Utilisation de plusieurs diffusions de la lumière pour examiner la stabilité des extraits de Phyllanthus emblica L. obtenus avec différentes méthodes d’extraction

Summary

Ici, nous introduisons une méthode d’évaluation de la stabilité basée sur une technologie de diffusion de la lumière multiple pour évaluer la stabilité des extraits de médecine traditionnelle chinoise.

Abstract

L’intermédiaire d’extraction de la médecine traditionnelle chinoise est l’intermédiaire clé dans le processus de préparation, et sa stabilité a un impact important sur l’efficacité et la qualité du produit final. Cependant, les méthodes existantes d’évaluation de la stabilité sont souvent longues et laborieuses, nécessitant une observation à long terme et le fonctionnement d’équipements complexes (tels que la chromatographie liquide à haute performance), et il est difficile d’obtenir plus d’informations physiques sur l’instabilité du système. Par conséquent, il est urgent d’établir une technologie d’analyse de stabilité rapide et précise pour la médecine traditionnelle chinoise. La diffusion multiple de la lumière est une méthode analytique de pointe qui permet d’évaluer avec précision et rapidité la stabilité des médecines traditionnelles chinoises de manière respectueuse de l’environnement sans modifier la nature ou l’état de l’échantillon ou utiliser des réactifs organiques.

Dans ce travail, en utilisant les données de balayage précises de la diffusion de la lumière multiple, le présent protocole a rapidement acquis les courbes de variation pour l’épaisseur de la couche, la vitesse de migration des particules et la taille moyenne des particules au fil du temps. Cela a permis d’identifier avec précision le mécanisme et les caractéristiques cruciales à l’origine de l’instabilité du système à ses débuts. Il convient de noter que la période de recherche pour le processus d’extraction peut être considérablement raccourcie par la quantification détaillée de la stabilité du système, ce qui permet également une analyse rapide, précise et approfondie des effets de divers procédés d’extraction sur la stabilité de Phyllanthus emblica L.

Introduction

Dans la fabrication de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), la stabilité des intermédiaires d’extraction de la MTC et des préparations liquides connexes a toujours été au centre de l’inspection¹. L’efficacité clinique des médicaments, en particulier avec les polyphénols comme principal principe actif, souffre en raison de problèmes de stabilité importants ^2,3. Sanajon oral liquid et Nuodikang oral liquid sont des exemples de cas typiques de ce numéro⁴. Par conséquent, il est crucial d’apprendre à utiliser des outils efficaces pour évaluer et optimiser rapidement et avec précision la stabilité des intermédiaires liquides dans le processus de production de MTC. Phyllanthus emblica L. (PE), une plante médicinale répandue en Asie du Sud-Est, aurait de bonnes propriétés antioxydantes⁵, ainsi que des actions anti-inflammatoires⁶, antibactériennes⁷ et antitumorales⁸. Au cours de la procédure d’extraction thermique, les tanins en PE se transforment violemment⁹. Sous catalyse à haute température, ces tanins s’hydrolysent rapidement pour produire des molécules telles que l’acide gallique et l’acide ellagique, qui entraînent une instabilité ou une précipitation en raison de leur faible solubilité¹. Les méthodes actuelles d’évaluation de la stabilité de la MTC, telles que les essais accélérés ou la centrifugation, sont généralement lourdes⁴, ce qui limite le développement ultérieur de procédés de préparation pertinents.

Sur la base du principe de diffusion de la lumière multiple (MLS), nous avons établi une méthode d’évaluation rapide de la stabilité des extraits de PEF et analysé le mécanisme d’instabilité. MLS est une méthode de mesure basée sur le balayage de sources lumineuses proche infrarouge. Tout changement de système de solution entraîne une modification de l’intensité lumineuse. La lumière incidente est diffusée lorsqu’elle est absorbée ou pénétrée par les particules de l’échantillon. Le système enregistre le signal lumineux de transmission lorsqu’il traverse l’échantillon; Si la transmission de la lumière de l’échantillon est faible, le système enregistre le signal lumineux de rétrodiffusion. Par rapport à l’observation visuelle, cela permet de gagner beaucoup de temps¹ et d’analyser rapidement et précisément le phénomène d’instabilité en détail, fournissant ainsi des informations plus utiles pour guider l’optimisation du processus d’extraction.

