Ved hjelp av flere lysspredning for å undersøke stabiliteten til Phyllanthus emblica L. ekstrakter oppnådd med forskjellige ekstraksjonsmetoder

Summary

Her introduserer vi en stabilitetsevalueringsmetode basert på flere lysspredningsteknologi for å evaluere stabiliteten til tradisjonelle kinesiske medisinekstrakter.

Abstract

Ekstraksjonsmiddelet for tradisjonell kinesisk medisin er nøkkelmellomproduktet i forberedelsesprosessen, og stabiliteten har en viktig innvirkning på sluttproduktets effektivitet og kvalitet. Imidlertid er eksisterende stabilitetsevalueringsmetoder ofte tidkrevende og arbeidskrevende, og krever langsiktig observasjon og drift av komplekst utstyr (for eksempel væskekromatografi med høy ytelse), og det er vanskelig å få mer fysisk informasjon om systemets ustabilitet. Derfor er det et presserende behov for å etablere en rask og nøyaktig stabilitetsanalyseteknologi for tradisjonell kinesisk medisin. Multippel lysspredning er en banebrytende analytisk metode som nøyaktig og raskt kan evaluere stabiliteten til tradisjonelle kinesiske medisiner på en miljøvennlig måte uten å endre prøvens natur eller tilstand eller bruke organiske reagenser.

I dette arbeidet, ved hjelp av presise skanningsdata for flere lysspredning, oppnådde den nåværende protokollen raskt variasjonskurvene for lagtykkelse, partikkelmigrasjonshastighet og gjennomsnittlig partikkelstørrelse over tid. Dette muliggjorde nøyaktig identifisering av mekanismen og avgjørende egenskaper som forårsaket systemets ustabilitet i sine tidlige stadier. Merk at forskningsperioden for utvinningsprosessen kan forkortes betydelig ved detaljert kvantifisering av systemstabiliteten, noe som også muliggjør en rask, nøyaktig og grundig analyse av effekten av ulike utvinningsprosesser på stabiliteten til Phyllanthus emblica L.

Introduction

I produksjonen av tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har stabiliteten til TCM-ekstraksjonsmellomprodukter og relaterte flytende preparater alltid vært fokus for inspeksjon¹. Den kliniske effekten av legemidler, spesielt med polyfenoler som den primære aktive ingrediensen, lider på grunn av betydelige stabilitetsproblemer ^2,3. Sanajon oral væske og Nuodikang oral væske er eksempler på typiske tilfeller av dette problemet⁴. Derfor er det avgjørende å lære å bruke effektive verktøy for raskt og nøyaktig å evaluere og optimalisere stabiliteten til flytende mellomprodukter i TCM produksjonsprosessen. Phyllanthus emblica L. (PE), en utbredt medisinsk plante i Sørøst-Asia, antas å ha gode antioksidantegenskaper⁵, samt antiinflammatorisk⁶, antibakteriell⁷ og antitumorvirkninger⁸. Under den termiske ekstraksjonsprosedyren transformerer tanninene i PE voldsomt⁹. Under katalyse med høye temperaturer hydrolyserer disse tanninene raskt for å produsere molekyler som gallinsyre og ellaginsyre, noe som fører til ustabilitet eller nedbør på grunn av deres dårlige oppløselighet¹. Nåværende metoder for evaluering av TCM-stabilitet, som akselerert testing eller sentrifugering, er vanligvis tungvint⁴, noe som begrenser videreutviklingen av relevante prepareringsprosesser.

Basert på prinsippet om multippel lysspredning (MLS) etablerte vi en rask stabilitetsevalueringsmetode for PEF-ekstrakter og analyserte ustabilitetsmekanismen. MLS er en målemetode basert på skanning av nær-infrarøde lyskilder. Enhver endring i løsningssystemet resulterer i en endring i lysintensiteten. Det innfallende lyset spres når det absorberes eller penetreres av partiklene i prøven. Systemet registrerer overføringslyssignalet når det passerer gjennom prøven; Hvis lystransmisjonen til prøven er dårlig, registrerer systemet tilbakespredningslyssignalet. Sammenlignet med visuell observasjon kan dette spare mye tid¹ og kan raskt og nøyaktig analysere ustabilitetsfenomenet i detalj, og dermed gi mer nyttig informasjon for å veilede optimaliseringen av utvinningsprosessen.

