliest door de niet-stralingsoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Specifieke interactie van LSH10 met OTLD1 in N. benthamiana bladeren gedetecteerd door SE-FRET. Beelden van drie detectiekanalen (donor, acceptor en SE-FRET) worden getoond voor de aangegeven eiwitcombinaties. De SE-FRET-efficiëntiebeelden werden berekend door het aftrekken van spectrale bleed-through (SBT) en worden weergegeven in pseudo-kleur, waarbij de kleuren rood en blauw respectievelijk het hoogste en het laagste signaal betekenen. (A) Signaal met een hoog SE-FRET-rendement dat wordt geproduceerd door de mRFP-GFP-positieve regeling. (B) Positief SE-FRET-efficiëntiesignaal geproduceerd door de interagerende LSH10-GFP- en OTLD1-mRFP-eiwitten. (C) Coexpressie van het negatieve controle-eiwit LSH4-GFP en OTLD1-mRFP leverde geen SE-FRET-efficiëntiesignaal op. (D) Coexpressie van het negatieve controlevrije mRFP-eiwit en LSH10-GFP leverde geen SE-FRET-efficiëntiesignaal op. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Specifieke interactie van LSH10 met OTLD1 in N. benthamiana bladeren gedetecteerd door AB-FRET. Beelden van twee detectiekanalen (donor en acceptor) voor en na fotobleaching worden getoond voor de aangegeven eiwitcombinaties. De cirkel geeft het fotobleached gebied aan. AB-FRET, gevisualiseerd als een toename van GFP-fluorescentie na mRFP-fotobleaching, wordt weergegeven met behulp van pseudo-kleuren met de kleuren rood en blauw, wat respectievelijk het hoogste en laagste signaal betekent. (A) Een toename van de GFP-donorfluorescentie veroorzaakt door de mRFP-GFP positieve controle. (B) Een toename van de GFP-donorfluorescentie geproduceerd door de interagerende LSH10-GFP- en OTLD1-mRFP-eiwitten. (C) Coexpressie van het negatieve controle-eiwit LSH4-GFP en OTLD1-mRFP veroorzaakte verwaarloosbare veranderingen in de GFP-donorfluorescentie. (D) Coexpressie van het negatieve controlevrije mRFP-eiwit en LSH10-GFP veroorzaakte verwaarloosbare veranderingen in de GFP-donorfluorescentie. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Een kwantificering van AB-FRET. De procentuele toename van de GFP-donorfluorescentie na mRFP-fotobleaching (%AB-FRET) wordt weergegeven voor de geïndiceerde eiwitcombinaties. Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde voor n = 13 cellen voor elke meting. De tweezijdige t-test heeft vastgesteld dat verschillen tussen gemiddelde waarden statistisch significant zijn voor de p-waarden *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001; p≥ 0,05 zijn niet statistisch significant (ns). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam primer Volgorde (5ʹ tot 3ʹ) Doel
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag Otld1 versterken vanaf cDNA
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggttccgtggctttgcctttgcgtc Otld1 versterken vanaf cDNA
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgtcctctccaagagaaagagg LSH10 versterken vanaf cDNA
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgtcaacagagactaaagaaac LSH10 versterken vanaf cDNA
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg LSH4 versterken vanaf cDNA
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc LSH4 versterken vanaf cDNA
MRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt Versterk mRFP van pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
MRFP Rv | ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttggagatctgcggccccgg Versterk mRFP van pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc Bevestig sequenties in pDONR207 door PCR en DNA-sequencing
AttL2 gtaacatcagagattttgagacac Bevestig sequenties in pDONR207 door PCR en DNA-sequencing
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct Bevestig sequenties in bestemmingsvectoren door PCR- en DNA-sequencing
T.a.v. B2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt Bevestig sequenties in bestemmingsvectoren door PCR- en DNA-sequencing
35S Promotor Fw ctatccttcgcaagacccttc Sequenties in doelvectoren bevestigen met PCR

Tabel 1: Primers voor het klonen en bevestigen van de gekloonde sequenties in pDONOR207 en doelvectoren. Fw, voorwaartse primers; Rv, omgekeerde primers.

