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Summary
ここでは、伝統的な漢方抽出物の安定性を評価するために、多重光散乱技術に基づく安定性評価方法を紹介します。
Abstract
伝統的な漢方薬の抽出中間体は、準備プロセスの重要な中間体であり、その安定性は最終製品の有効性と品質に重要な影響を及ぼします。しかし、既存の安定性評価法は、長時間の観察や複雑な装置(高速液体クロマトグラフィーなど)の操作が必要で、時間のかかることが多く、システムの不安定性に関するより多くの物理的情報を得ることは困難である。したがって、伝統的な中国医学のための迅速かつ正確な安定性分析技術を確立することが急務です。多重光散乱は、サンプルの性質や状態を変えたり、有機試薬を使用したりすることなく、環境にやさしい方法で伝統的な漢方薬の安定性を正確かつ迅速に評価できる最先端の分析方法です。
この研究では、複数の光散乱の正確なスキャンデータを使用して、本プロトコルは、層の厚さ、粒子の移動速度、および平均粒子サイズの経時的な変動曲線を迅速に取得しました。これにより、初期段階でシステムの不安定性を引き起こすメカニズムと重要な特性を正確に特定することができました。注目すべきは、システムの安定性を詳細に定量化することで、抽出プロセスの研究期間を大幅に短縮できることであり、これにより、さまざまな抽出プロセスが Phyllanthus emblica Lの安定性に及ぼす影響を迅速かつ正確かつ詳細に分析することもできます。
Introduction
伝統的な漢方薬(TCM)の製造において、TCM抽出中間体および関連する液体製剤の安定性は常に検査の焦点でした1。医薬品、特にポリフェノールを主要な有効成分とする医薬品の臨床効果は、重大な安定性の問題のために損なわれています2,3。サナジョン内服液とヌオディカン内服液は、この問題4の典型的な例です。したがって、効率的なツールを使用して、TCM製造プロセスにおける液体中間体の安定性を迅速かつ正確に評価および最適化する方法を学ぶことが重要です。東南アジアで広く普及している薬用植物であるフィランサスエンブリカL.(PE)は、優れた抗酸化作用5、抗炎症作用6、抗菌作用7、抗腫瘍作用8を持っていると考えられています。熱抽出手順中に、PEのタンニンは激しく変換されます9。高温の触媒作用下では、これらのタンニンは急速に加水分解して没食子酸やエラグ酸などの分子を生成し、溶解性が低いために不安定性または沈殿を引き起こします1。加速試験や遠心分離など、TCMの安定性を評価するための現在の方法は、通常、面倒であり4、関連する調製プロセスのさらなる開発を制限しています。
多重光散乱(MLS)の原理に基づき、PEF抽出物の高速安定性評価法を確立し、不安定性メカニズムを解析した。MLSは、近赤外光源のスキャンに基づく測定方法です。ソリューションシステムを変更すると、光の強度が変化します。入射光は、サンプルの粒子に吸収または透過されると散乱されます。システムは、サンプルを通過するときに透過光信号を記録します。サンプルの光透過率が低い場合、システムは後方散乱光信号を記録します。目視観察と比較して、これは多くの時間を節約でき 1、不安定現象を迅速かつ正確に詳細に分析できるため、抽出プロセスの最適化を導くためのより有用な情報を提供します。
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Protocol
1.抽出物の調製
- 適量のPEを正確に秤量し、還流抽出のために脱イオン水を10倍(重量)加えます。
- 計量後、0時間(E1)、0.5時間(E2)、1時間(E3)、1.5時間(E4)、および2時間(E5)の還流抽出用の5つのサンプルをセットします。
- 抽出後、サンプルを室温まで冷却し、失われた重量を補うために計量して、抽出前の重量との一貫性を確保します。
- サンプルを8,581 × g で10分間遠心分離し、サンプル溶液から不溶性物質とハーブ残留物を確実に除去します。
- ピペットを使用して20 mLのサンプル溶液をサンプルボトルに追加し、毎回追加する溶液が同じ高さになるようにします。
注意: サンプルボトルのスキャン部分の指紋などの汚染を避け、サンプルボトルが汚れていないことを確認し、ボトルの表面に目に見える傷がないかどうかを確認します。サンプル溶液を追加するときは、サンプルボトルにこぼれたり飛散したりしないように注意し、各ボトルの液面が同じ高さになるように注意してください。
2.機器の操作
- MLS検出装置の電源を入れ、30分間ウォームアップします。
- トップメニューの[ファイル の作成 ]ボタンをクリックします(または[ ファイル|新しいファイル 関数) を使用して、新しいテスト ファイルを作成します。
- トップメニューの タービスカンラボ温度を表示 ボタンをクリックして、機器の目標温度を25°Cに設定します。
注意: 機器の設定温度は室温より高くなければなりません。そうしないと、サンプル温度が室温の影響を受けます。 - トップメニューの[プログラムスキャン]をクリックして、セットアップ分析プログラムに入ります。プログラムをリストに追加し、タスクバーでサイクルとして5分を追加し、分析シーケンスに48時間スキャンし、バランス時間を20分に設定します。後続のすべての測定に対してこの分析プログラムを選択します。
- 準備したサンプルボトルをMLS検出システムに移動します。プログラムを設定したら、[ 開始 ]をクリックして測定を開始します。
注意: サンプルをロードするときは、ガラス瓶を振らないように注意してください。測定は、サンプル温度と設定温度のバランスが取れた後にのみ開始できます。
3. 多重光散乱解析プログラム設定
- データ収集後、計算パラメータリストをクリックして光学パラメータを設定し、安定性指数(SI)、粒子サイズ、および粒子移動速度を計算します。
- 光学パラメータを連続位相光透過強度(T0)を99.99%(水)、分散位相屈折率(np)を1.36、連続位相屈折率(nf)を1.33として設定します。
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Representative Results
図1は、多重光測定の原理と収集された結果の意味を示しています。MLSスペクトルの結果(図2)では、横軸はサンプル細胞の高さであり、縦軸は透過(T%)および後方散乱(BS%)強度でした。MLSスペクトルの結果を計算することにより、システムは、デルタ透過平均値(ΔT)(図3A)、光子自由行程(図3B)、SI(図3C)、および粒子サイズ(図3D)を含む、測定期間中のサンプルの主要な物理的パラメータの変化を取得できます).測定時間の延長により、安定抽出物のMLSスペクトルはほとんど変動しないか、まったく変動せず、ΔT、光子自由行程、粒子サイズなどの物理的パラメータは安定する傾向があります。
典型的なサンプル不安定性の結果を図2A、C-Eに示します。安定したサンプルのスペクトル結果は、安定したサンプルの典型的な特性である図2Bに示すように、すべてのスキャン時間で一貫している傾向がありました。安定性パラメータをさらに定量化するために、SIを評価に使用できます。現在のプロトコルでは、SIに基づくさまざまな抽出方法(図3C)での安定性の迅速な識別と、不安定性のメカニズムの分析が可能です。SI値が低いほど安定性が向上することに注意してください。スキャン期間内にSIが<10の場合、サンプルは安定していると見なされます。SI値を比較することで、5つのサンプルの安定性を正確に区別し、関連する安定性特性スペクトルを得ることができました(図4)。粒子移動速度(表1)と上記のパラメータを組み合わせることで、サンプルの不安定性メカニズムをさらに洞察することができます。
図1:MLSの分析原理。 MLSはパルス近赤外光を光源(波長:880nm)とし、2つの同期光検出器が試料を通過する透過光(T、入射放射線から0°、透過センサ)と後方散乱光(BS、入射放射線から135°、後方散乱検出器)をそれぞれ検出します。光源、透過光検出器、後方散乱光検出器が測定プローブを構成します。サンプルセルの下から上への測定は、1回のスキャンで構成されます。サンプルが不安定になると、 T および BS 信号強度にわずかな影響があります。この影響を記録・解析し、凝集、成層、沈降など様々な不安定現象を特徴づける4.複数のスキャン結果の計算により、不安定性の初期段階における溶液系の不安定性のメカニズムと速度を正確に分析でき、層の厚さ(堆積物層、浮遊層、清澄化層)の経時的な関係曲線、および粒子の移動速度と粒子サイズの経時的な関係曲線、 )を得ることができる。略語:MLS =多重光散乱。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なる抽出方法によるPE抽出物のMLSスペクトル(透過および後方散乱)。 (A-E)E1-E5のMLSスペクトル。スペクトルデータから、(B)E2サンプルは変動が少なく、サンプルがより安定していることを示しているのに対し、(A)E1は透過光の全体的な減少により濁りがあった可能性が大まかに推測できます。(C-E)E3-E5サンプルは非常に不安定であり、異なる高さのサンプルのスペクトルデータは異なり、層別化が後期に起こったことを示しています。略語:MLS = 多重光散乱、PE = フィランサス・エンブリカ L.、EN = N法により得られた抽出物。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MLSスペクトル解析結果 。 (A)時間の経過とともに、 T 値が高くなり、サンプルがより不安定になります。E3およびE4については,最終的にΔT 準位が前段階に戻り,これらの抽出物に凝集および沈殿が生じたことが示された。E5のΔT は濁り後も低水準にとどまり、E5が多量の沈降を起こした可能性が示唆された。(B)光子自由行程の傾向は、試料の透過光の変化を反映することができる。(C)各種抽出物の安定性は経時的に連続的に変動し,E2>E1>E5>E3>E4は保存期間中の安定性の次数であった。(D)粒子サイズの動的変化は、サンプル中の粒子の凝集を明らかにすることができます。結果は、すべてのサンプルの粒子サイズが8〜20時間以内にかなり変化し、E3およびE5の粒子サイズが測定範囲を超えていることを示しています。したがって、この段階は、サンプル中に分子または粒子の不安定な凝集体を形成するための重要な段階です。同様に、最終段階では、粒子が核形成し始めて凝集し続けると、十分な粒子が大きな凝集体を形成して沈殿した後、最終的に粒子サイズの減少が観察されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:異なる抽出方法で得られたPE抽出物の不安定性。 横軸と色は透過光または後方散乱光の強度を表すため、結果は時間がかかります。結果は、さまざまな時点と高さでのサンプルの濁度と層別化の実際の状況を直接反映できます。各結果の上部にある色度バンドは、異なる色に対応する光強度値を表し、青色の部分は T%を表し、茶色の部分は BS%を表します。(A)E1の T%は16時間後に減少し始め、サンプルが濁っており、プロセス全体が剥離または沈殿しなかったことを示しています。(B)E2の T%は測定期間を通じて一貫しており、サンプルが安定していることを示しています。(C)E3は16時間で濁り、20時間で BS%が急激に増加し、その瞬間に試料中の粒子が集まり、成層し、沈殿したことを示しています。(D)ここでの結果は(C)の結果と同様です。(E)E5は20時間後に重度の層間剥離を経験し、それは測定の終わりまで続いた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 測定 | 計算ゾーン | 移行速度 (ミリメートル/時間) |
| E1 | 0-24時 | 1.56 |
| E2 | 0-24時 | 0.005 |
| E3 | 0-24時 | 1.476 |
| E4 | 0-19時 | 2.732 |
| E5 | 0-24時 | 1.377 |
表1:粒子移動速度の結果。 結果では、粒子の移動速度は粒子の沈殿速度と見なすことができ、サンプルの安定性をある程度反映することができます。移行率が高いほど、安定性が低いことを示します。この結果から、移行率はE4>E1>E3>E5>E2にランク付けされており、この順序は安定性指数 SIの結果とは多少異なることがわかります。これは、この結果は、サンプルの急速な沈殿中の粒子移動速度ではなく、測定期間中のサンプル中の粒子の平均移動速度を反映しているためです。
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Discussion
TCMの安定性の迅速かつ正確な評価は、常にTCM研究の焦点となっています。抽出プロセスの改善を指示するためのより有用な情報を提供するために、本研究では、近赤外非破壊技術を使用してサンプルの安定性と不安定性のメカニズムを分析しました。
このプロトコルでは、重要な安定性パラメータは正確なMLSスキャンデータに基づいて計算されます。MLSスキャンは、サンプルの透過(T%)と後方散乱(BS)をリアルタイムで収集し、安定性指数(SI)、粒子サイズ、粒子移動速度、およびその他の重要な物理的パラメータを計算できます。計算式は式 (1)4 で与えられます。
TSI = 
(1)
ここで、xiは測定1分ごとの平均透過率、x Tは平均xi、x T =(x1 + x 2 + ...x i + xi +1 ... + x n)/ n、およびnはスキャンの数です。SIは試料の安定性を反映する重要なパラメータであり、SI値の上昇は安定性の低下を示す。SIには計算用のすべての測定データが含まれているため、短期間のサンプルの安定性を予測および評価するために使用できます。
粒子サイズの計算は、ランベルトベールの法則に基づいています。計算式は式 (2) で与えられます。
T(l,ri) = T0 
, l(d,φ) = 
(2)
ここで、riはセルの内径であり、T0は連続相の透過光強度である。測定された透過光強度(T)、粒子体積分率(φ)、及び設定されたパラメータに従って、粒径を算出することができる。
沈降速度は、式 (3) を使用して計算されます。
(3)
Vは粒子移動速度(ms−1)、ρcは連続相密度(kgm−3)、ρpは粒子密度(kgm−3)、gは重力定数(9.81ms−2)、dは平均粒径(μm)、vは連続相粘度(cP)、は体積百分率である。
熱による抽出の過程で、PE中の多数の加水分解性タンニンが加水分解し、不溶性アグリコンエラグ酸を放出する。エラグ酸は平面状の非極性分子であるため、疎水性相互作用により分子間凝集と沈殿を起こし、これが溶液1の沈殿の主な原因です。抽出時間の延長により、より多くのエラグ酸が形成され、サンプルの安定性が低下し、対応するサンプルの清澄化時間が短縮されます。これは、 図 4 の結果によく反映されています。
上記の計算結果に基づいて、E3-E5サンプルで明らかな成分または粒子の凝集によってもたらされる沈殿が、PE抽出溶液の不安定性メカニズムの主な原因であると結論付けることができます。抽出プロセス中に溶解した多糖類のために、E2はその高い粘度10によって沈殿プロセスが妨げられたため、比較的安定していた。しかし、抽出期間が長くなると、エラグ酸などの不溶性成分が大量に生成し、定常状態を維持することが困難でした。全体として、加速された不安定性は~12時間で始まり、抽出時間は安定性と負の相関があり、これはプロセスの最適化に不可欠でした。
既存の方法に対するMLS法の意義は以下の通りである。まず、この方法は使いやすく、サンプルの前処理を必要とせず、サンプルに触れることなく測定できるため、測定結果はより正確で本物です。高濃度のサンプルでも希釈は必要ありません。第二に、MLSは感度が高いです。粒子濃度およびサイズに基づく変化速度は、液体調製物中に分散する粒子の変化の開始時に検出することができる。したがって、目視観察と比較して、MLSは~200倍の時間効率が高くなります。
温度の変化はシステムの散乱光強度に影響を与える可能性があるため、設置後はサンプル温度を一定に保つ必要があり、平衡時間が必要であることを強調する必要があります。さらに、抽出物の安定性を適切に評価するために、干渉要素(医薬品の残留物など)を除去する必要があります。最後に、粒子サイズや光子自由行程などの物理的パラメータを正確に決定するために、試験前に物理的特性を正確に測定することが不可欠です。
この方法にはいくつかの制限があります。例えば、長期保存による酸化は、抽出溶液に急激な色の変化を引き起こし、沈殿評価および凝集挙動に影響を与える可能性があります。複数のサンプルを一度に測定できないため、並列サンプルが必要な場合、一部のサンプルの一貫性を保証するのは難しい場合があります。この技術に必要な設備投資は比較的高価であり、それがその適用と促進の主な障壁です。
今後、本法は医薬品分野、特に分散液や体外溶出の評価に大きく貢献できるものと確信しております。リポソーム、ナノ粒子、in situゲルなどの新しいドラッグデリバリーシステムの研究に利用でき、より効率的、迅速、単純、包括的であるという利点により、この方法は研究サイクルを大幅に短縮する可能性があります11,12。また、大量の服薬不安定性データに基づく安定性予測モデルも実現できる。この技術は、将来的に他の検出技術と組み合わせて強化することができ、医薬品の研究開発に貢献する可能性があります。
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Disclosures
著者は、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(81973493)からの助成金によって支援されました。漢方薬の全国学際的イノベーションチーム(ZYYCXTD-D-202209);サナジョン製薬グループ成都TCM大学生産、研究、研究共同研究プロジェクト(2019-YF04-00086-JH);四川省科学技術計画資金提供プロジェクト(2021YFN0100)。著者らは、質量分析作業における技術サポートについて、TCM成都大学中医薬薬学革新研究所に感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable electric heating jacket | Beijing Kewei Yongxing Instrument Co., Ltd | MH-1000 | www.keweiyq.com |
| Analytical balance(1/10000) | Sartorious, Germany | BSA224S | www.sartorius.com.cn |
| CNC ultrasonic instrument | Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd | KQ-500DE | www.ks-csyq.com |
| GL-16 high-speed centrifuge | Sichuan Shuke Instrument Co., Ltd | 18091403 | www.sklxj.com |
| Phyllanthus emblica L. | Hehuachi medicinal materials market | YJL2004 | Produced in Yunnan |
| Turbisoft Lab multiple light scattering instrument | French Formulaction Company | Turbisoft Lab 2.3.1.125 Fanalyser 1.3.5 | www.formulaction.com |
| UPR-II-5T ultra-pure water device | Sichuan ULUPURE Ultrapure Technology Co., Ltd | Z16030559 | www.ccdup.com |
References
- Huang, H. -Z., et al. Exploration on the approaches of diverse sedimentations in polyphenol solutions: An integrated chain of evidence based on the physical phase, chemical profile, and sediment elements. Frontiers in Pharmacology. 10, 1060 (2019).
- Ran, F., et al. High or low temperature extraction, which is more conducive to Triphala against chronic pharyngitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 140, 111787 (2021).
- Wei, X., et al. Hepatoprotective effects of different extracts from Triphala against CCl(4)-induced acute liver injury in mice. Frontiers in Pharmacology. 12, 664607 (2021).
- Huang, H. Z., et al. Study on the stability control strategy of Triphala solution based on the balance of physical stability and chemical stabilities. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 158, 247-256 (2018).
- Bhattacharya, A., Chatterjee, A., Ghosal, S., Bhattacharya, S. K. Antioxidant activity of active tannoid principles of Emblica officinalis (amla). Indian Journal of Experimental Biology. 37 (7), 676-680 (1999).
- Chao, P. C., Hsu, C. C., Yin, M. C. Anti-inflammatory and anti-coagulatory activities of caffeic acid and ellagic acid in cardiac tissue of diabetic mice. Nutrition and Metabolism. 6, 33 (2009).
- Tiwari, V., Kuhad, A., Chopra, K. Emblica officinalis corrects functional, biochemical and molecular deficits in experimental diabetic neuropathy by targeting the oxido-nitrosative stress mediated inflammatory cascade. Phytotherapy Research. 25 (10), 1527-1536 (2011).
- Baliga, M. S., Dsouza, J. J. Amla (Emblica officinalis Gaertn), a wonder berry in the treatment and prevention of cancer. European Journal of Cancer Prevention. 20 (3), 225-239 (2011).
- Rehman, H. -u, et al. Studies on the chemical constituents of Phyllanthus emblica. Natural Product Research. 21 (9), 775-781 (2007).
- Jang, Y., Koh, E. Characterisation and storage stability of aronia anthocyanins encapsulated with combinations of maltodextrin with carboxymethyl cellulose, gum Arabic, and xanthan gum. Food Chemistry. 405, 135002 (2022).
- Fu, X., et al. Novel phenylalanine-modified magnetic ferroferric oxide nanoparticles for ciprofloxacin removal from aqueous solution). Journal of Colloid and Interface Science. 632, 345-356 (2023).
- Jiang, T., Charcosset, C. Encapsulation of curcumin within oil-in-water emulsions prepared by premix membrane emulsification: Impact of droplet size and carrier oil on the chemical stability of curcumin. Food Research International. 157, 111475 (2022).
Tags
医学、第194号、 フィランサスエンブリカ L.、安定性、多重光散乱、抽出物Erratum
Formal Correction: Erratum: Using Multiple Light Scattering to Examine the Stability of Phyllanthus emblica L. Extracts Obtained with Different Extraction Methods
Posted by JoVE Editors on 08/04/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Multiple Light Scattering to Examine the Stability of Phyllanthus emblica L. Extracts Obtained with Different Extraction Methods. The Authors section was updated from:
Haozhou Huang1
Mengqi Li2
Chuanhong Luo3
Sanhu Fan4
Taigang Mo4
Li Han3
Dingkun Zhang3
Junzhi Lin5
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Sichuan Nursing Vocational College
3School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, State Key Laboratory of Characteristic Chinese Medicine Resources in Southwest China
4Sanajon Pharmaceutical Group
5TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
to
Haozhou Huang1,2
Mengqi Li3
Chuanhong Luo4
Sanhu Fan5
Taigang Mo5
Li Han4
Dingkun Zhang4
Junzhi Lin6
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3Sichuan Nursing Vocational College
4State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Sanajon Pharmaceutical Group
6TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