Protocol

1. Klargjøring av ekstrakt

1. Nøyaktig veie en passende mengde PE, og tilsett 10x (vekt) av avionisert vann for tilbakeløpsekstraksjon.
2. Sett fem prøver for tilbakeløpsekstraksjon i 0 timer (E1), 0,5 timer (E2), 1 time (E3), 1,5 timer (E4) og 2 timer (E5) etter veiing.
3. Etter ekstraksjon, avkjøl prøvene til romtemperatur, og vei for å gjøre opp for den tapte vekten for å sikre konsistens med pre-ekstraksjonsvektene.
4. Sentrifuger prøvene ved 8 581 × g i 10 minutter for å sikre fjerning av uoppløselig materiale og urterester fra prøveløsningen.
5. Bruk en pipette til å tilsette 20 ml prøveoppløsning i prøveflasken for å sikre at oppløsningen som tilsettes hver gang, er i samme høyde.
   MERK: Unngå kontaminering, for eksempel fingeravtrykk, på skannedelen av prøveflasken, sørg for at prøveflasken er ren, og kontroller om det er synlige riper på flaskeoverflaten. Når du tilsetter prøveoppløsningen, må du passe på at du ikke søler eller spruter på prøveflasken, og sørg for at væskenivået er i samme høyde i hver flaske.

2. Instrument drift

1. Slå på MLS-deteksjonsinstrumentet, og varm det opp i 30 minutter.
2. Klikk på Opprett fil-knappen i toppmenyen (eller klikk på filet | Ny filfunksjon ) for å opprette en ny testfil.
3. Klikk på knappen Vis Turbiscan Lab-temperatur i toppmenyen for å stille måltemperaturen for instrumentet til 25 °C.
   MERK: Instrumentets innstilte temperatur må være høyere enn romtemperaturen. Ellers vil prøvetemperaturen påvirkes av romtemperaturen.
4. Klikk på Programskanning i toppmenyen for å gå inn i installasjonsanalyseprogrammet. Legg programmet til listen, og legg til 5 min som en syklus på oppgavelinjen, skann i 48 timer til analysesekvensen og sett balansetiden til 20 min. Velg dette analyseprogrammet for alle påfølgende målinger.
5. Flytt den klargjorte prøveflasken inn i MLS-deteksjonssystemet. Etter å ha satt opp programmet, klikk på Start for å starte målingen.
   MERK: Vær forsiktig så du ikke rister glassflasken når du legger i prøven. Målingen kan bare startes etter at prøvetemperaturen og innstillingstemperaturen er balansert.

3. Programinnstilling for flere lysspredningsanalyser

1. Etter datainnsamlingen klikker du på listen over beregningsparametere for å stille inn de optiske parametrene for å beregne stabilitetsindeksen (SI), partikkelstørrelsen og partikkelmigrasjonshastigheten.
2. Sett de optiske parametrene som følger: kontinuerlig faselystransmisjonsintensitet (T₀) som 99,99% (vann), dispergert fasebrytningsindeks (np) som 1,36 og kontinuerlig fasebrytningsindeks (nf) som 1,33.

Representative Results

Figur 1 viser prinsippet om måling av flere lys og betydningen av de innsamlede resultatene. I MLS-spektraresultatene (figur 2) var abscissa høyden på prøvecellen, og ordinaten var transmisjons- (T%) og tilbakespredningsintensitet (BS%). Ved å beregne MLS-spektraresultatene kan systemet oppnå endringene i de viktigste fysiske parametrene til prøven i løpet av måleperioden, inkludert deltaoverføringsmiddelverdien (ΔT) (figur 3A), den fotonfrie banen (figur 3B), SI (figur 3C) og partikkelstørrelsen (figur 3D). Med forlengelsen av måletiden svinger MLS-spektrene av stabile ekstrakter lite eller ikke i det hele tatt, og deres fysiske parametere, inkludert ΔT, fotonfri bane og partikkelstørrelse, har en tendens til å være stabil.

Typiske resultater av ustabilitet i utvalget er vist i figur 2A,C-E. De spektrale resultatene av stabile prøver hadde en tendens til å være konsistente ved alle skanningstider, som vist i figur 2B, som er et typisk kjennetegn ved stabile prøver. For ytterligere å kvantifisere stabilitetsparametrene kan SI brukes til evaluering. Den nåværende protokollen tillater rask identifisering av stabilitet under forskjellige ekstraksjonsmetoder basert på SI (figur 3C) og analyse av mekanismen for ustabilitet. Det skal bemerkes at lavere SI-verdier er forbundet med bedre stabilitet. Prøven anses som stabil hvis SI er <10 innen skanningsperioden. Ved å sammenligne SI-verdiene kunne stabiliteten til de fem prøvene skilles nøyaktig, og de relevante stabilitetskarakteristikkspektrene kunne oppnås (figur 4). Partikkelmigrasjonshastigheten (tabell 1) kombinert med parameteren ovenfor kan ytterligere gi innsikt i utvalgets ustabilitetsmekanisme.

Figur 1: Analyseprinsipp for MLS. MLS bruker pulserende nær-infrarødt lys som lyskilde (bølgelengde: 880 nm), og to synkrone optiske detektorer oppdager overføringslyset (T, 0 ° fra den innfallende strålingen, overføringssensoren) og tilbakespredningslyset (BS, 135 ° fra den innfallende strålingen, tilbakespredningsdetektoren) som passerer gjennom prøven, henholdsvis. Lyskilden, transmisjonslysdetektoren og tilbakespredningslysdetektoren utgjør målesonden. Målingen fra bunnen til toppen av prøvecellen består av én skanning. Eventuell ustabilitet i prøven vil ha en liten innvirkning på T - og BS-signalstyrken . Denne påvirkningen registreres og analyseres for å karakterisere ulike ustabile fenomener, inkludert flokkulering, stratifisering og sedimentering⁴. Gjennom beregning av flere skanningsresultater kan mekanismen og hastigheten til ustabiliteten til løsningssystemet i begynnelsen av ustabiliteten analyseres nøyaktig, og forholdskurven for lagtykkelsen (sedimentlag, flytende lag og avklaringslag) med tiden, samt forholdskurven for partikkelmigrasjonshastigheten og partikkelstørrelsen med tiden, kan fås. Forkortelse: MLS = multiple light scattering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: MLS-spektra (transmisjon og tilbakespredning) av PE-ekstrakt med ulike ekstraksjonsmetoder. (A-E) MLS-spektra av E1-E5. Fra spektraldataene kan det grovt utledes at (B) E2-prøven svingte mindre, noe som indikerer at prøven var mer stabil, mens (A) E1 kan ha hatt turbiditet på grunn av den generelle nedgangen i overføringslys. (VG Nett) E3-E5-prøvene var ganske ustabile, og spektraldataene til prøvene i forskjellige høyder var forskjellige, noe som indikerer at stratifisering skjedde i den senere perioden. Forkortelser: MLS = multiple light scattering, PE = Phyllanthus emblica L., EN = ekstrakt oppnådd ved metode N. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Resultater fra MLS-spektraanalyse . (A) Med tiden blir T-verdien høyere, og prøven er mer ustabil. For E3 og E4 returnerte ΔT-nivået til det tidligere stadiet til slutt, noe som indikerer at aggregering og nedbør skjedde i disse ekstraktene. ΔT av E5 forble på et lavt nivå etter turbiditet, noe som indikerer at E5 kan ha hatt en stor mengde sedimentering. (B) Trenden i den fotonfrie banen kan gjenspeile endringene i prøvens overførte lys. (C) Stabiliteten til forskjellige ekstrakter svingte kontinuerlig over tid, med E2 > E1 > E5 > E3 > E4 som stabilitetsrekkefølgen i løpet av lagringsperioden. (D) Dynamiske endringer i partikkelstørrelse kan avsløre aggregeringen av partikler i prøven. Resultatene viser at partikkelstørrelsene på alle prøvene endret seg betydelig innen 8-20 timer, med partikkelstørrelsen E3 og E5 til og med over måleområdet. Dermed er dette stadiet avgjørende for dannelsen av ustabile aggregater av molekyler eller partikler i prøven. På samme måte, i sluttfasen, da partiklene begynte å kjerne og fortsette å aggregere, ble det til slutt observert en reduksjon i partikkelstørrelsen etter at nok partikler dannet store agglomerater og utfelte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Ustabilitet av PE-ekstrakter oppnådd ved forskjellige ekstraksjonsmetoder. Resultatet tar tid da abscissa og fargen representerer intensiteten av overført lys eller tilbakespredt lys. Resultatet kan direkte gjenspeile den virkelige situasjonen for turbiditet og stratifisering av prøvene på forskjellige tidspunkter og høyder. Kromatisitetsbåndet øverst i hvert resultat representerer lysintensitetsverdiene som tilsvarer forskjellige farger, der den blå delen representerer T%, og den brune delen representerer BS%. (A) T% av E1 begynte å avta etter 16 timer, noe som indikerer at prøven var uklar, og hele prosessen ikke delaminerte eller utfelte. (B) T% av E2 var konsistent gjennom hele måleperioden, noe som indikerer at prøven var stabil. (C) E3 var uklar ved 16 timer, og BS% økte plutselig ved 20 timer, noe som indikerer at partiklene i prøven samlet seg, stratifiserte og utfelte i det øyeblikket. (D) Resultatet her er likt som i (C). (E) E5 opplevde alvorlig delaminering etter 20 timer, som varte til slutten av målingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Måling	Beregningssonen	Migrasjonshastighet (mm/t)
E1	0-24 timer	1.56
E2	0-24 timer	0.005
E3	0-24 timer	1.476
E4	0-19 t	2.732
E5	0-24 timer	1.377

Tabell 1: Resultater av partikkelmigrasjonshastighet. I resultatene kan partikkelmigrasjonshastigheten betraktes som partikkelnedbørshastigheten, som til en viss grad kan gjenspeile prøvens stabilitet. Høyere migrasjonsrater indikerer dårligere stabilitet. Det fremgår av resultatene at flytteraten ble rangert som E4 > E1 > E3 > E5 > E2, og denne rekkefølgen er noe forskjellig fra resultatene for stabilitetsindeksen, SI. Dette skyldes at dette resultatet gjenspeiler den gjennomsnittlige migrasjonshastigheten for partikler i prøven i måleperioden i stedet for partikkelmigrasjonshastigheten under den raske utfellingen av prøven.

Discussion

Den raske og nøyaktige vurderingen av TCM-stabilitet har alltid vært et fokus for TCM-forskning. For å gi mer nyttig informasjon for å styre forbedringen av utvinningsprosessen, analyserte denne studien stabilitets- og ustabilitetsmekanismer for en prøve ved hjelp av en nær-infrarød ikke-destruktiv teknologi.

I denne protokollen beregnes de viktige stabilitetsparametrene basert på nøyaktige MLS-skannedata. MLS-skanninger kan samle overføringen (T%) og tilbakespredningen (BS%) av prøven i sanntid og beregne stabilitetsindeksen (SI), partikkelstørrelse, partikkelmigrasjonshastighet og andre viktige fysiske parametere. Beregningsformelen er gitt ved ligning (1) ⁴:

TSI = (1)

hvor x i er gjennomsnittlig overføring for hvert minutt av måling, x T er gjennomsnittet x _i, x _T = (x ₁ + x ₂ + ... x i + x_i +_{1 ... +} x n) / n, og n er antall skanninger. SI er en viktig parameter som reflekterer stabiliteten i utvalget, og en økning i SI-verdien indikerer en reduksjon i stabiliteten. SI inkluderer alle måledata for beregning, noe som betyr at den kan brukes til å forutsi og evaluere stabiliteten til prøver på kort sikt.

Partikkelstørrelsesberegningen er basert på Beer-Lamberts lov. Beregningsformelen er gitt ved ligning (2):

T(l,ri) = T₀ , l(d,φ) = (2)

hvor ri er cellens indre diameter, og T₀ er overføringslysintensiteten til den kontinuerlige fasen. I henhold til den målte overføringslysintensiteten (T), partikkelvolumfraksjonen (φ) og de innstilte parametrene, kan partikkelstørrelsen beregnes.

Senkningsreaksjonen beregnes ved hjelp av ligning (3):

(3)

V er partikkelmigrasjonshastigheten (ms−1), ρ _c er den kontinuerlige fasetettheten (kgm−3), ρ _p er partikkeltettheten (kgm−3), g er gravitasjonskonstanten (9,81 ms⁻²), d er den gjennomsnittlige partikkeldiameteren (μm), v er den kontinuerlige faseviskositeten (cP), og er volumprosenten.

I prosessen med ekstraksjon med varme hydrolyserer et stort antall hydrolyserbare tanniner i PE, og frigjør den uoppløselige aglycon ellaginsyren. Siden ellaginsyre er et plan ikke-polært molekyl, gjennomgår det intermolekylær aggregering og utfelling på grunn av hydrofobe interaksjoner, og dette er hovedårsaken til nedbør i løsningen¹. Ved forlengelse av ekstraksjonstiden dannes mer ellaginsyre, noe som resulterer i dårlig stabilitet av prøven, og klareringstiden for den tilsvarende prøven forkortes. Dette gjenspeiles godt i resultatene i figur 4.

Basert på de ovennevnte beregningsresultatene kan det konkluderes med at nedbøren forårsaket av aggregering av komponenter eller partikler, som er tydelig i E3-E5-prøvene, er hovedkilden til ustabilitetsmekanismen til PE-ekstraksjonsløsningen. På grunn av polysakkaridene som ble oppløst under ekstraksjonsprosessen, var E2 relativt stabil fordi utfellingsprosessen ble hindret av dens høye viskositet¹⁰. Men da ekstraksjonsperioden ble forlenget, ble store mengder uoppløselige komponenter som ellaginsyre produsert, noe som gjorde det vanskelig å opprettholde steady state. Totalt sett startet den akselererte ustabiliteten på ~12 timer, og utvinningsvarigheten hadde en negativ korrelasjon med stabilitet, noe som var avgjørende for prosessoptimalisering.

Betydningen av MLS-metoden i forhold til eksisterende metoder er som følger. For det første er måleresultatene mer nøyaktige og autentiske siden metoden er enkel å bruke, krever ingen prøvebehandling, og målingene kan tas uten å berøre prøven. Selv prøver med høye konsentrasjoner trenger ingen fortynning. For det andre har MLS høy følsomhet. Endringshastighetene basert på partikkelkonsentrasjon og størrelse kan detekteres ved begynnelsen av endringen i partiklene dispergert i væskepreparatet. Således, sammenlignet med visuell observasjon, er MLS ~ 200x mer tidseffektiv.

Siden temperaturendringer kan påvirke systemets spredte lysintensitet, bør det understrekes at prøvetemperaturen skal opprettholdes konstant etter installasjon, noe som krever en likevektstid. I tillegg må forstyrrende elementer (for eksempel rester av medisinsk materiale) fjernes for å vurdere ekstraktets stabilitet på riktig måte. Til slutt er det viktig å måle de fysiske egenskapene nøyaktig før testing for nøyaktig å bestemme de fysiske parametrene, for eksempel partikkelstørrelse og fotonfri bane.

Det er flere begrensninger ved denne tilnærmingen. For eksempel forårsaker oksidasjon fra langvarig lagring brå fargeendringer i ekstraksjonsløsningen, noe som kan påvirke nedbørsvurderingen og aggregeringsoppførselen. Det kan være utfordrende å garantere konsistensen av noen prøver når parallelle prøver kreves, siden flere prøver ikke kan måles samtidig. Utstyrsinvesteringen som kreves for denne teknologien er relativt dyr, noe som er den primære barrieren for søknad og markedsføring.

I fremtiden er vi sikre på at denne metoden vil gi fremragende bidrag innen farmasøytiske preparater, spesielt i evalueringer av dispersjon og in vitro oppløsning. Det kan brukes til å studere nye legemiddelleveringssystemer som liposomer, nanopartikler og in situ-geler, og på grunn av fordelene ved å være mer effektive, raske, enkle og omfattende, kan denne metoden forkorte forskningssyklusen betydelig^11,12. I tillegg kan en stabilitetsprediksjonsmodell basert på en stor mengde data om medisinsk ustabilitet realiseres. Denne teknologien kan kobles og forbedres med andre deteksjonsteknikker i fremtiden, noe som kan bidra til farmasøytisk forskning og utvikling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable electric heating jacket	Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd	MH-1000	www.keweiyq.com
Analytical balance(1/10000)	Sartorious, Germany	BSA224S	www.sartorius.com.cn
CNC ultrasonic instrument	Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd	KQ-500DE	www.ks-csyq.com
GL-16 high-speed centrifuge	Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd	18091403	www.sklxj.com
Phyllanthus emblica L.	Hehuachi medicinal materials market	YJL2004	Produced in Yunnan
Turbisoft Lab multiple light scattering instrument	French Formulaction Company	Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5	www.formulaction.com
UPR-II-5T ultra-pure water device	Sichuan ULUPURE  Ultrapure Technology Co., Ltd	Z16030559	www.ccdup.com