Aanvullende figuur 1: Parameters instellen voor confocale kanalen. (A) Screenshot voor de excitatie- en emissieparameterinstellingen voor het donorkanaal (GFP). (B) Screenshot voor de excitatie- en emissieparameterinstellingen voor het acceptorkanaal (mRFP). (C) Screenshot voor de excitatie- en emissieparameterinstellingen voor het FRET-kanaal. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Aanpassing van parameters voor de verwerving van SE-FRET-afbeeldingen van de steekproef van belang. (A) Schermafbeelding voor het instellen van de scangebiedparameter (d.w.z. afbeeldingsgrootte, scansnelheid, richting en gemiddelden). (B) Schermafbeelding voor het instellen van de GFP-kanaalparameter (d.w.z. laser, pinhole, master gain en digitale versterking). (C) Schermafbeelding voor het instellen van de mRFP-kanaalparameter (d.w.z. laser, pinhole, master gain en digitale versterking). (D) Screenshot voor het instellen van de FRET-kanaalparameter (d.w.z. laser, pinhole, master gain en digitale versterking). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Parameters instellen voor de acceptorfotobleaching. (A) Schermafbeelding voor het instellen van de scangebiedparameter (d.w.z. afbeeldingsgrootte, scansnelheid, richting en gemiddelden). (B) Screenshot voor de tijdreeks en tijdblekingsparameter instellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Tijdreeksen van de donor- en acceptorfluorescentiemetingen tijdens AP-FRET. De kinetiek van de fluorescentie van de acceptor (mRFP) en donor (GFP) werd bepaald voor de geïndiceerde monsters vóór, tijdens en na de fotobleachingsperiode. (A) Positieve mRFP-GFP controle. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) Negatieve LSH4-GFP + OTLD1-mRFP controle. (D) Negatieve LSH10-GFP + Vrije mRFP-controle. Gele lijnen geven de fotobleachingsperiode aan. Witte curven plotten de metingen van de fluorescentiekkinetiek. In elk paneel tonen de bovenste en de onderste beelden de kinetiek van respectievelijk de acceptor (mRFP) en donor (GFP) fluorescentie. Merk op dat de GFP-fluorescentie natuurlijk vaak in de loop van de tijd afneemt omdat de laser de GFP zelf geleidelijk fotobleceert. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit FRET-protocol is eenvoudig en gemakkelijk te reproduceren; het vereist ook minimale leveringsinvesteringen en maakt gebruik van standaarduitrusting voor veel moderne laboratoria. In het bijzonder onderscheiden vijf belangrijke technische kenmerken de veelzijdigheid van deze procedure. Ten eerste worden de FRET-constructies gegenereerd met behulp van locatiespecifieke recombinatie, een kloonbenadering die gemakkelijk te gebruiken is, nauwkeurige resultaten oplevert en tijd bespaart in vergelijking met traditioneel klonen op basis van restrictie-enzymen. Ten tweede zijn N. benthamiana-planten eenvoudig te kweken, produceren ze relatief grote hoeveelheden weefsel en zijn ze beschikbaar in de meeste laboratoria. Ten derde resulteert agro-infiltratie in voorbijgaande expressie van de geleverde constructen en genereert dus gegevens binnen een relatief korte periode (d.w.z. 24-36 uur) in vergelijking met de maanden die nodig zijn om transgene planten te produceren. Ten vierde maakt het vermogen om verschillende combinaties van de constructen van belang te leveren door co-agro-infiltratie het testen van interacties tussen eiwitten mogelijk. Ten slotte kunnen zowel SE-FRET als AB-FRET sequentieel worden uitgevoerd op hetzelfde weefselmonster door een van de laserkanaalinstellingen in of uit te schakelen. Er moet echter worden opgemerkt dat microbombardmentafgifte42 kan worden gebruikt als een alternatieve benadering voor constructafgifte in de plantenweefsels in plaats van agro-infiltratie; in dit geval is het gebruik van binaire vectoren die nodig zijn voor agro-infiltratie niet nodig.

Een cruciale stap van dit protocol is het correct selecteren van het donor- en acceptorfluorochroompaar om de FRET-efficiëntie te optimaliseren. De volgende drie factoren moeten worden overwogen: (1) het donoremissiespectrum moet het acceptorabsorptiespectrum maximaal overlappen om de hoeveelheid overgedragen energie te maximaliseren; (2) de emissiespectra van de donor en de acceptant moeten voldoende verschillend zijn om van elkaar te worden onderscheiden en om de SBT van het door microscopie gedetecteerde signaal tot een minimum te beperken; (3) de acceptor moet een minimale directe excitatie hebben bij het absorptiemaximum van de donor om de excitatie van de acceptor tijdens de excitatie van de donor tot een minimum te beperken. Veel gebruikte donor/acceptor FRET-paren zijn cyaan/gele en groen/rode fluorescerende eiwitten (d.w.z. respectievelijk CFP/YFP en GFP/mRFP). Dit protocol maakt gebruik van het GFP / mRFP-paar omdat het geschikt is voor live cell imaging en, in tegenstelling tot de cyaan / gele FRET-paren, een lage fototoxiciteit en lage fotobleaching vertoont43. Handig is dat de translationele fusie tussen het FRET-paar (d.w.z. mRFP-GFP) dient als een ideale FRET-positieve controle.

Een andere cruciale stap is de selectie van de juiste negatieve controles. In het geval van de LSH10-OTLD1-interactie moet de FRET-analyse bijvoorbeeld altijd de expressie van OTLD1 alleen, LSH10 alleen, en co-expressie van OTLD1 en LSH10 met eiwitten waarvoor de interactie niet wordt verwacht omvatten (d.w.z. respectievelijk LSH4 en vrije mRFP). Wat de keuze van de negatieve controles betreft, kunnen FRET-experimenten de richtlijnen volgen over best practices voor het gebruik van de BiFC-techniek44, een andere op fluorescentiebeeldvorming gebaseerde benadering die is aangepast voor de detectie van eiwitinteracties in levende plantencellen 29,30,31,32.