Protocol

1. Préparation de l’extrait

1. Pesez avec précision une quantité appropriée de PE et ajoutez 10x (poids) d’eau désionisée pour l’extraction par reflux.
2. Prélever cinq échantillons pour l’extraction par reflux pendant 0 h (E1), 0,5 h (E2), 1 h (E3), 1,5 h (E4) et 2 h (E5) après pesée.
3. Après l’extraction, refroidir les échantillons à température ambiante et peser pour compenser le poids perdu afin d’assurer la cohérence avec les poids antérieurs à l’extraction.
4. Centrifuger les échantillons à 8 581 × g pendant 10 min pour assurer l’élimination des matières insolubles et des résidus végétaux de la solution échantillon.
5. Utilisez une pipette pour ajouter 20 ml de solution échantillon dans le flacon d’échantillon afin de vous assurer que la solution ajoutée à chaque fois est à la même hauteur.
   REMARQUE: Évitez la contamination, telle que les empreintes digitales, sur la partie scannée du flacon d’échantillon, assurez-vous que le flacon d’échantillon est propre et vérifiez s’il y a des rayures visibles sur la surface du flacon. Lors de l’ajout de la solution d’échantillon, veillez à ne pas renverser ou éclabousser le flacon d’échantillon et assurez-vous que le niveau de liquide est à la même hauteur dans chaque flacon.

2. Fonctionnement de l’instrument

1. Allumez l’instrument de détection MLS et réchauffez-le pendant 30 minutes.
2. Cliquez sur le bouton Créer un fichier dans le menu supérieur (ou cliquez sur Fichier | Nouvelle fonction de fichier) pour créer un nouveau fichier de test.
3. Cliquez sur le bouton Show Turbiscan Lab Temperature (Afficher la température du laboratoire turbiscan ) dans le menu supérieur pour régler la température cible de l’instrument à 25 °C.
   NOTE: La température de consigne de l’instrument doit être supérieure à la température ambiante; Sinon, la température de l’échantillon sera affectée par la température ambiante.
4. Cliquez sur Analyse du programme dans le menu supérieur pour accéder au programme d’analyse de la configuration. Ajoutez le programme à la liste et, dans la barre des tâches, ajoutez 5 min en tant que cycle, scannez pendant 48 h à la séquence d’analyse et réglez le temps d’équilibre sur 20 min. Sélectionnez ce programme d’analyse pour toutes les mesures suivantes.
5. Déplacez le flacon d’échantillon préparé dans le système de détection MLS. Après avoir configuré le programme, cliquez sur Démarrer pour démarrer la mesure.
   REMARQUE: Veillez à ne pas secouer la bouteille en verre lors du chargement de l’échantillon. La mesure ne peut être démarrée qu’après que la température de l’échantillon et la température de réglage soient équilibrées.

3. Réglage du programme d’analyse de diffusion de la lumière multiple

1. Après la collecte des données, cliquez sur la liste des paramètres de calcul pour définir les paramètres optiques permettant de calculer l’indice de stabilité (SI), la taille des particules et la vitesse de migration des particules.
2. Réglez les paramètres optiques comme suit : l’intensité de transmission de la lumière en phase continue (T₀) à 99,99 % (eau), l’indice de réfraction en phase dispersée (np) à 1,36 et l’indice de réfraction en phase continue (nf) à 1,33.

Representative Results

La figure 1 montre le principe de la mesure de la lumière multiple et la signification des résultats recueillis. Dans les résultats des spectres MLS (figure 2), l’abscisse était la hauteur de la cellule échantillon, et l’ordonnée était l’intensité de transmission (T%) et de rétrodiffusion (BS). En calculant les résultats des spectres MLS, le système peut obtenir les changements dans les paramètres physiques clés de l’échantillon pendant la période de mesure, y compris la valeur moyenne de transmission delta (ΔT) (Figure 3A), le chemin libre de photons (Figure 3B), le SI (Figure 3C) et la taille des particules (Figure 3D). Avec l’extension du temps de mesure, les spectres MLS des extraits stables fluctuent peu ou pas du tout, et leurs paramètres physiques, y compris le ΔT, le chemin libre de photons et la taille des particules, ont tendance à être stables.

Les résultats typiques de l’instabilité de l’échantillon sont présentés à la figure 2A,C-E. Les résultats spectraux des échantillons stables avaient tendance à être constants à tous les moments de balayage, comme le montre la figure 2B, qui est une caractéristique typique des échantillons stables. Pour quantifier davantage les paramètres de stabilité, le SI peut être utilisé pour l’évaluation. Le protocole actuel permet l’identification rapide de la stabilité sous différentes méthodes d’extraction basées sur le SI (Figure 3C) et l’analyse du mécanisme d’instabilité. Il convient de noter que des valeurs SI plus faibles sont associées à une meilleure stabilité. L’échantillon est considéré comme stable si le SI est de <10 au cours de la période de balayage. En comparant les valeurs SI, les stabilités des cinq échantillons ont pu être distinguées avec précision et les spectres caractéristiques de stabilité pertinents ont pu être obtenus (Figure 4). Le taux de migration des particules (tableau 1) combiné au paramètre ci-dessus peut également donner un aperçu du mécanisme d’instabilité de l’échantillon.

Figure 1 : Principe d’analyse du MLS. Le MLS utilise la lumière proche infrarouge pulsée comme source de lumière (longueur d’onde: 880 nm), et deux détecteurs optiques synchrones détectent la lumière de transmission (T, 0° du rayonnement incident, capteur de transmission) et la lumière de rétrodiffusion (BS, 135° du rayonnement incident, détecteur de rétrodiffusion) traversant l’échantillon, respectivement. La source lumineuse, le détecteur de lumière à transmission et le détecteur de lumière rétrodiffusée constituent la sonde de mesure. La mesure du bas vers le haut de la cellule d’échantillon comprend un balayage. Toute instabilité dans l’échantillon aura un léger impact sur l’intensité des signaux T et BS. Cet impact est enregistré et analysé pour caractériser divers phénomènes instables, notamment la floculation, la stratification et la sédimentation⁴. Grâce au calcul de résultats d’analyse multiples, le mécanisme et la vitesse de l’instabilité du système de solution au stade initial de l’instabilité peuvent être analysés avec précision, et la courbe de relation de l’épaisseur de la couche (couche de sédiments, couche flottante et couche de clarification) avec le temps, ainsi que la courbe de relation de la vitesse de migration des particules et de la taille des particules avec le temps, peuvent être obtenus. Abréviation : MLS = diffusion de lumière multiple. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Spectres MLS (transmission et rétrodiffusion) de l’extrait de PE avec différentes méthodes d’extraction. (A-E) Spectres MLS de E1-E5. À partir des données spectrales, on peut déduire grossièrement que (B) l’échantillon E2 fluctuait moins, ce qui indique que l’échantillon était plus stable, tandis que (A) E1 pouvait avoir eu de la turbidité en raison de la baisse globale de la lumière de transmission. (C-E) Les échantillons E3-E5 étaient assez instables et les données spectrales des échantillons à différentes hauteurs étaient différentes, ce qui indique que la stratification s’est produite dans la période ultérieure. Abréviations : MLS = diffusion multiple de la lumière, PE = Phyllanthus emblica L., EN = extrait obtenu par la méthode N. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats de l’analyse des spectres MLS. (A) Avec le temps, la valeur T devient plus élevée et l’échantillon est plus instable. Pour E3 et E4, le niveau de ΔT est revenu à celui du stade antérieur à la fin, ce qui indique que l’agrégation et la précipitation se sont produites dans ces extraits. Le ΔT de E5 est resté à un faible niveau après la turbidité, ce qui indique que E5 a pu avoir une grande quantité de sédimentation. (B) La tendance du trajet libre de photons peut refléter les changements dans la lumière transmise de l’échantillon. (C) La stabilité des différents extraits a fluctué continuellement dans le temps, E2 > E1 > E5 > E3 > E4 étant l’ordre de stabilité au cours de la période de stockage. (D) Les changements dynamiques de la taille des particules peuvent révéler l’agrégation des particules dans l’échantillon. Les résultats montrent que la taille des particules de tous les échantillons a considérablement changé en 8 à 20 heures, la taille des particules E3 et E5 dépassant même la plage de mesure. Ainsi, cette étape est cruciale pour la formation d’agrégats instables de molécules ou de particules dans l’échantillon. De même, dans la phase finale, alors que les particules commençaient à nucléer et à continuer à s’agréger, une réduction de la taille des particules a finalement été observée après que suffisamment de particules aient formé de grands agglomérats et précipité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Instabilité des extraits de PE obtenus par différentes méthodes d’extraction. Le résultat prend du temps car l’abscisse et la couleur représentent l’intensité de la lumière transmise ou de la lumière rétrodiffusée. Le résultat peut refléter directement la situation réelle de turbidité et de stratification des échantillons à différents points temporels et hauteurs. La bande chromatique en haut de chaque résultat représente les valeurs d’intensité lumineuse correspondant à différentes couleurs, où la partie bleue représente T%, et la partie brune représente BS%. (A) Le pourcentage T de E1 a commencé à diminuer après 16 heures, ce qui indique que l’échantillon était trouble et que l’ensemble du processus ne s’est pas délaminé ni précipité. (B) Le pourcentage T de E2 était constant tout au long de la période de mesure, ce qui indique que l’échantillon était stable. (C) E3 était trouble à 16 h, et son BS% a soudainement augmenté à 20 h, ce qui indique que les particules de l’échantillon se sont rassemblées, stratifiées et précipitées à ce moment-là. (D) Le résultat ici est similaire à celui de l’alinéa C). E) E5 a subi une délamination sévère après 20 heures, qui a duré jusqu’à la fin de la mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Mesure	Zone de calcul	Taux de migration (mm/h)
E1	0-24 h	1.56
E2	0-24 h	0.005
E3	0-24 h	1.476
E4	0-19 h	2.732
E5	0-24 h	1.377

Tableau 1 : Résultats du taux de migration des particules. Dans les résultats, le taux de migration des particules peut être considéré comme le taux de précipitation des particules, qui peut refléter la stabilité de l’échantillon dans une certaine mesure. Des taux de migration plus élevés indiquent une plus faible stabilité. Il ressort des résultats que le taux de migration a été classé E4 > E1 > E3 > E5 > E2, et cet ordre est quelque peu différent des résultats de l’indice de stabilité, SI. En effet, ce résultat reflète le taux de migration moyen des particules dans l’échantillon pendant la période de mesure plutôt que le taux de migration des particules pendant la précipitation rapide de l’échantillon.

Discussion

L’évaluation rapide et précise de la stabilité de la MTC a toujours été au centre de la recherche en MTC. Pour fournir des informations plus utiles pour orienter l’amélioration du processus d’extraction, cette étude a analysé les mécanismes de stabilité et d’instabilité d’un échantillon à l’aide d’une technologie non destructive proche infrarouge.

Dans ce protocole, les paramètres de stabilité importants sont calculés sur la base de données d’analyse MLS précises. Les balayages MLS peuvent collecter la transmission (T%) et la rétrodiffusion (BS%) de l’échantillon en temps réel et calculer l’indice de stabilité (SI), la taille des particules, la vitesse de migration des particules et d’autres paramètres physiques importants. La formule de calcul est donnée par l’équation (1)⁴:

STI = (1)

où x i est la transmission moyenne pour chaque minute de mesure, x T est la moyenne x i, x _T = (x ₁ + x ₂ + ... x_i + x_i+1 ... + x n)/n, et n est le nombre de balayages. Le SI est un paramètre important reflétant la stabilité de l’échantillon, et une augmentation de la valeur SI indique une diminution de la stabilité. Le SI comprend toutes les données de mesure pour le calcul, ce qui signifie qu’il peut être utilisé pour prédire et évaluer la stabilité des échantillons à court terme.

Le calcul de la taille des particules est basé sur la loi de Beer-Lambert. La formule de calcul est donnée par l’équation (2):

T(l,ri) = T₀ , l(d,φ) = (2)

où ri est le diamètre intérieur de la cellule, et T₀ est l’intensité lumineuse de transmission de la phase continue. En fonction de l’intensité lumineuse de transmission (T) mesurée, de la fraction volumique de particules (φ) et des paramètres définis, la taille des particules peut être calculée.

La vitesse de sédimentation est calculée à l’aide de l’équation (3):

(3)

V est le taux de migration des particules (ms−1), ρ _c est la densité de phase continue (kgm−3), ρ_p est la densité des particules (kgm−3), g est la constante de gravité ( 9,81 ms⁻²), d est le diamètre moyen des particules (μm), v est la viscosité en phase continue (cP) et est le pourcentage volumique.

Dans le processus d’extraction à la chaleur, un grand nombre de tanins hydrolysables dans l’hydrolyse PE, libérant l’acide ellagique aglycone insoluble. Puisque l’acide ellagique est une molécule plane non polaire, il subit une agrégation intermoléculaire et une précipitation dues à des interactions hydrophobes, ce qui est la principale cause de précipitation dans la solution¹. Avec l’extension du temps d’extraction, plus d’acide ellagique est formé, ce qui entraîne une mauvaise stabilité de l’échantillon, et le temps de clarification de l’échantillon correspondant est raccourci. Cela se reflète bien dans les résultats de la figure 4.

Sur la base des résultats de calcul ci-dessus, on peut conclure que la précipitation provoquée par l’agrégation de composants ou de particules, qui est évidente dans les échantillons E3-E5, est la principale source du mécanisme d’instabilité de la solution d’extraction PE. En raison des polysaccharides dissous pendant le processus d’extraction, E2 était relativement stable car le processus de précipitation était entravé par sa viscosité élevée¹⁰. Cependant, comme la période d’extraction a été prolongée, de grandes quantités de composants insolubles tels que l’acide ellagique ont été produites, ce qui rend difficile le maintien de l’état d’équilibre. Dans l’ensemble, l’instabilité accélérée a commencé à ~12 h, et la durée d’extraction avait une corrélation négative avec la stabilité, ce qui était crucial pour l’optimisation du processus.

L’importance de la méthode MLS par rapport aux méthodes existantes est la suivante. Tout d’abord, les résultats de mesure sont plus précis et authentiques puisque la méthode est simple à utiliser, ne nécessite aucun prétraitement de l’échantillon et que les mesures peuvent être prises sans toucher l’échantillon. Même les échantillons à forte concentration ne nécessitent aucune dilution. Deuxièmement, MLS a une grande sensibilité. Les changements de vitesse en fonction de la concentration et de la taille des particules peuvent être détectés au début du changement des particules dispersées dans la préparation liquide. Ainsi, comparé à l’observation visuelle, MLS est ~200x plus efficace en termes de temps.

Étant donné que les changements de température peuvent avoir un impact sur l’intensité lumineuse diffusée du système, il convient de souligner que la température de l’échantillon doit être maintenue constante après l’installation, ce qui nécessite un temps d’équilibration. De plus, les éléments interférents (tels que les résidus de matériel médicinal) doivent être éliminés pour évaluer correctement la stabilité de l’extrait. Enfin, il est essentiel de mesurer avec précision les caractéristiques physiques avant le test afin de déterminer avec précision les paramètres physiques, tels que la taille des particules et le chemin sans photons.

Cette approche comporte plusieurs limites. Par exemple, l’oxydation du stockage à long terme provoque des changements brusques de couleur dans la solution d’extraction, ce qui peut affecter l’évaluation des précipitations et le comportement d’agrégation. Il peut être difficile de garantir la cohérence de certains échantillons lorsque des échantillons parallèles sont requis, car plusieurs échantillons ne peuvent pas être mesurés à la fois. L’investissement en équipement requis pour cette technologie est relativement coûteux, ce qui constitue le principal obstacle à son application et à sa promotion.

À l’avenir, nous sommes convaincus que cette méthode apportera des contributions exceptionnelles dans le domaine des préparations pharmaceutiques, en particulier dans les évaluations de la dispersion et de la dissolution in vitro. Elle peut être utilisée pour étudier de nouveaux systèmes d’administration de médicaments tels que les liposomes, les nanoparticules et les gels in situ, et en raison de ses avantages d’être plus efficace, rapide, simple et complète, cette méthode pourrait raccourcir considérablement le cycle de recherche^11,12. De plus, un modèle de prédiction de la stabilité basé sur une grande quantité de données sur l’instabilité des médicaments pourrait être réalisé. Cette technologie pourrait être couplée et améliorée avec d’autres techniques de détection à l’avenir, ce qui pourrait contribuer à la recherche et au développement pharmaceutiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable electric heating jacket	Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd	MH-1000	www.keweiyq.com
Analytical balance(1/10000)	Sartorious, Germany	BSA224S	www.sartorius.com.cn
CNC ultrasonic instrument	Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd	KQ-500DE	www.ks-csyq.com
GL-16 high-speed centrifuge	Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd	18091403	www.sklxj.com
Phyllanthus emblica L.	Hehuachi medicinal materials market	YJL2004	Produced in Yunnan
Turbisoft Lab multiple light scattering instrument	French Formulaction Company	Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5	www.formulaction.com
UPR-II-5T ultra-pure water device	Sichuan ULUPURE  Ultrapure Technology Co., Ltd	Z16030559	www.ccdup.com