Использование множественного рассеяния света для изучения стабильности экстрактов Phyllanthus emblica L., полученных различными методами экстракции

Summary

Здесь мы представляем метод оценки стабильности, основанный на технологии множественного рассеяния света, для оценки стабильности экстрактов традиционной китайской медицины.

Abstract

Экстракционный промежуточный продукт традиционной китайской медицины является ключевым промежуточным продуктом в процессе приготовления, и его стабильность оказывает важное влияние на эффективность и качество конечного продукта. Однако существующие методы оценки стабильности часто отнимают много времени и труда, требуют длительного наблюдения и эксплуатации сложного оборудования (например, высокоэффективной жидкостной хроматографии), и трудно получить больше физической информации о нестабильности системы. Поэтому существует острая необходимость в создании быстрой и точной технологии анализа стабильности для традиционной китайской медицины. Многократное рассеяние света — это передовой аналитический метод, который позволяет точно и быстро оценить стабильность традиционных китайских лекарств экологически чистым способом, не изменяя природу или состояние образца и не используя органические реагенты.

В этой работе, используя точные данные сканирования множественного рассеяния света, настоящий протокол быстро получил кривые изменения толщины слоя, скорости миграции частиц и среднего размера частиц с течением времени. Это позволило точно определить механизм и важнейшие характеристики, вызывающие нестабильность системы на ранних стадиях. Следует отметить, что период исследования процесса экстракции может быть значительно сокращен за счет детальной количественной оценки стабильности системы, что также позволяет быстро, точно и глубоко проанализировать влияние различных процессов экстракции на стабильность Phyllanthus emblica L.

Introduction

При производстве традиционной китайской медицины (ТКМ) стабильность промежуточных продуктов экстракции ТКМ и связанных с ними жидких препаратов всегда была в центре внимания инспекции¹. Клиническая эффективность лекарственных средств, особенно с полифенолами в качестве основного действующего вещества, страдает из-за значительных проблем со стабильностью ^2,3. Пероральная жидкость Sanajon и пероральная жидкость Nuodikang являются примерами типичных случаев этой проблемы⁴. Поэтому крайне важно научиться использовать эффективные инструменты для быстрой и точной оценки и оптимизации стабильности жидких промежуточных продуктов в процессе производства ТКМ. Считается, что Phyllanthus emblica L. (PE), широко распространенное лекарственное растение в Юго-Восточной Азии, обладает хорошими антиоксидантными свойствами⁵, а также противовоспалительным⁶, антибактериальным⁷ и противоопухолевым действиями⁸. Во время процедуры термической экстракции дубильные вещества в полиэтилене бурно трансформируются⁹. При катализе с высокими температурами эти дубильные вещества быстро гидролизуются с образованием молекул, таких как галловая кислота и эллаговая кислота, которые приводят к нестабильности или осаждению из-за их плохой растворимости¹. Современные методы оценки стабильности ТКМ, такие как ускоренное тестирование или центрифугирование, обычно громоздки⁴, что ограничивает дальнейшее развитие соответствующих процессов подготовки.

Основываясь на принципе множественного рассеяния света (MLS), мы разработали метод быстрой оценки стабильности экстрактов PEF и проанализировали механизм нестабильности. MLS — это метод измерения, основанный на сканировании источников света в ближнем инфракрасном диапазоне. Любое изменение системы раствора приводит к изменению интенсивности света. Падающий свет рассеивается, когда он поглощается или проникает частицами образца. Система регистрирует световой сигнал передачи, когда он проходит через образец; Если коэффициент пропускания света образца плохой, система регистрирует сигнал обратного рассеяния света. По сравнению с визуальным наблюдением это может сэкономить много времени¹ и может быстро и точно проанализировать явление нестабильности в деталях, тем самым предоставляя более полезную информацию для оптимизации процесса экстракции.

Protocol

1. Приготовление экстракта

1. Точно взвесьте соответствующее количество полиэтилена и добавьте 10x (вес) деионизированной воды для экстракции с обратным холодильником.
2. Установите пять образцов для экстракции с обратным холодильником в течение 0 ч (E1), 0,5 ч (E2), 1 ч (E3), 1,5 ч (E4) и 2 ч (E5) после взвешивания.
3. После экстракции охладите образцы до комнатной температуры и взвесьте, чтобы восполнить потерянный вес, чтобы обеспечить согласованность с весами перед экстракцией.
4. Центрифугируют образцы при 8,581 × г в течение 10 мин, чтобы обеспечить удаление нерастворимого материала и растительных остатков из раствора образца.
5. Используйте пипетку, чтобы добавить 20 мл раствора образца во флакон с образцом, чтобы убедиться, что раствор, добавляемый каждый раз, находится на одной и той же высоте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте загрязнений, таких как отпечатки пальцев, на сканирующей части бутылки с образцом, убедитесь, что бутылка с образцом чистая, и проверьте, нет ли видимых царапин на поверхности бутылки. При добавлении раствора для образца будьте осторожны, чтобы не пролить и не разбрызгать бутылку с образцом, и убедитесь, что уровень жидкости находится на одинаковой высоте в каждой бутылке.

2. Работа прибора

1. Включите прибор обнаружения MLS и прогрейте его в течение 30 минут.
2. Нажмите кнопку « Создать файл » в верхнем меню (или нажмите «Файл» | Функция New file ), чтобы создать новый тестовый файл.
3. Нажмите кнопку « Показать температуру лаборатории Turbiscan » в верхнем меню, чтобы установить целевую температуру прибора на 25 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установленная температура прибора должна быть выше, чем комнатная температура; В противном случае на температуру образца будет влиять комнатная температура.
4. Нажмите « Сканирование программ » в верхнем меню, чтобы войти в программу анализа установки . Добавьте программу в список и на панели задач добавьте 5 минут в виде цикла, сканируйте в течение 48 часов в последовательность анализа и установите время баланса на 20 минут. Выберите эту программу анализа для всех последующих измерений.
5. Переместите подготовленный флакон с образцом в систему обнаружения MLS. После настройки программы нажмите « Пуск », чтобы начать измерение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не встряхнуть стеклянную бутылку при загрузке образца. Измерение может быть начато только после того, как температура образца и температура настройки будут сбалансированы.

3. Настройка программы анализа множественного рассеяния света

1. После сбора данных щелкните список параметров расчета , чтобы установить оптические параметры для расчета индекса стабильности (SI), размера частиц и скорости миграции частиц.
2. Установите оптические параметры следующим образом: интенсивность непрерывного фазового светопропускания (T₀) равна 99,99% (вода), показатель преломления дисперсной фазы (np) равен 1,36 и показатель непрерывного фазового преломления (nf) равен 1,33.

Representative Results

На рисунке 1 показан принцип многократного измерения освещенности и значение собранных результатов. В результатах спектров MLS (рис. 2) абсцисс представляла собой высоту ячейки образца, а ордината — интенсивность пропускания (T%) и обратного рассеяния (BS%). Вычисляя результаты спектров MLS, система может получить изменения ключевых физических параметров образца в течение периода измерения, включая среднее значение дельта-пропускания (ΔT) (рис. 3A), свободный пробег фотонов (рис. 3B), СИ (рис. 3C) и размер частиц (рис. 3D). С увеличением времени измерения спектры MLS стабильных экстрактов колеблются мало или совсем не колеблются, а их физические параметры, включая ΔT, пробег без фотонов и размер частиц, имеют тенденцию быть стабильными.

Типичные результаты нестабильности образца показаны на рисунке 2A,C-E. Спектральные результаты стабильных образцов, как правило, были последовательными во все время сканирования, как показано на рисунке 2B, что является типичной характеристикой стабильных образцов. Для дальнейшей количественной оценки параметров стабильности можно использовать СИ для оценки. Текущий протокол позволяет быстро идентифицировать стабильность при различных методах экстракции на основе СИ (рис. 3C) и анализировать механизм нестабильности. Следует отметить, что более низкие значения СИ связаны с лучшей стабильностью. Образец считается стабильным, если СИ составляет <10 в течение периода сканирования. Сравнивая значения СИ, можно было точно различить стабильности пяти образцов и получить соответствующие спектры характеристик стабильности (рис. 4). Скорость миграции частиц (таблица 1) в сочетании с приведенным выше параметром может дополнительно дать представление о механизме нестабильности образца.

Рисунок 1: Принцип анализа MLS. MLS использует импульсный ближний инфракрасный свет в качестве источника света (длина волны: 880 нм), а два синхронных оптических детектора обнаруживают светопропускающий свет (T, 0° от падающего излучения, датчик пропускания) и свет обратного рассеяния (BS, 135° от падающего излучения, детектор обратного рассеяния), проходящий через образец, соответственно. Источник света, детектор пропускающего света и детектор обратного рассеяния света составляют измерительный щуп. Измерение снизу вверх ячейки образца включает в себя одно сканирование. Любая нестабильность в образце окажет незначительное влияние на уровни сигнала T и BS . Это воздействие регистрируется и анализируется для характеристики различных нестабильных явлений, включая флокуляцию, стратификацию и седиментацию⁴. Путем расчета нескольких результатов сканирования можно точно проанализировать механизм и скорость неустойчивости системы раствора на начальной стадии неустойчивости, а также кривую зависимости толщины слоя (слой осадка, плавающий слой и слой осветления) со временем, а также кривую зависимости скорости миграции частиц и размера частиц со временем, можно получить. Аббревиатура: MLS = множественное рассеяние света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Спектры MLS (пропускание и обратное рассеяние) экстракта ПЭ с различными методами экстракции. (А-Е) Спектры MLS E1-E5. Из спектральных данных можно сделать приблизительный вывод о том, что (B) образец E2 колебался меньше, что указывает на то, что образец был более стабильным, в то время как (A) E1 мог иметь мутность из-за общего снижения светопропускания. (С-Е) Образцы Е3-Е5 были достаточно нестабильными, а спектральные данные образцов на разных высотах были разными, что указывает на то, что стратификация произошла в более поздний период. Сокращения: MLS = многократное рассеяние света, PE = Phyllanthus emblica L., EN = экстракт, полученный методом N. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Результаты анализа спектров MLS . (A) С течением времени значение T становится выше, и образец становится более нестабильным. Для E3 и E4 уровень ΔT в конце концов вернулся к уровню более ранней стадии, что указывает на то, что в этих экстрактах происходили агрегация и осаждение. ΔT E5 оставался на низком уровне после помутнения, что указывает на то, что E5 мог иметь большое количество осадконакопления. (B) Тенденция свободного пробега фотонов может отражать изменения в проходящем свете образца. (C) Стабильность различных экстрактов непрерывно колебалась с течением времени, при этом E2 > E1 > E5 > E3 > E4 являются порядком стабильности в течение периода хранения. (D) Динамические изменения размера частиц могут выявить агрегацию частиц в образце. Результаты показывают, что размеры частиц всех образцов значительно изменились в течение 8-20 часов, а размер частиц E3 и E5 даже превысил диапазон измерений. Таким образом, эта стадия является решающей для образования нестабильных агрегатов молекул или частиц в образце. Точно так же на заключительной стадии, когда частицы начали зарождаться и продолжать агрегировать, в конечном итоге наблюдалось уменьшение размера частиц после того, как достаточное количество частиц образовало большие агломераты и выпало в осадок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Нестабильность экстрактов ПЭ, полученных различными методами экстракции. Результат требует времени, так как абсцисс и цвет представляют интенсивность проходящего света или обратно рассеянного света. Результат может непосредственно отражать реальную ситуацию мутности и расслоения образцов в разные моменты времени и высоты. Полоса цветности в верхней части каждого результата представляет значения интенсивности света, соответствующие различным цветам, где синяя часть представляет T%, а коричневая часть представляет BS%. (A) T% E1 начал снижаться через 16 часов, что указывает на то, что образец был мутным, и весь процесс не расслаивался и не выпадал в осадок. (B) T% E2 был стабильным в течение всего периода измерения, что указывает на то, что образец был стабильным. (C) E3 был мутным через 16 часов, а его BS% внезапно увеличился через 20 часов, что указывает на то, что частицы в образце собрались, расслоились и выпали в осадок в этот момент. (D) Результат здесь аналогичен результату в (C). (E) Е5 испытал сильное расслоение через 20 часов, которое продолжалось до конца измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Измерение	Вычислительная зона	Скорость миграции (мм/ч)
Е1	0-24 ч	1.56
Е2	0-24 ч	0.005
Е3	0-24 ч	1.476
Е4	0-19 ч	2.732
Е5	0-24 ч	1.377

Таблица 1: Результаты скорости миграции частиц. В результатах скорость миграции частиц можно рассматривать как скорость осаждения частиц, которая может в определенной степени отражать стабильность образца. Более высокие темпы миграции указывают на меньшую стабильность. Из результатов видно, что коэффициент миграции был ранжирован как E4 > E1 > E3 > E5 > E2, и этот порядок несколько отличается от результатов для индекса устойчивости SI. Это связано с тем, что этот результат отражает среднюю скорость миграции частиц в образце в течение периода измерения, а не скорость миграции частиц во время быстрого осаждения образца.

Discussion

Быстрая и точная оценка стабильности ТКМ всегда была в центре внимания исследований ТКМ. Чтобы предоставить больше полезной информации для направления улучшения процесса экстракции, в этом исследовании были проанализированы механизмы стабильности и нестабильности образца с использованием неразрушающей технологии ближнего инфракрасного диапазона.

В этом протоколе важные параметры стабильности рассчитываются на основе точных данных сканирования MLS. Сканирование MLS может собирать данные о пропускании (T%) и обратном рассеянии (BS%) образца в режиме реального времени и вычислять индекс стабильности (SI), размер частиц, скорость миграции частиц и другие важные физические параметры. Формула расчета представлена уравнением (1)⁴:

TSI = (1)

где x i - средняя передача за каждую минуту измерения, x T - среднее значение x _i, x _T = (x ₁ + x₂ + ... x_i + x_i+1 ... + x n)/n, а n — количество сканирований. СИ является важным параметром, отражающим стабильность выборки, а повышение значения СИ свидетельствует о снижении стабильности. СИ включает в себя все данные измерений для расчета, что означает, что его можно использовать для прогнозирования и оценки стабильности образцов в краткосрочной перспективе.

Расчет размера частиц основан на законе Бера-Ламберта. Формула расчета представлена формулой (2):

T(l,ri) = T₀ , l(d,φ) = (2)

где ri — внутренний диаметр ячейки, а T₀ — интенсивность пропускания света непрерывной фазы. В соответствии с измеренной интенсивностью пропускания света (T), объемной долей частиц (φ) и заданными параметрами можно рассчитать размер частиц.

Скорость седиментации рассчитывается по уравнению (3):

(3)

V — скорость миграции частиц (мс−1), ρ _c — плотность непрерывной фазы (кгм−3), ρ _p — плотность частиц (кгм−3), g — постоянная силы тяжести (9,81 мс⁻²), d — средний диаметр частиц (мкм), v — вязкость непрерывной фазы (cP) и объемный процент.

В процессе экстракции с помощью тепла большое количество гидролизуемых дубильных веществ в ПЭ гидролизуется, высвобождая нерастворимый агликон эллаговую кислоту. Поскольку эллаговая кислота является плоской неполярной молекулой, она подвергается межмолекулярной агрегации и осаждению из-за гидрофобных взаимодействий, и это является основной причиной осаждения в растворе¹. С увеличением времени экстракции образуется больше эллаговой кислоты, что приводит к плохой стабильности образца, а время осветления соответствующего образца сокращается. Это хорошо отражено в результатах, приведенных на рисунке 4.

На основании приведенных выше результатов расчетов можно сделать вывод, что осаждение, вызванное агрегацией компонентов или частиц, которое проявляется в образцах Е3-Е5, является основным источником механизма нестабильности экстракционного раствора ПЭ. Из-за полисахаридов, растворенных в процессе экстракции, E2 был относительно стабильным, поскольку процесс осаждения был затруднен его высокой вязкостью¹⁰. Однако по мере продления периода экстракции образовывалось большое количество нерастворимых компонентов, таких как эллаговая кислота, что затрудняло поддержание устойчивого состояния. В целом, ускоренная нестабильность начиналась через ~ 12 часов, а продолжительность экстракции имела отрицательную корреляцию со стабильностью, что имело решающее значение для оптимизации процесса.

Значение метода MLS по отношению к существующим методам заключается в следующем. Во-первых, результаты измерений являются более точными и достоверными, поскольку метод прост в использовании, не требует предварительной обработки образца, а измерения можно проводить, не прикасаясь к образцу. Даже образцы с высокими концентрациями не нуждаются в разбавлении. Во-вторых, MLS обладает высокой чувствительностью. Изменение скоростей, основанное на концентрации и размере частиц, может быть обнаружено в начале изменения частиц, диспергированных в жидком препарате. Таким образом, по сравнению с визуальным наблюдением, MLS в ~ 200 раз эффективнее по времени.

Поскольку изменения температуры могут влиять на интенсивность рассеянного света системы, следует подчеркнуть, что температура образца должна поддерживаться постоянной после установки, что требует времени на уравновешивание. Кроме того, мешающие элементы (например, остатки лекарственного материала) должны быть удалены для надлежащей оценки стабильности экстракта. Наконец, важно точно измерить физические характеристики перед тестированием, чтобы точно определить физические параметры, такие как размер частиц и длина без фотонов.

У этого подхода есть несколько ограничений. Например, окисление при длительном хранении вызывает резкие изменения цвета экстрагирующего раствора, что может повлиять на оценку осаждения и поведение агрегации. Может быть сложно гарантировать согласованность некоторых образцов, когда требуются параллельные выборки, поскольку несколько образцов не могут быть измерены одновременно. Инвестиции в оборудование, необходимые для этой технологии, относительно дороги, что является основным препятствием для ее применения и продвижения.

Мы уверены, что в будущем этот метод внесет выдающийся вклад в области фармацевтических препаратов, особенно в оценку дисперсии и растворения in vitro. Он может быть использован для изучения новых систем доставки лекарств, таких как липосомы, наночастицы и гели in situ, и благодаря своим преимуществам, заключающимся в том, что он более эффективен, быстр, прост и всеобъемлющ, этот метод может значительно сократить цикл исследования^11,12. Кроме того, может быть реализована модель прогнозирования стабильности, основанная на большом количестве данных о нестабильности лекарств. В будущем эта технология может быть объединена и усовершенствована с другими методами обнаружения, что может способствовать фармацевтическим исследованиям и разработкам.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable electric heating jacket	Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd	MH-1000	www.keweiyq.com
Analytical balance(1/10000)	Sartorious, Germany	BSA224S	www.sartorius.com.cn
CNC ultrasonic instrument	Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd	KQ-500DE	www.ks-csyq.com
GL-16 high-speed centrifuge	Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd	18091403	www.sklxj.com
Phyllanthus emblica L.	Hehuachi medicinal materials market	YJL2004	Produced in Yunnan
Turbisoft Lab multiple light scattering instrument	French Formulaction Company	Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5	www.formulaction.com
UPR-II-5T ultra-pure water device	Sichuan ULUPURE  Ultrapure Technology Co., Ltd	Z16030559	www.ccdup.com