Ten slotte is een factor die van invloed is op de FRET-experimenten gemeenschappelijk voor alle experimenten in levende plantenweefsels, en het komt voort uit de verschillende fysiologische omstandigheden van de plant in het algemeen en de agro-geïnfiltreerde getransformeerde cellen, in het bijzonder, zelfs wanneer ze onder controle van groeiomstandigheden worden gehouden. Deze fysiologische variabiliteit kan bijdragen aan een bepaalde variabiliteit van de FRET-gegevens tussen individuele experimenten, planten en zelfs bladeren. Het is dus belangrijk om voor elk experiment ten minste twee planten en drie bladeren per plant te gebruiken en volwassen, volledig geëxpandeerde bladeren te selecteren voor agro-infiltratie, omdat ze betere beelden opleveren.

Zoals met alle experimentele methodologieën, heeft FRET zijn technische en op gebruik gebaseerde beperkingen. Een dergelijke beperkende factor is de aard van de autofluorescente tag en de locatie ervan binnen het eiwit van belang (bijvoorbeeld bij de amino- of carboxyl-terminus), die de biologische eigenschappen van dit eiwit kan verstoren, zoals het inheemse patroon van subcellulaire lokalisatie of het vermogen om de natuurlijke interactoren te herkennen. Alvorens te taggen, moet elk eiwit van belang worden geanalyseerd, voor zover mogelijk, voor zijn structurele kenmerken die kunnen worden aangetast door tagging. In veel gevallen moeten de taggingparameters echter empirisch worden bepaald op basis van de bekende activiteiten van het eiwit van belang. Een andere belangrijke beperking is de relatieve technische verfijning van FRET, die het gebruik van confocale microscopie met de juiste hardware en software vereist. In tegenstelling tot verschillende andere eiwitinteractiemethoden, zoals het gist twee-hybride systeem (Y2H)45,46,47, is FRET ongeschikt voor het identificeren van eiwitinteracties door expressiebibliotheken te screenen, met name schermen met hoge doorvoer48. Bovendien, zoals de meeste testen die in vivo worden uitgevoerd, is FRET geen biochemisch zuiver systeem en detecteert het dus niet de potentiële betrokkenheid van andere onbekende cellulaire factoren bij de interactie.

De betekenis van FRET met betrekking tot andere testen van eiwitinteracties ligt in de detectie van interacties op korte afstand, het verminderen van de kans op vals-positieve resultaten, toepasbaarheid voor inzet in vivo in een verscheidenheid aan cellen, weefsels en organismen (inclusief planten) en detectie van de subcellulaire lokalisatie van de interagerende eiwitten. Veel van deze kenmerken van FRET worden gevonden in andere in vivo benaderingen, zoals split-luciferase49,50 of BiFC 29,30,31,32,33, waarvan BiFC misschien wel de meest gebruikte is. Een andere veelgebruikte interactietest is Y2H 45,46,47; buiten het onderzoek naar gistbiologie maakt deze test echter gebruik van een heterologe experimentele systeem, vatbaar voor valse positieven, en de bevindingen ervan vereisen bevestiging door een andere techniek. Een conceptuele variatie van Y2H is een split-ubiquitine-test die beter geschikt is voor het detecteren van interacties tussen membraaneiwitten 51,52 en die beperkingen vertoont ten opzichte van FRET die vergelijkbaar is met Y2H. Ten slotte kunnen eiwitinteracties worden gedetecteerd door co-immunoprecipitatie (co-IP), wat van toepassing is op detectie in een complexe omgeving van celextracten en in nauwkeurig gedefinieerde in vitro reacties 53,54,55; in onze ervaring is co-IP het meest nuttig als een alternatieve en onafhankelijke methode om gegevens te bevestigen die zijn verkregen met behulp van de op fluorescentie gebaseerde in vivo benaderingen.

Terwijl dit specifieke FRET-protocol werd ontwikkeld om de interacties tussen transcriptiefactoren van planten en histonmodificerende enzymen te bestuderen, kan het worden gebruikt om interacties tussen vele andere klassen van eiwitten inplanta te ontdekken en te karakteriseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er werden geen belangenconflicten gemeld.

Acknowledgments

Het werk in het laboratorium van V.C. wordt ondersteund door subsidies van NIH (R35GM144059 en R01GM50224), NSF (MCB1913165 en IOS1758046) en BARD (IS-5276-20) tot V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

Biologie Histone modifying enzymes (HME's) transcriptiefactoren (TF's) eiwit-eiwit interacties FRET
Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren <em>in vivo</em> door fluorescentieresonantie-energieoverdracht
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter