Använda flera ljusspridningar för att undersöka stabiliteten hos Phyllanthus emblica L. Extrakt erhållna med olika extraktionsmetoder

Summary

Här introducerar vi en stabilitetsutvärderingsmetod baserad på multipel ljusspridningsteknik för att utvärdera stabiliteten hos traditionella kinesiska medicinextrakt.

Abstract

Extraktionsintermediären i traditionell kinesisk medicin är den viktigaste mellanprodukten i beredningsprocessen, och dess stabilitet har en viktig inverkan på slutproduktens effektivitet och kvalitet. Befintliga stabilitetsutvärderingsmetoder är emellertid ofta tidskrävande och arbetsintensiva, vilket kräver långsiktig observation och drift av komplex utrustning (såsom högpresterande vätskekromatografi), och det är svårt att få mer fysisk information om systemets instabilitet. Därför finns det ett brådskande behov av att etablera en snabb och exakt stabilitetsanalysteknik för traditionell kinesisk medicin. Multipel ljusspridning är en banbrytande analysmetod som exakt och snabbt kan utvärdera stabiliteten hos traditionella kinesiska läkemedel på ett miljövänligt sätt utan att ändra provets natur eller tillstånd eller använda organiska reagenser.

I detta arbete, med hjälp av exakta skanningsdata för multipel ljusspridning, förvärvade det nuvarande protokollet snabbt variationskurvorna för skikttjocklek, partikelmigrationshastighet och genomsnittlig partikelstorlek över tiden. Detta möjliggjorde en exakt identifiering av mekanismen och avgörande egenskaper som orsakade systemets instabilitet i ett tidigt skede. Observera att forskningsperioden för extraktionsprocessen kan förkortas avsevärt genom den detaljerade kvantifieringen av systemstabiliteten, vilket också möjliggör en snabb, noggrann och djupgående analys av effekterna av olika extraktionsprocesser på stabiliteten hos Phyllanthus emblica L.

Introduction

Vid tillverkning av traditionell kinesisk medicin (TCM) har stabiliteten hos TCM-extraktionsintermediärer och relaterade flytande preparat alltid varit i fokus för inspektion¹. Den kliniska effekten av läkemedel, särskilt med polyfenoler som primär aktiv ingrediens, lider på grund av betydande stabilitetsproblem ^2,3. Sanajon oral vätska och Nuodikang oral vätska är exempel på typiska fall av denna fråga⁴. Därför är det viktigt att lära sig att använda effektiva verktyg för att snabbt och noggrant utvärdera och optimera stabiliteten hos flytande mellanprodukter i TCM-produktionsprocessen. Phyllanthus emblica L. (PE), en utbredd medicinalväxt i Sydostasien, tros ha goda antioxidantegenskaper⁵, liksom antiinflammatorisk⁶, antibakteriell⁷, och antitumörverkan⁸. Under den termiska extraktionsproceduren omvandlas tanninerna i PE våldsamt⁹. Under katalys med höga temperaturer hydrolyseras dessa tanniner snabbt för att producera molekyler såsom gallinsyra och ellaginsyra, vilket leder till instabilitet eller utfällning på grund av deras dåliga löslighet¹. Nuvarande metoder för utvärdering av TCM-stabilitet, såsom accelererad testning eller centrifugering, är vanligtvis besvärliga⁴, vilket begränsar vidareutvecklingen av relevanta beredningsprocesser.

Baserat på principen om multipel ljusspridning (MLS) etablerade vi en snabb stabilitetsutvärderingsmetod för PEF-extrakt och analyserade instabilitetsmekanismen. MLS är en mätmetod baserad på skanning av nära infraröda ljuskällor. Varje ändring av lösningssystemet resulterar i en förändring av ljusintensiteten. Det infallande ljuset sprids när det absorberas eller penetreras av provets partiklar. Systemet registrerar transmissionsljussignalen när den passerar genom provet. Om provets ljustransmittans är dålig registrerar systemet ljussignalen för bakåtspridning. Jämfört med visuell observation kan detta spara mycket tid¹ och kan snabbt och noggrant analysera instabilitetsfenomenet i detalj, vilket ger mer användbar information för att styra optimeringen av extraktionsprocessen.

Protocol

1. Extrahera beredning

1. Väg noggrant en lämplig mängd PE och tillsätt 10x (vikt) avjoniserat vatten för återflödesextraktion.
2. Ställ in fem prover för återloppsextraktion för 0 h (E1), 0,5 h (E2), 1 h (E3), 1,5 h (E4) och 2 h (E5) efter vägning.
3. Efter extraktion, kyl proverna till rumstemperatur och väg för att kompensera för den förlorade vikten för att säkerställa överensstämmelse med vikterna före extraktionen.
4. Centrifugera proverna vid 8,581 × g i 10 minuter för att säkerställa att olösligt material och örtrester avlägsnas från provlösningen.
5. Använd en pipett för att tillsätta 20 ml provlösning i provflaskan för att säkerställa att den tillsatta lösningen varje gång är på samma höjd.
   OBS: Undvik kontaminering, såsom fingeravtryck, på skanningsdelen av provflaskan, se till att provflaskan är ren och kontrollera om det finns synliga repor på flaskans yta. När provlösningen tillsätts ska du vara försiktig så att du inte spiller eller stänker på provflaskan och ser till att vätskenivån är på samma höjd i varje flaska.

2. Instrumentets funktion

1. Slå på MLS-detekteringsinstrumentet och värm upp det i 30 minuter.
2. Klicka på knappen Skapa fil i toppmenyn (eller klicka på Arkiv | Ny filfunktion ) för att skapa en ny testfil.
3. Klicka på knappen Visa Turbiscan Lab-temperatur i toppmenyn för att ställa in instrumentets måltemperatur till 25 °C.
   OBS: Instrumentets inställda temperatur måste vara högre än rumstemperaturen; Annars påverkas provtemperaturen av rumstemperaturen.
4. Klicka på Program Scan i toppmenyn för att öppna installationsanalysprogrammet. Lägg till programmet i listan och lägg till 5 minuter som en cykel i aktivitetsfältet, skanna i 48 timmar till analyssekvensen och ställ in balanstiden till 20 minuter. Välj detta analysprogram för alla efterföljande mätningar.
5. Flytta den förberedda provflaskan till MLS-detekteringssystemet. När du har konfigurerat programmet klickar du på Start för att starta mätningen.
   OBS: Var försiktig så att du inte skakar glasflaskan när du laddar provet. Mätningen kan endast påbörjas efter att provtemperaturen och inställningstemperaturen har balanserats.

3. Inställning av analysprogram för flera ljusspridningar

1. Efter datainsamlingen klickar du på listan med beräkningsparametrar för att ställa in de optiska parametrarna för att beräkna stabilitetsindex (SI), partikelstorlek och partikelmigrationshastighet.
2. Ställ in de optiska parametrarna enligt följande: den kontinuerliga fasljusöverföringsintensiteten (T₀) som 99,99% (vatten), det dispergerade fasbrytningsindexet (np) som 1,36 och det kontinuerliga fasbrytningsindexet (nf) som 1,33.

Representative Results

Figur 1 visar principen för multipel ljusmätning och innebörden av de insamlade resultaten. I MLS-spektraresultaten (figur 2) var abscissen provcellens höjd och ordinatet var transmissionsintensiteten (T%) och backscattering (BS%). Genom att beräkna MLS-spektraresultaten kan systemet erhålla förändringarna i provets viktigaste fysiska parametrar under mätperioden, inklusive deltaöverföringsmedelvärdet (ΔT) (figur 3A), fotonfri väg (figur 3B), SI (figur 3C) och partikelstorleken (figur 3D). Med förlängningen av mättiden fluktuerar MLS-spektra för stabila extrakt lite eller inte alls, och deras fysiska parametrar, inklusive ΔT, fotonfri väg och partikelstorlek, tenderar att vara stabila.

Typiska provinstabilitetsresultat visas i figur 2A, C-E. De spektrala resultaten av stabila prover tenderade att vara konsekventa vid alla skanningstider, som visas i figur 2B, vilket är en typisk egenskap hos stabila prover. För att ytterligare kvantifiera stabilitetsparametrarna kan SI användas för utvärdering. Det nuvarande protokollet möjliggör snabb identifiering av stabilitet under olika extraktionsmetoder baserade på SI (figur 3C) och analys av instabilitetsmekanismen. Det bör noteras att lägre SI-värden är förknippade med bättre stabilitet. Provet anses vara stabilt om SI är <10 inom skanningsperioden. Genom att jämföra SI-värdena kunde stabiliteten hos de fem proverna särskiljas exakt och de relevanta stabilitetskarakteristiska spektra kunde erhållas (figur 4). Partikelmigrationshastigheten (tabell 1) i kombination med ovanstående parameter kan ytterligare ge insikt i provets instabilitetsmekanism.

Figur 1: Analysprincip för MLS. MLS använder pulserande nära infrarött ljus som ljuskälla (våglängd: 880 nm), och två synkrona optiska detektorer detekterar överföringsljuset (T, 0 ° från den infallande strålningen, överföringssensorn) respektive backscatteringljuset (BS, 135 ° från den infallande strålningen, backscatteringdetektorn) som passerar genom provet. Ljuskällan, transmissionsljusdetektorn och backscattering-ljusdetektorn utgör mätsonden. Mätningen från botten till toppen av provcellen består av en skanning. Eventuell instabilitet i provet kommer att ha en liten inverkan på T- och BS-signalstyrkorna. Denna påverkan registreras och analyseras för att karakterisera olika instabila fenomen, inklusive flockning, stratifiering och sedimentering⁴. Genom beräkning av flera skanningsresultat kan mekanismen och hastigheten för lösningssystemets instabilitet vid instabilitetsfasen analyseras noggrant och förhållandekurvan för skikttjockleken (sedimentskikt, flytande skikt och förtydligande skikt) med tiden, liksom förhållandekurvan för partikelmigrationshastigheten och partikelstorleken med tiden, kan erhållas. Förkortning: MLS = multipel ljusspridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: MLS-spektra (transmission och bakåtspridning) av PE-extrakt med olika extraktionsmetoder. (A–E) MLS-spektra för E1–E5. Från spektraldata kan man grovt dra slutsatsen att (B) E2-provet fluktuerade mindre, vilket indikerar att provet var mer stabilt, medan (A) E1 kan ha haft grumlighet på grund av den totala nedgången i överföringsljus. (C–E) E3-E5-proverna var ganska instabila och spektraldata för proverna i olika höjder var olika, vilket indikerar att stratifiering inträffade under senare period. Förkortningar: MLS = multipel ljusspridning, PE = Phyllanthus emblica L., EN = extrakt erhållet med metod N. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Resultat av analys av MLS-spektra. (A) Med tiden blir T-värdet högre och provet är mer instabilt. För E3 och E4 återgick ΔT-nivån till slut till det tidigare stadiet, vilket tyder på att aggregering och fällning inträffade i dessa extrakt. E5 förblev på en låg nivå efter grumlighet, vilket indikerar att E5 kan ha haft en stor mängd sedimentering. (B) Trenden i den fotonfria vägen kan återspegla förändringarna i provets överförda ljus. (C) Stabiliteten hos olika extrakt fluktuerade kontinuerligt över tiden, med E2 > E1 > E5 > E3 > E4 som stabilitet under lagringsperioden. (D) Dynamiska förändringar i partikelstorlek kan avslöja aggregeringen av partiklar i provet. Resultaten visar att partikelstorlekarna på alla prover förändrades avsevärt inom 8-20 timmar, med partikelstorleken på E3 och E5 som till och med överskred mätområdet. Således är detta steg avgörande för bildandet av instabila aggregat av molekyler eller partiklar i provet. På samma sätt, i det sista steget, när partiklarna började kärna och fortsätta att aggregera, observerades så småningom en minskning av partikelstorleken efter att tillräckligt många partiklar bildade stora agglomerat och fälldes ut. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Instabilitet hos PE-extrakt erhållna med olika extraktionsmetoder. Resultatet tar tid eftersom abscissen och färgen representerar intensiteten hos överfört ljus eller bakåtspritt ljus. Resultatet kan direkt återspegla den verkliga situationen med grumlighet och stratifiering av proverna vid olika tidpunkter och höjder. Kromaticitetsbandet högst upp i varje resultat representerar ljusintensitetsvärdena som motsvarar olika färger, där den blå delen representerar T% och den bruna delen representerar BS%. (A) T% av E1 började minska efter 16 timmar, vilket indikerar att provet var grumligt och hela processen inte delaminerade eller fällde ut. (B) T% av E2 var konsekvent under hela mätperioden, vilket indikerar att provet var stabilt. (C) E3 var grumlig vid 16 timmar, och dess BS% ökade plötsligt vid 20 timmar, vilket indikerar att partiklarna i provet samlades, stratifierades och fälldes ut i det ögonblicket. (D) Resultatet här liknar det i (C). (E) E5 upplevde allvarlig delaminering efter 20 timmar, som varade till slutet av mätningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Mätning	Beräkningszon	Migreringshastighet (mm/h)
E1	0-24 timmar	1.56
E2	0-24 timmar	0.005
E3	0-24 timmar	1.476
E4	0-19 h	2.732
E5	0-24 timmar	1.377

Tabell 1: Resultat av partikelmigration. I resultaten kan partikelmigrationshastigheten betraktas som partikelfällningshastigheten, vilket till viss del kan återspegla provets stabilitet. Högre migrationstakt tyder på sämre stabilitet. Av resultaten framgår att migreringshastigheten rankades som E4 > E1 > E3 > E5 > E2, och denna ordning skiljer sig något från resultaten för stabilitetsindex, SI. Detta beror på att detta resultat återspeglar den genomsnittliga migrationshastigheten för partiklar i provet under mätperioden snarare än partikelmigrationshastigheten under provets snabba utfällning.

Discussion

Den snabba och noggranna bedömningen av TCM-stabilitet har alltid varit i fokus för TCM-forskning. För att ge mer användbar information för att styra förbättringen av extraktionsprocessen analyserade denna studie stabilitets- och instabilitetsmekanismerna hos ett prov med hjälp av en nära infraröd icke-destruktiv teknik.

I detta protokoll beräknas de viktiga stabilitetsparametrarna baserat på exakta MLS-skanningsdata. MLS-skanningar kan samla in överföringen (T%) och backscattering (BS%) av provet i realtid och beräkna stabilitetsindex (SI), partikelstorlek, partikelmigrationshastighet och andra viktiga fysiska parametrar. Beräkningsformeln ges av ekvation (1)⁴:

TSD = (1)

där x i är genomsnittlig överföring för varje minuts mätning, x T är medelvärdet x _i, x _T = (x ₁ + x ₂ + ... x i + x_i +_{1 ... +} x n) / n och n är antalet skanningar. SI är en viktig parameter som återspeglar provets stabilitet, och en ökning av SI-värdet indikerar en minskning av stabiliteten. SI innehåller alla mätdata för beräkning, vilket innebär att den kan användas för att förutsäga och utvärdera provernas stabilitet på kort sikt.

Beräkningen av partikelstorleken baseras på Beer-Lambert-lagen. Beräkningsformeln ges av ekvation (2):

T(l,ri) = T₀, l(d,φ) = (2)

där ri är cellens innerdiameter och T₀ är transmissionsljusintensiteten för den kontinuerliga fasen. Enligt den uppmätta transmissionsljusintensiteten (T), partikelvolymfraktionen (φ) och de inställda parametrarna kan partikelstorleken beräknas.

Sedimenteringshastigheten beräknas med ekvation (3):

(3)

V är partikelmigrationshastigheten (ms−1), ρ _c är den kontinuerliga fasdensiteten (kgm−3), ρ _p är partikeldensiteten (kgm−3), g är gravitationskonstanten (9,81 ms⁻²), d är den genomsnittliga partikeldiametern (μm), v är den kontinuerliga fasviskositeten (cP) och är volymprocenten.

Vid extraktion med värme hydrolyseras ett stort antal hydrolyserbara tanniner i PE, vilket frigör den olösliga aglykonellagiginsyran. Eftersom ellaginsyra är en plan icke-polär molekylär molekyl, genomgår den intermolekylär aggregering och utfällning på grund av hydrofoba interaktioner, och detta är den främsta orsaken till utfällning i lösningen¹. Med förlängningen av extraktionstiden bildas mer ellaginsyra, vilket resulterar i dålig stabilitet hos provet och klarningstiden för motsvarande prov förkortas. Detta återspeglas väl i resultaten i figur 4.

Baserat på ovanstående beräkningsresultat kan man dra slutsatsen att utfällningen orsakad av aggregering av komponenter eller partiklar, vilket är uppenbart i E3-E5-proverna, är huvudkällan till instabilitetsmekanismen för PE-extraktionslösningen. På grund av polysackariderna upplösta under extraktionsprocessen var E2 relativt stabil eftersom utfällningsprocessen hindrades av dess höga viskositet¹⁰. Men när extraktionsperioden förlängdes producerades stora mängder olösliga komponenter såsom ellaginsyra, vilket gjorde det svårt att upprätthålla steady state. Sammantaget började den accelererade instabiliteten vid ~ 12 timmar, och extraktionstiden hade en negativ korrelation med stabilitet, vilket var avgörande för processoptimering.

Betydelsen av MLS-metoden med avseende på befintliga metoder är följande. För det första är mätresultaten mer exakta och autentiska eftersom metoden är enkel att använda, kräver ingen provförbehandling och mätningarna kan göras utan att röra provet. Även prover med höga koncentrationer behöver ingen utspädning. För det andra har MLS hög känslighet. De förändrade hastigheterna baserade på partikelkoncentration och storlek kan detekteras i början av förändringen i partiklarna dispergerade i vätskepreparatet. Således, jämfört med visuell observation, är MLS ~ 200 gånger mer tidseffektiv.

Eftersom temperaturförändringar kan påverka systemets spridda ljusintensitet bör det betonas att provtemperaturen bör hållas konstant efter installationen, vilket kräver en jämviktstid. Dessutom måste störande element (t.ex. rester av medicinskt material) avlägsnas för att extraktets stabilitet ska kunna bedömas på lämpligt sätt. Slutligen är det viktigt att noggrant mäta de fysiska egenskaperna före testning för att exakt bestämma de fysiska parametrarna, såsom partikelstorlek och fotonfri väg.

Det finns flera begränsningar för detta tillvägagångssätt. Till exempel orsakar oxidation från långvarig lagring plötsliga färgförändringar i extraktionslösningen, vilket kan påverka fällningsbedömningen och aggregeringsbeteendet. Det kan vara svårt att garantera konsistensen hos vissa prover när parallella prover krävs, eftersom flera prover inte kan mätas samtidigt. Den utrustningsinvestering som krävs för denna teknik är relativt dyr, vilket är det främsta hindret för dess tillämpning och marknadsföring.

I framtiden är vi övertygade om att denna metod kommer att ge enastående bidrag inom läkemedelsområdet, särskilt vid utvärdering av dispersion och in vitro-upplösning. Det kan användas för att studera nya läkemedelsleveranssystem såsom liposomer, nanopartiklar och in situ-geler, och på grund av dess fördelar med att vara effektivare, snabbare, enkla och omfattande kan denna metod avsevärt förkorta forskningscykeln^11,12. Dessutom kan en stabilitetsprediktionsmodell baserad på en stor mängd data om läkemedelsinstabilitet realiseras. Denna teknik skulle kunna kombineras och förbättras med andra detektionstekniker i framtiden, vilket kan bidra till läkemedelsforskning och utveckling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable electric heating jacket	Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd	MH-1000	www.keweiyq.com
Analytical balance(1/10000)	Sartorious, Germany	BSA224S	www.sartorius.com.cn
CNC ultrasonic instrument	Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd	KQ-500DE	www.ks-csyq.com
GL-16 high-speed centrifuge	Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd	18091403	www.sklxj.com
Phyllanthus emblica L.	Hehuachi medicinal materials market	YJL2004	Produced in Yunnan
Turbisoft Lab multiple light scattering instrument	French Formulaction Company	Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5	www.formulaction.com
UPR-II-5T ultra-pure water device	Sichuan ULUPURE  Ultrapure Technology Co., Ltd	Z16030559	www.ccdup.com